Step by Step ValidationValidation o

Step by Step Validation

Validation of correct expression via Western blot

Figure 8: Western blot of different GFPs, using our own cell-free expressed expression mix and a commercial one.
After fluorescence analysis, we wanted to validate the expressed protein by performing a western blot. Of each finished cell-free expression reaction, we took 25 µl, performed a SDS-PAGE, blotted it onto a PVDF membrane and incubated it with anti-GFP antibodies. Detection was carried out with secondary HRP-labeled antibodies and ECL solution. The blot shows bands at the right height of about 30 kDa, with GFP being 28 kDa of size. This proves correct protein expression in our system. The Spy-GFP-His is slightly bigger, due to the SpyTag. As expected, no expression is visible in both negative controls. Our mix contains more lysate and therefore shows some smearing. The bands of the commercial kit are much lighter, almost invisible, correlating to its comparably weak expression level (see figure 6). The purified GFP smeared over a small range, but covers the range of our expressed proteins.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขั้นตอนการตรวจสอบการตรวจสอบนิพจน์ที่ถูกต้องผ่านทางตะวันตกน้ารูปที่ 8: น้าตะวันตกของ GFPs แตกต่างกัน ใช้ผสมฟรีเซลล์แสดงนิพจน์ของเราเองและเป็นหนึ่งเชิงพาณิชย์หลังจากวิเคราะห์เรืองแสง เราต้องการตรวจสอบโปรตีนแสดง โดยทำบล็อทตะวันตก ของปฏิกิริยาแต่ละนิพจน์เซลล์ฟรีเสร็จแล้ว เราเอา 25 µl ทำ SDS-หน้า blotted ลงในเมมเบรน PVDF และรับการแอนติบอดีต้าน GFP กกมัน ตรวจสอบได้ดำเนินการกับแอนติบอดี HRP ชื่อรองและโซลูชัน ECL น้าการแสดงวงที่ความสูงที่เหมาะสมของประมาณ 30 kDa มี GFP ถูก 28 kDa ขนาด นี้สามารถพิสูจน์การแสดงออกของโปรตีนที่ถูกต้องในระบบของเรา การสอดแนม-GFP-พระเป็นใหญ่ เนื่องจากการ SpyTag ตามที่คาดไว้ ไม่แสดงออกจะปรากฏในตัวควบคุมทั้งค่าลบ ผสมของเราประกอบด้วย lysate ของมากขึ้น และจึง แสดงทาบาง วงดนตรีของชุดพาณิชย์มีมากเกือบมองไม่ เห็น เบากำลังรวบรวมสำหรับนิพจน์ของปานอ่อนระดับ (ดูรูปที่ 6) GFP บริสุทธิ์ป้ายในช่วงขนาดเล็ก แต่ครอบคลุมช่วงของโปรตีนของเราแสดง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขั้นตอนโดยขั้นตอนการตรวจสอบ

การตรวจสอบในการแสดงออกที่ถูกต้องผ่านดวงตะวัน

รูปที่ 8:. ดวงตะวันของ GFPs ที่แตกต่างกันโดยใช้มือถือฟรีผสมการแสดงออกของเราเองแสดงและพาณิชย์
หลังจากการวิเคราะห์เรืองแสงเราต้องการที่จะตรวจสอบโปรตีนที่แสดงออกโดยการดำเนินการดวงตะวัน . ของมือถือฟรีปฏิกิริยาการแสดงออกของแต่ละคนเสร็จแล้วเราเอา 25 ไมโครลิตรดำเนินการระบบ SDS-หน้าเปื้อนลงในเมมเบรน PVDF และบ่มกับแอนติบอดีต่อต้าน GFP การตรวจสอบได้ดำเนินการกับแอนติบอดี HRP ป้ายรองและแก้ปัญหา ECL blot แสดงวงดนตรีที่มีความสูงที่เหมาะสมประมาณ 30 กิโลดาลตันกับ GFP เป็น 28 กิโลดาลตันขนาด นี้พิสูจน์ให้เห็นการแสดงออกของโปรตีนที่ถูกต้องในระบบของเรา สายลับ-GFP ของเขามีขนาดใหญ่กว่าเล็กน้อยเนื่องจาก SpyTag เป็นที่คาดหวังการแสดงออกไม่สามารถมองเห็นได้ทั้งในการควบคุมเชิงลบ ผสมของเรามี lysate เพิ่มเติมและดังนั้นจึงแสดงให้เห็นถึงการทาบาง วงดนตรีของชุดในเชิงพาณิชย์มีน้ำหนักเบามากมองไม่เห็นเกือบสัมพันธ์กับระดับการแสดงออกอ่อนแอปาน (ดูรูปที่ 6) โฆษณา GFP บริสุทธิ์ป้ายในช่วงที่มีขนาดเล็ก แต่ครอบคลุมช่วงของโปรตีนแสดงของเรา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ขั้นตอนโดยขั้นตอนการตรวจสอบการตรวจสอบความถูกต้องของการแสดงออกที่ถูกต้องผ่านทาง Western blotรูปที่ 8 : blot ตะวันตกของ gfps ต่างกันโดยใช้การสังเคราะห์ของเราเองแสดงสีหน้าผสมและเชิงพาณิชย์ .หลังจากการวิเคราะห์การเรืองแสง ที่เราต้องการ ซึ่งแสดงออกโปรตีนโดยการ blot ตะวันตก การสังเคราะห์ปฏิกิริยาการแสดงออกของแต่ละเสร็จเราเอา 25 µ L ใช้เอนไซม์ที่เปื้อนลงแผ่น PVDF บ่มด้วยแอนติบอดีต่อต้าน GFP . ตรวจสอบข้อมูลกับรอง HRP ระบุว่าแอนติบอดีการทดสอบโซลูชั่น blot แสดงวงดนตรีที่ความสูงเหมาะสม ประมาณ 30 กิโล กับ GFP ถูก 28 กิโลดาลตันของขนาด นี้พิสูจน์ให้เห็นการแสดงออกของโปรตีนที่ถูกต้องในระบบของเรา สายลับ GFP ของเขาใหญ่กว่าเล็กน้อย เนื่องจากการ spytag . อย่างที่คาดไว้ ไม่แสดงออก สามารถมองเห็นได้ทั้งในทางควบคุม ผสมของเรามี lysate มากขึ้นและดังนั้นจึงแสดงให้เห็นบางส่วนเลอะหมดเลย วงของชุดเชิงพาณิชย์จะเบามาก เกือบมองไม่เห็น สัมพันธ์กับระดับการแสดงออกของปานอ่อน ( ดูรูปที่ 6 ) และ GFP ละเลงช่วงเล็ก ๆแต่ครอบคลุมช่วงของของเรามีโปรตีน