MATERIALS AND METHODSReagentsAnti-C

MATERIALS AND METHODS

Reagents

Anti-CD235a (glycophorin-A) and CD41 (αIIb chain of αIIbβ3 integrin) monoclonal antibodies (mAb) either unlabelled or conjugated to PE were from Beckman Coulter (Villepinte, France). Phe-Pro-Arg chloromethyl ketone (PPACK) was from Haematologic Technologies (Cryopep, Montpellier, France). SPHERO Ultra Rainbow beads (1 µm) were from Spherotech (Interchim, Montluçon, France). F-XC100 (1 µm) and F-XC040 (400 nm) were from ESTAPOR (Merck Chimie SAS, Fontenay-sous-Bois, France).

Preparation of plasma samples

Blood was collected after written informed consent from 4 healthy donors who had fasted for at least 12 h. Blood was drawn in 4.5 mL BD Vacutainer® tubes containing 0.5 mL of 129 mM sodium citrate (BD, Le Pont de Claix, France). The preparation of platelet-free plasma (PFP) was started within less than 1 h after blood collection and consisted of 2 consecutive cycles of centrifugation at 2,500 g for 15 min (27).

High-speed centrifugation of PFP samples

Fresh PFP (1.5 mL) was mixed with 3 mL HEPES-buffered saline (HBS) containing 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl and 2 mM NaN3 as a preservative. The mixture was centrifuged at 100,000 g for 1 h at 20°C with a low brake in a Beckman Coulter Optima Max-E ultracentrifuge using a MLS 50 rotor and polyallomer tubes. After centrifugation, 3.8 mL of supernatant were discarded and the pellet, which is not visible, was homogenized at least 10 times by gentle pipetting with a 200-µL pipette. The volume of the pelleted suspension was then adjusted to 1.5 mL with HBS containing 0.1% BSA and 10 µM PPACK as anticoagulant (28) (HBS-BSA). This resuspended pellet is referred to hereafter as 100k-PFP.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการสารรีเอเจนต์ต่อต้าน-CD235a (glycophorin A) และ CD41 (αIIb โซ่ของ αIIbβ3 integrin monoclonal แอนติบอดี (มาบ) ปจะ หรือผันการ PE จาก Beckman Coulter (Villepinte ฝรั่งเศส) ได้ Chloromethyl เพ-Pro-อาร์กิวเมนต์ของค่าคีโตน (PPACK) ที่ได้จากเทคโนโลยี Haematologic (Cryopep มงแปลีเย ประเทศฝรั่งเศส) เรนโบว์ Ultra SPHERO ลูกปัด (1 µm) ได้จาก Spherotech (Interchim, Montluçon ฝรั่งเศส) F XC100 (1 µm) และ F-XC040 (400 นาโนเมตร) จาก ESTAPOR (Merck Chimie SAS, Fontenay-sous-Bois ฝรั่งเศส)เตรียมตัวอย่างพลาสม่าเลือดเก็บรวบรวมหลังจากที่ยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 4 ที่ก็อดสำหรับน้อย 12 h. เลือดมาในท่อ BD Vacutainer® 4.5 mL ที่ประกอบด้วย 0.5 mL ของ 129 มม.โซเดียมซิเตรต (BD, Le Pont de Claix ฝรั่งเศส) จัดฟรีเกล็ดเลือดพลาสมา (PFP) ได้เริ่มต้นภายในน้อยกว่า 1 ชั่วโมงหลังเลือด และประกอบด้วย 2 รอบติดต่อกันของหมุนเหวี่ยงที่ 2,500 กรัม 15 นาที (27)หมุนเหวี่ยงที่ความเร็วสูงอย่างพีเอฟพีพีเอฟพีสด (1.5 mL) ถูกผสมกับ 3 mL HEPES บัฟเฟอร์น้ำเกลือ (ดังนั้น) ที่มี 10 มม. HEPES pH 7.4, NaCl 150 มม.และ 2 มม. NaN3 เป็นสารกันบูด ส่วนผสมเป็นผลิตภัณฑ์ที่ 100,000 g สำหรับ h 1 ที่ 20° C มีดิสก์เบรกต่ำใน ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E ที่ใช้ใน MLS 50 ท่อใบพัดและ polyallomer หลังจากหมุนเหวี่ยง 3.8 mL ของ supernatant ถูกละทิ้ง และเม็ด ซึ่งมองไม่เห็น แก้ไข homogenized น้อย 10 ครั้ง โดยปิเปตอ่อนโยนกับเปต 200 µL ปริมาตรของระบบกันสะเทือนสัตว์ถูกปรับปรุงแล้วถึง 1.5 mL ด้วยดังนั้นที่ประกอบด้วยบีเอสเอ 0.1% และ 10 µM PPACK เป็นสารกันเลือดแข็ง (28) (ดังนั้นบีเอสเอ) เม็ดนี้ resuspended จะเรียกไปต่อจากนี้เป็น 100k-PFP

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธี

การวิเคราะห์สาร

ต่อต้าน CD235a (glycophorin-A) และ CD41 (โซ่αIIbของαIIbβ3 integrin) โคลนอลแอนติบอดี (mAb) อย่างใดอย่างหนึ่งไม่ติดฉลากหรือผันไป PE จาก Beckman Coulter (Villepinte ฝรั่งเศส) เพ-PRO-Arg chloromethyl คีโตน (PPACK) จาก Haematologic Technologies (Cryopep, Montpellier, ฝรั่งเศส) Sphero อัลตร้าลูกปัดสีรุ้ง (1 ไมครอน) จาก Spherotech (Interchim, Montluçonฝรั่งเศส) F-XC100 (1 ไมครอน) และ F-XC040 (400 นาโนเมตร) จาก ESTAPOR (เมอร์ค Chimie SAS, Fontenay-sous-Bois ฝรั่งเศส).

การจัดทำตัวอย่างพลาสมา

เก็บตัวอย่างเลือดหลังจากเขียนความยินยอมจาก 4 ผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีที่ได้อดอาหาร เป็นเวลาอย่างน้อย 12 ชั่วโมง เลือดวาดในหลอด 4.5 มล BD Vacutainer®มี 0.5 มล 129 มิลลิโซเดียมซิเตรต (BD, Le Pont de เคลซ์, ฝรั่งเศส) ในการจัดทำพลาสม่าของเกล็ดเลือดที่ฟรี (PFP) เริ่มต้นภายในน้อยกว่า 1 ชั่วโมงหลังจากเก็บเลือดและมี 2 รอบติดต่อกันของการหมุนเหวี่ยงที่ 2,500 กรัมเป็นเวลา 15 นาที (27).

การหมุนเหวี่ยงความเร็วสูงของกลุ่มตัวอย่าง PFP

สด PFP (1.5 มิลลิลิตร ) ผสมกับน้ำเกลือ 3 มล HEPES บัฟเฟอร์ (HBS) ที่มีขนาด 10 mM HEPES ค่า pH 7.4 150 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์และ 2 mm NaN3 เป็นสารกันบูด ส่วนผสมที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 100,000 กรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 20 ° C กับเบรกต่ำใน ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E ใช้ MLS 50 ใบพัดและท่อ polyallomer หลังจากปั่น 3.8 มิลลิลิตรใสถูกยกเลิกและเม็ดซึ่งไม่สามารถมองเห็นได้หดหายอย่างน้อย 10 ครั้งโดยปิเปตอ่อนโยนกับปิเปต 200 ไมโครลิตร ปริมาณของการระงับเม็ดที่ถูกปรับแล้ว 1.5 มิลลิลิตร HBS มี BSA 0.1% และ 10 ไมครอน PPACK เป็นสารกันเลือดแข็ง (28) (HBS-BSA) นี้เม็ด resuspended จะเรียกว่าต่อจากนี้เป็น 100k-PFP