Real-time PCR was performed using T

Real-time PCR was performed using TaqMan chemistry
and hydrolysis probes. Two separate reactions were performed: 1) a screening reaction for the detection of all
Plasmodium species, and 2) a specific reaction for the
detection of P. knowlesi. Both reactions use the same
primers (Plasmo 1 and 2), but distinct probes (Plasprobe
and Pk probe), were utilised for screening and P. knowlesi identification, respectively. DNA sequences for the
primers Plasmo 1 and 2 and the Plasmodium screening
probe, Plasprobe, were reported previously [30]. The
sequence of the probe specific for P. knowlesi, Pk probe,
is the following: 5’-CTCTCCGGAGATTAGAACTCTTAGATTGCT-3’. Both Plasprobe and Pk probe were
labelled with the fluorophore FAM on the 5’ end with a
black hole quencher BHQ-1 on the 3’ end. Primers were
synthesized by Integrated DNA Technologies (Iowa,
USA) and probes by Biosearch Technologies, Inc.
(Novato, CA, USA). The real-time PCR reaction consisted of 200 nM of each primer, 80 nM of probe, 12.5
μL TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems,
USA), and 5 μL of DNA in a 25 μL volume. Reactions
were performed on the Mastercycler® ep realplex plaform (Eppendorf, Germany) at the University Malaysia
Sarawak, and on the ABI 7500 platform (Applied Biosystems, USA) at the Provincial Laboratory for Public
Health in Canada, with the following cycling conditions:
50°C for 2 min, initial denaturation at 95°C for 10 min,
and 45 cycles of 95°C for 15 sec and 60°C for 1 min.Fluorescence data was collected during the annealing/
extension step at 60°C. Cycle threshold (Ct) values were
analysed either by setting the threshold 10 times the
standard deviation above the noise of baseline or adjusting the standard curve to optimum. The baseline was
determined manually between cycles 3 and 15.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทำ PCR แบบเรียลไทม์โดยใช้เคมี TaqManและไฮโตรไลซ์ probes ดำเนินปฏิกิริยาแยก 2: 1) ปฏิกิริยาตรวจตรวจทั้งหมดชนิดพลาสโมเดียม และ 2) เป็นปฏิกิริยาเฉพาะสำหรับการตรวจพบ P. knowlesi ปฏิกิริยาทั้งสองใช้เหมือนกันไพรเมอร์ (Plasmo 1 และ 2), แต่ว่าคลิปปากตะเข้ (Plasprobeและโพรบ Pk), ถูกใช้สำหรับคัดกรอง และ รหัส P. knowlesi ตามลำดับ ลำดับดีเอ็นเอสำหรับการไพรเมอร์ Plasmo 1 และ 2 และคัดกรองพลาสโมเดียมโพรบ Plasprobe มีรายงานก่อนหน้านี้ [30] ที่ลำดับของโพรบเฉพาะสำหรับ P. knowlesi โพรบ Pkคือต่อไปนี้: 5'-CTCTCCGGAGATTAGAACTCTTAGATTGCT-3' มีโพรบ Plasprobe และ Pkมัน มี fluorophore FAM บนปลาย 5' กับการquencher หลุมดำ BHQ 1 ใน 3 ไพรเมอร์ได้สังเคราะห์ โดยดีเอ็นเอเทคโนโลยี (รัฐไอโอวาสหรัฐอเมริกา) และ probes โดย Biosearch เทคโนโลยี inc(Novato, CA สหรัฐอเมริกา) ประกอบด้วยปฏิกิริยา PCR แบบเรียลไทม์ 200 nM แต่ละพื้น 80 nM ของโพรบ 12.5ΜL TaqMan หลักสากลผสม (Biosystems ใช้สหรัฐอเมริกา), และ μL 5 ของดีเอ็นเอในปริมาณ 25 μL ปฏิกิริยาได้ดำเนินการในการ Mastercycler ® ep realplex plaform (Eppendorf เยอรมนี) ที่มาเลเซียมหาวิทยาลัยซาราวัค และ บนแพลตฟอร์ม ABI 7500 (ใช้ Biosystems สหรัฐอเมริกา) ที่ห้องปฏิบัติการส่วนภูมิภาคสำหรับประชาชนสุขภาพในแคนาดา พร้อมขี่สภาพ:50° C สำหรับ 2 นาที denaturation เริ่มต้นที่ 95° C สำหรับ 10 นาทีและรอบ 45 95 องศาเซลเซียส 15 วินาที และ 60° C ใน 1 นาทีFluorescence ข้อมูลถูกรวบรวมในระหว่างการอบเหนียว /ขั้นตอนการขยายที่ 60 องศาเซลเซียส ค่าขีดจำกัด (Ct) ของวงจรได้analysed อย่างใดอย่างหนึ่ง โดยการตั้งค่าขีดจำกัด 10 ครั้งส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานเหนือเสียงพื้นฐานหรือการปรับเส้นโค้งมาตรฐานให้เหมาะสม มีหลักการกำหนดด้วยตนเองระหว่างรอบ 3 และ 15

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เวลาจริงโดยการใช้
เคมี taqman ย่อยเครื่องมือตรวจสอบ ปฏิกิริยาการแยกเป็น 2 : 1 ) การคัดกรองปฏิกิริยาการตรวจหาชนิดพลาสโมเดียมทั้งหมด
2 ) ปฏิกิริยาที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ
ตรวจจับหน้า knowlesi . ทั้งปฏิกิริยาที่ใช้ชนิดเดียวกัน
( plasmo 1 และ 2 ) แต่วัดที่แตกต่างกัน ( plasprobe
และ PK probe ) ถูกใช้ในการคัดกรอง และหน้าknowlesi ตัวตามลำดับ ดีเอ็นเอลำดับสำหรับ
ไพรเมอร์ plasmo 1 และ 2 และการคัดกรอง
Probe plasprobe มีรายงานก่อนหน้านี้ [ 30 ]
ลำดับของการสอบสวนเฉพาะสำหรับหน้า knowlesi , pk Probe
คือต่อไปนี้ : 5 ' - ctctccggagattagaactcttagattgct-3 ' ทั้ง plasprobe และ PK สอบสวนถูก
labelled กับ fluorophore FAM ที่ปลาย 5 ' กับ
หลุมดำ quencher bhq-1 บนปลาย 3 ' ชิ้นดีเอ็นเอที่สังเคราะห์จากดีเอ็นเอเทคโนโลยีแบบบูรณาการ (

) ไอโอวา สหรัฐอเมริกา ) และด้วยเทคโนโลยี biosearch )
( โนวาโต , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ปฏิกิริยา PCR แบบเรียลไทม์จำนวน 200 nm ของแต่ละคู่ , 80 nm ของโพรบ , 12.5
μผม taqman สากลต้นแบบผสม ( Applied Biosystems
, USA ) และ 5 μ L ของดีเอ็นเอใน 25 μ L ปริมาณ ปฏิกิริยา
จำนวนที่ mastercycler ® EP realplex plaform ( เพนดอร์ฟ , เยอรมนี ) ที่มหาวิทยาลัยมาเลเซีย
ซาราวักและ ABI 7500 แพลตฟอร์ม ( Applied Biosystems สหรัฐอเมริกา ) ที่ห้องปฏิบัติการจังหวัดสาธารณะ
สุขภาพในแคนาดาต่อไปนี้ด้วยจักรยานเงื่อนไข :
50 ° C เป็นเวลา 2 นาที เริ่มต้นที่ 95 องศา C ( เป็นเวลา 10 นาทีและ 45 รอบ
95 องศา C เป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 ° C เป็นเวลา 1 นาทีการรวบรวมข้อมูลในระหว่างการอบ /
ส่วนขยายขั้นตอนที่ 60 องศา รอบเกณฑ์ ( CT ) ค่าวิเคราะห์ข้อมูลโดยการค่า

10 ครั้งส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานข้างต้นเป็นเสียงพื้นฐาน หรือการปรับเส้นโค้งมาตรฐานสูงสุด พื้นฐานคือ
ตัดสินใจด้วยตนเอง ระหว่าง รอบ 3 และ 15