Cytotoxic Activity Assay. HL-60 cel

Cytotoxic Activity Assay. HL-60 cells (Riken, Tsukuba, Japan)
were cultured at 37 °C in RPMI1640 supplemented with 10% heatinactivated
fetal bovine serum (FBS) (Sigma Chemical Corp., St.
Louis, MO, USA), under a humidified 5% CO2 atmosphere. Human
oral squamous cell carcinoma cell lines (HSC-2, HSC-3, HSC-4) (kindly provided by Professor Nagumo, Showa University, Japan)
were cultured in Dulbecco’s modified Eagle medium (Gibco BRL,
Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% heat-inactivated
FBS. Normal human oral cells, HGF, HPC, and HPLF were prepared
from periodontal tissues, as previously reported,24 and used at 8−15
population doubling levels. The cells (other than HL-60) were
inoculated at 5 × 103 cells/well in 96-microwell plates (Becton
Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) unless otherwise stated. After 48
h, the medium was removed by suction with an aspirator and replaced
with 0.1 mL of fresh medium containing different test compound
concentrations. Each test compound was dissolved in DMSO at a
concentration of 20 mM. The first well contained 100 μM of the test
compound and was sequentially diluted 2-fold, with three replicate
wells for each concentration. The cells were incubated for an
additional 48 h, and the relative viable cell number was determined
by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
(MTT) method. In brief, the cells were washed with phosphatebuffered
saline without calcium and magnesium, which was replaced
with fresh culture medium containing 0.2 mg/mL MTT, and the cells
were incubated for another 4 h. The cells were lysed with 0.1 mL of
DMSO, and the absorbance of the cell lysate at 540 nm (A540) was
determined using a microplate reader (Biochromatic Labsystem,
Helsinki, Finland).26 The A540 of the control cells was usually in the
range from 0.40 to 0.90. The HL-60 cells were inoculated at 3.0 × 104
cells/0.1 mL in 96-microwell plates, and different concentrations of
test compounds were added. After a 48 h incubation, the viable cell
number was determined with a hemocytometer under a light
microscope after trypan blue staining. The CC50 was determined
from the dose−response curve

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กิจกรรม cytotoxic วิเคราะห์ HL-60 เซลล์ (อาทิ อวกาศสึกุบะ ญี่ปุ่น)มีอ่างที่ 37 ° C ใน RPMI1640 เสริม ด้วย heatinactivated 10%เซรั่มวัวและทารกในครรภ์ (FBS) (corp.เคมีซิก เซนต์Louis, MO สหรัฐอเมริกา), ภายใต้บรรยากาศ 5% CO2 humidified มนุษย์ปาก carcinoma เซลล์ squamous เซลล์บรรทัด (มงเปอ 2 มงเปอ-3, 4 มงเปอ) (กรุณาโดยศาสตราจารย์ Nagumo มหาวิทยาลัยโช ญี่ปุ่น)มีอ่างในดุลเบกโกของแก้ไขอีเกิ้ล (Gibco BRLเกาะแกรนด์ NY, USA) เสริม ด้วยความร้อนยกเลิก 10%FBS เตรียมเซลล์ปากมนุษย์ปกติ HGF, HPC และ HPLFจากโรคเหงือกเนื้อเยื่อ ก่อนหน้านี้เป็น รายงาน 24 และใช้ 8−15ประชากรจะระดับ เซลล์ (ไม่ใช่ HL-60) ได้inoculated ที่ 5 × 103 เซลล์/ดีในแผ่น 96-microwell (Bectonดิกคินสัน แฟรงคลินทะเลสาบ NJ สหรัฐอเมริกา) เว้นแต่จะระบุเป็นอย่างอื่น หลังจาก 48h สื่อที่ถูกเอาออก โดยดูดกับ aspirator เป็น และแทนด้วย 0.1 mL ของสดกลางประกอบด้วยต่าง ๆ ทดสอบผสมความเข้มข้น แต่ละการทดสอบสารประกอบที่ละลายใน DMSO ที่เป็นความเข้มข้น 20 มม. ครั้งแรกดีอยู่ μM 100 ของการทดสอบผสม และไม่ผสม 2-fold กับทำซ้ำสามตามลำดับบ่อสำหรับแต่ละความเข้มข้น เซลล์ถูก incubated สำหรับการกำหนดเพิ่มเติม 48 h และจำนวนเซลล์แบบสัมพัทธ์ได้โดยโบรไมด์ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium(MTT) วิธีการ สังเขป เซลล์ถูกล้าง ด้วย phosphatebufferedน้ำเกลือไม่ มีแคลเซียมและแมกนีเซียม ถูกแทนที่มีสื่อวัฒนธรรมสดประกอบด้วย 0.2 mg/mL MTT และเซลล์มี incubated สำหรับ h อีก 4 เซลล์ถูก lysed กับ 0.1 มล.ของDMSO และ absorbance ของเซลล์ lysate ที่ 540 nm (A540) ได้กำหนดใช้อ่าน microplate (Biochromatic Labsystemเฮลซิงกิ ฟินแลนด์) .26 A540 ควบคุมเซลล์เป็นปกติในการช่วงตั้งแต่ 0.40 ถึง 0.90 เซลล์ HL 60 ถูก inoculated ที่ 3.0 × 104เซลล์/0.1 mL ในแผ่น 96 microwell และความเข้มข้นต่าง ๆ ของมีเพิ่มสารทดสอบ หลังจากฟักตัว 48 h เซลล์ทำงานได้หมายเลขถูกกำหนดกับ hemocytometer ภายใต้แสงกล้องจุลทรรศน์จากการย้อมสี trypan blue กำหนด CC50จากโค้ง dose−response

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

cytotoxic กิจกรรม Assay HL-60 เซลล์ (Riken, Tsukuba ประเทศญี่ปุ่น)
มาเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสใน RPMI1640 เสริมด้วย 10% heatinactivated
ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) (Sigma เคมีคอร์ป,
เซนต์หลุยส์, MO, USA) ภายใต้ความชื้น 5% บรรยากาศ CO2 มนุษย์ในช่องปากเซลล์เซลล์มะเร็ง squamous (HSC-2, HSC-3, HSC-4) (ให้ความกรุณาโดยศาสตราจารย์ Nagumo, Showa University ประเทศญี่ปุ่น) มาเลี้ยงในอาหารนกอินทรี Dulbecco ของการปรับเปลี่ยน (Gibco BRL, เกาะแกรนด์, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) เสริมด้วย 10% การใช้งานความร้อนFBS เซลล์ปกติในช่องปากของมนุษย์ HGF, HPC และ HPLF ได้จัดทำจากเนื้อเยื่อปริทันต์ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ที่24 และนำมาใช้ใน 8-15 ของประชากรเป็นสองเท่าของระดับ เซลล์ (นอกเหนือ HL-60) เป็นเชื้อที่ 5 × 103 เซลล์ / ดีในแผ่น 96 microwell (Becton ดิกคินสัน, แฟรงคลินเลคส์, นิวเจอร์ซีย์สหรัฐอเมริกา) เว้นแต่จะระบุไว้ หลังจาก 48 ชั่วโมงสื่อที่ถูกลบออกโดยการดูดกับเครื่องช่วยหายใจและถูกแทนที่ด้วย 0.1 มิลลิลิตรของกลางสดที่มีสารทดสอบที่แตกต่างกันมีความเข้มข้น แต่ละการทดสอบสารถูกละลายใน DMSO ที่ความเข้มข้น20 มิลลิ ดีแรกที่มีอยู่ 100 ไมครอนของการทดสอบสารและถูกเจือจางตามลำดับ2 เท่าด้วยซ้ำสามหลุมสำหรับความเข้มข้นของแต่ละคน เซลล์ที่ถูกบ่มสำหรับเพิ่มเติม 48 ชั่วโมงและจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตญาติถูกกำหนดโดย3 (4,5-dimethylthiazol-2-YL) โบรไมด์ -2,5-diphenyltetrazolium (MTT) วิธีการ ในช่วงสั้น ๆ เซลล์ถูกล้างด้วย phosphatebuffered น้ำเกลือโดยไม่มีแคลเซียมและแมกนีเซียมซึ่งถูกแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสดที่มี 0.2 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร MTT และเซลล์ถูกบ่มอีก4 ชั่วโมง เซลล์ถูก lysed 0.1 มิลลิลิตรDMSO และการดูดกลืนแสงของ lysate เซลล์ที่ 540 นาโนเมตร (A540) ได้รับการพิจารณาโดยใช้เครื่องอ่านmicroplate (Biochromatic Labsystem, เฮลซิงกิ, ฟินแลนด์) 0.26 A540 ของเซลล์ควบคุมก็มักจะอยู่ในช่วง0.40-0.90 HL-60 เซลล์ที่ถูกเชื้อ 3.0 × 104 เซลล์ / 0.1 มิลลิลิตรในแผ่น 96 microwell และความเข้มข้นแตกต่างกันของสารทดสอบที่ถูกเพิ่ม หลังจากบ่ม 48 ชั่วโมงที่เซลล์ที่มีชีวิตจำนวนถูกกำหนดด้วยhemocytometer ภายใต้แสงกล้องจุลทรรศน์หลังจากการย้อมสีTrypan สีฟ้า CC50 ถูกกำหนดจากเส้นโค้งการตอบสนองยา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ทกิจกรรมการทดสอบ hl-60 เซลล์ ( riken สึกุบะ , ญี่ปุ่น )
เพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศา C ใน rpmi1640 เสริม 10% fetal bovine serum heatinactivated
( FBS ) ( Sigma เคมี Corp . , St .
หลุยส์ โม , สหรัฐอเมริกา ) ภายใต้การ humidified 5% CO2 ในชั้นบรรยากาศ มนุษย์
ช่องปาก squamous เซลล์เซลล์ ( hsc-2 hsc-3 hsc-4 , , ) ( กรุณาให้อาจารย์ นางุโมะ , โชวะมหาวิทยาลัยญี่ปุ่น )
การเพาะเลี้ยงในดัลเบโค่นกอินทรีขนาดกลาง ( gibco BRL
, เกาะแกรนด์ , นิวยอร์ก , สหรัฐอเมริกา ) เสริมด้วย 10% ความร้อนซึ่ง
FBS มนุษย์ปกติในช่องปาก ด้วย เซลล์ได้สูงมาก และ hplf เตรียม
จากเนื้อเยื่อปริทันต์ ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ และใช้ที่ 8 − 15
ประชากรตามระดับ เซลล์ ( นอกจาก hl-60 )
หัวเชื้อ 5 × 103 เซลล์ / ดีใน 96 microwell จานเบคตอนดิกคินสัน (
,Franklin Lakes , NJ , USA ) เว้นแต่ที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น หลังจาก 48
h , ขนาดกลางถูกลบออกโดยการดูดด้วยเครื่องช่วยหายใจ และแทนที่ด้วยสด
0.1 มิลลิลิตรอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีแตกต่างกันทดสอบสาร
เข้มข้น ทดสอบแต่ละชนิดละลายใน DMSO ที่ความเข้มข้น 20 mM
. แรกบรรจุ 100 μ M ของการทดสอบ
ผสมและเจือจางถึงราว กับ 3 ทำซ้ำ
เวลส์สำหรับแต่ละความเข้มข้น เซลล์ก็บ่มเป็น
เพิ่มเติม 48 ชั่วโมง และเทียบเบอร์ได้ถูกกำหนด โดย 3 - (
-
4,5-dimethylthiazol-2-yl ) 2,5-diphenyltetrazolium โบรไมด์ ( MTT ) วิธี ในช่วงสั้น ๆ เซลล์ก็ล้างด้วย phosphatebuffered
น้ำเกลือปราศจากแคลเซียม และแมกนีเซียม ซึ่งถูกแทนที่ด้วยสด
สื่อวัฒนธรรมที่มี 0.2 mg / ml MTT และเซลล์
ถูกบ่มต่ออีก 4 ชั่วโมง เซลล์ก็ lysed 0.1 มล.
DMSO และการดูดกลืนแสงของเซลล์ lysate 540 nm ( a540 ) คือ การพิจารณาพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่าน

labsystem biochromatic , เฮลซิงกิ , ฟินแลนด์ ) 26 a540 ของเซลล์การควบคุมเป็นปกติในช่วงตั้งแต่ 0.40 ถึง 0.90
. เซลล์ hl-60 ปลูกเชื้อที่ 3.0 × 104
เซลล์ / 0.1 มิลลิลิตร ใน microwell 96 แผ่นและความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ
สารทดสอบเพิ่ม หลังจากบ่ม 48 ชั่วโมง เบอร์
ได้ถูกกำหนดด้วย hemocytometer ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสง
หลังจากไตรแพนสีฟ้า staining การ cc50 ตั้งใจ
จากปริมาณ−ตอบสนองโค้ง