In this study, we designed a MPCR p

In this study, we designed a MPCR protocol for the
simultaneous identification of Enterococcus isolates at the
genus level and detection of vancomycin resistance genes.
Moreover, the protocol was combined with a fast DNA
extraction procedure, which permitted rapid isolation of
DNA by boiling from a few colonies. The amplification of
part of the tuf gene permitted the accurate identification of
Enterococcus isolates at the genus level and the use of the
van primers allowed the detection of the vanA, vanB, vanC1
and vanC2/C3 vancomycin resistance genes. Since vanD,
vanE and vanG vancomycin resistance genotypes have only
been detected in a few strains (Perichon et al., 1997; Ostrowsky
et al., 1999; Fines et al., 1999; McKessar et al.,
2000), primers for detection of these genes were not included
in our MPCR assays.
Using this MPCR technique, we analyzed 6 well-characterized
reference strains and 46 clinical isolates, previously
identified by the Vitek Automated system, from patients
of the main hospitals of the Canary Islands. The
results are shown in Fig. 1. All enterococcal isolates gave
rise to a 112 bp PCR fragment corresponding to part of the
tuf gene, which is amplified by the Ent pair of primers. On
the contrary, this fragment was not amplified when DNA
from S. aureus ATCC 29213, S. agalactiae ATCC 13286 or
S. bovis ATCC9809 was used as negative control (Fig. 1;
lane 6, and results not shown). In fact, Ke et al. (1999) have
previously demonstrated that amplification with the Ent pair
of primers does not yield the 112 bp fragment for most of
the nonenterococcal species. Two PCR products of 112 bp
and 732 bp from amplification of the tuf gene and the vanA
gene, respectively, were observed when DNA of E. faecium
BM4147 (reference strain for vanA) was used (lane 2). The
same result was observed when DNA from the vancomycin
resistant E. faecalis UIE-478 clinical isolate was used (lane
10). When we used DNA from E. faecalis V583 (reference
strain for vanB) for PCR amplification, a band of 635 bp
corresponding to part of the vanB gene was observed together
with the 112 bp tuf fragment (lane 3). The DNA from
reference vanC1 resistant strain, i.e., E. gallinarum
BM4174, yielded an 822 bp vanC1 fragment and the 112 bp
tuf fragment (lane 1). Equal results were obtained from E.
gallinarum UIE-298 and E. gallinarum UIE-470 clinical
isolates (lanes 11 and 13). In the case of reference vanC2
resistant strain, E. casseliflavus ATCC 25788, the size of the
vanC2/C3 PCR fragment was 439 bp as expected (lane 4).
Only the 112 bp tuf fragment was amplified when using the
DNA from the glycopeptide susceptible reference strain E.
faecalis ATCC 29212 (lane 5). The same result was obtained
when DNA from other vancomycin susceptible
strains was tested: E. faecium UIE-468 (lane 7), E. faecium
UIE-218 (lane 8), E. durans UIE-226 (lane 9), E. avium
UIE-533 (lane 12) and E. faecalis UIE-196 (lane 14). The
PCR patterns obtained with the DNA from the rest of the
clinical isolates were as expected according to their phenotypes
(results not shown). The use of the boiling method for
DNA extraction offers advantages in clinical laboratories
because it is inexpensive, rapid and simple, and also avoids
phenol-chloroform extractions.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ในการศึกษานี้ เราออกแบบโพรโทคอล MPCR สำหรับการแยกรหัส Enterococcus พร้อมที่จะระดับสกุลและตรวจหายีนที่ต้านทาน vancomycinนอกจากนี้ โพรโทคอลถูกรวมกับดีเอ็นเอได้อย่างรวดเร็วกระบวนการสกัด ซึ่งสามารถแยกอย่างรวดเร็วดีเอ็นเอ โดยเดือดจากอาณานิคมกี่ ขยายของส่วนของยีน tuf ได้รับอนุญาตรหัสถูกต้องEnterococcus แยกระดับสกุลและใช้การไพรเมอร์ตู้อนุญาตตรวจวนา vanB, vanC1และยีนต้านทาน vancomycin vanC2/C3 ตั้งแต่ vanDมี vanE และวัง vancomycin ต้านทานศึกษาจีโนไทป์เท่านั้นพบในบางสายพันธุ์ (Perichon และ al., 1997 Ostrowskyร้อยเอ็ด al., 1999 สินไหม et al., 1999 McKessar et al.,2000), ไพรเมอร์ตรวจยีนเหล่านี้ไม่รวมใน assays MPCR ของเราเราใช้เทคนิคนี้ MPCR วิเคราะห์ characterized ห้อง 6สายพันธุ์อ้างอิงและ 46 คลินิกแยก ก่อนหน้านี้ระบุ โดยอัตโนมัติ Vitek ระบบ จากผู้ป่วยของโรงพยาบาลหลักของหมู่เกาะคะเนรี ที่มีแสดงผลใน Fig. 1 แยก enterococcal ทั้งหมดให้เพิ่มขึ้นถึง 112 bp PCR ส่วนที่สอดคล้องกับส่วนหนึ่งของการยีน tuf ที่ขยาย โดยคู่เอนท์ของไพรเมอร์ บนตรงกันข้าม ส่วนนี้ไม่ขยายเมื่อดีเอ็นเอจากหมอเทศข้างลาย S. ATCC 29213, S. agalactiae ATCC 13286 หรือบริษัท S. ATCC9809 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบ (Fig. 1เลน 6 และไม่แสดงผล) ในความเป็นจริง มี Ke et al. (1999)ก่อนหน้านี้ แสดงที่ขยายกับคู่เอนท์ของไพรเมอร์ไม่ผลตอบแทนส่วน bp 112 สำหรับส่วนใหญ่สายพันธ์ nonenterococcal ผลิตภัณฑ์ PCR 2 112 bpและ 732 bp จากขยายยีน tuf และวนาการยีน ตามลำดับ สุภัคเมื่อดีเอ็นเอของ E. faeciumBM4147 (ต้องใช้อ้างอิงสำหรับวนา) ถูกใช้ (เลน 2) ที่ผลลัพธ์เช่นเดียวกับที่พบเมื่อดีเอ็นเอจาก vancomycinแยกคลินิกทน E. faecalis UIE 478 ถูกใช้ (เลน10) เมื่อเราใช้ดีเอ็นเอจาก E. faecalis V583 (อ้างอิงต้องใช้สำหรับ vanB) สำหรับขยาย PCR วงของ 635 bpตรงส่วนของยีน vanB ได้สังเกตกันกับ 112 bp tuf ส่วน (เลน 3) ดีเอ็นเอจากอ้างอิงต้องใช้ vanC1 ทน เช่น E. gallinarumBM4174 ผลการส่วน vanC1 bp 822 และ 112 bpส่วน tuf (เลน 1) ผลลัพธ์เท่ากับได้รับจากอีgallinarum gallinarum UIE 298 และ E. UIE 470 คลินิกแยก (ถนนหนทาง 11 และ 13) ในกรณีที่อ้างอิง vanC2ต้องใช้ทน E. casseliflavus ATCC 25788 ขนาดของการส่วน PCR vanC2/C3 439 bp ตามคาด (เลน 4)เฉพาะ 112 bp tuf ส่วนถูกขยายเมื่อใช้การดีเอ็นเอจากสายพันธุ์อ้างอิงไวต่อ glycopeptide E.faecalis ATCC 29212 (เลน 5) ได้รับผลลัพธ์เดียวกันเมื่อดีเอ็นเอจาก vancomycin อื่นไวต่อทดสอบสายพันธุ์: E. faecium UIE-468 (เลน 7), E. faeciumUIE-218 (เลน 8), E. durans UIE-226 (เลน 9), E. aviumUIE-533 (เลน 12) และ E. faecalis UIE-196 (เลน 14) ที่รูปแบบ PCR ได้ ด้วยดีเอ็นเอจากการทางคลินิกแยกได้ตามที่คาดไว้ตามการฟี(ผลลัพธ์จากการไม่แสดง) การใช้วิธีการเดือดสกัดดีเอ็นเอมีข้อดีในห้องปฏิบัติการทางคลินิกเนื่องจากมีราคาไม่แพง อย่างรวดเร็ว และง่าย และยัง หลีกเลี่ยงคลอโรฟอร์มวางสกัด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในการศึกษาครั้งนี้เราได้รับการออกแบบโปรโตคอล MPCR
สำหรับบัตรประจำตัวพร้อมกันของEnterococcus
แยกที่ระดับประเภทและการตรวจสอบของยีนต้านทานvancomycin. นอกจากนี้โครงการได้ร่วมกับดีเอ็นเอได้อย่างรวดเร็วขั้นตอนการสกัดซึ่งได้รับอนุญาตแยกอย่างรวดเร็วของดีเอ็นเอโดยการต้มจากไม่กี่อาณานิคม ขยายของส่วนหนึ่งของยีนทียูเอฟได้รับอนุญาตบัตรประจำตัวที่ถูกต้องของEnterococcus แยกในระดับประเภทและการใช้งานของไพรเมอร์รถตู้ที่ได้รับอนุญาตการตรวจสอบของvanA ที่ vanB, vanC1 และ vanC2 / C3 vancomycin ยีนต้านทาน ตั้งแต่ Vand, ใบพัดและวัง vancomycin ยีนต้านทานได้เพียงถูกตรวจพบในสายพันธุ์ไม่กี่(Perichon et al, 1997;. Ostrowsky et al, 1999;. ค่าปรับ et al, 1999;.. McKessar, et al, 2000), ไพรเมอร์สำหรับการตรวจสอบ ของยีนเหล่านี้ไม่ได้รวมอยู่ในการตรวจMPCR เรา. การใช้เทคนิค MPCR นี้เราวิเคราะห์ 6 ดีลักษณะสายพันธุ์อ้างอิงและ46 สายพันธุ์ทางคลินิกก่อนหน้านี้ที่ระบุโดยVitek ระบบอัตโนมัติจากผู้ป่วยในโรงพยาบาลหลักของหมู่เกาะคานารี ผลที่จะแสดงในรูป 1. ไอโซเลท enterococcal ให้สูงขึ้นเพื่อส่วนPCR 112 bp ที่สอดคล้องกับการเป็นส่วนหนึ่งของยีนTUF ซึ่งจะขยายโดยคู่ Ent ไพรเมอร์ ในทางตรงกันข้ามส่วนนี้ไม่ได้ขยายเมื่อดีเอ็นเอจากเชื้อS. aureus ATCC 29213, S. agalactiae ATCC 13286 หรือเอส bovis ATCC9809 ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ (รูปที่ 1. 6 ช่องและผลไม่แสดง) ในความเป็นจริง Ke et al, (1999) ได้แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ว่ามีการขยายคู่Ent ของไพรเมอร์ไม่ได้ให้ส่วน 112 bp สำหรับส่วนมากของสายพันธุ์nonenterococcal สองผลิตภัณฑ์ PCR 112 bp และ 732 bp จากการขยายของยีน TUF และ vanA ยีนตามลำดับเมื่อพบดีเอ็นเอของเชื้อ E. faecium BM4147 (สายพันธุ์อ้างอิง vanA) ถูกนำมาใช้ (ช่องทางที่ 2) ผลเดียวกันพบว่าเมื่อดีเอ็นเอจาก vancomycin ทน E. faecalis UIE-478 แยกทางคลินิกที่ถูกนำมาใช้ (ช่อง10) เมื่อเราใช้ดีเอ็นเอจากอี faecalis V583 (อ้างอิงความเครียดสำหรับvanB) สำหรับขยาย PCR เป็นวงดนตรีของ 635 bp ที่สอดคล้องกันเพื่อเป็นส่วนหนึ่งของยีน vanB ก็สังเกตเห็นร่วมกันกับ112 bp ส่วน TUF (ช่อง 3) ดีเอ็นเอจากสายพันธุ์ที่ทน vanC1 อ้างอิงคืออี gallinarum BM4174, ผล 822 bp ส่วน vanC1 และ 112 bp ส่วน TUF (ช่องทางที่ 1) เท่ากับผลที่ได้รับจากอีgallinarum UIE-298 และ E. gallinarum UIE คลินิก-470 ไอโซเลท (ช่อง 11 และ 13) ในกรณีที่มีการอ้างอิง vanC2 สายพันธุ์ทนอี casseliflavus ATCC 25788, ขนาดของvanC2 / ชิ้นส่วน C3 PCR เป็น 439 bp ตามที่คาดไว้ (4 เลน). เฉพาะส่วน TUF 112 bp ถูกขยายเมื่อใช้ดีเอ็นเอจากglycopeptide ไวต่อ อ้างอิงสายพันธุ์อีfaecalis ATCC 29212 (ช่อง 5) ผลเหมือนกันที่ได้รับเมื่อดีเอ็นเอจากคนอื่น ๆ vancomycin ไวต่อสายพันธุ์ที่ได้รับการทดสอบ: อี faecium UIE-468 (ช่อง 7), อี faecium UIE-218 (ช่อง 8), อี Durans UIE-226 (ช่อง 9), อี avium UIE-533 (ช่อง 12) และ E. faecalis UIE-196 (ช่อง 14) รูปแบบ PCR รับกับดีเอ็นเอจากส่วนที่เหลือของที่ไอโซเลททางคลินิกที่ถูกคาดว่าจะเป็นไปตามphenotypes ของพวกเขา(ผลไม่แสดง) การใช้วิธีการต้มสำหรับการสกัดดีเอ็นเอมีข้อได้เปรียบในการทดลองทางคลินิกเพราะมันเป็นราคาไม่แพงอย่างรวดเร็วและง่ายและยังหลีกเลี่ยงการสกัดสารฟีนอลคลอโรฟอร์ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในการศึกษานี้จึงได้ออกแบบ mpcr ว่าด้วย
ตัวพร้อมกันของเอ็นเทโรค็อกคัสไอโซเลตที่
สกุลระดับและตรวจสอบยีนต้านทานได้ .
นอกจากนี้ โพรโทคอลคือรวมกับดีเอ็นเอ
รวดเร็วขั้นตอนการสกัด ซึ่งได้รับอนุญาตให้แยกอย่างรวดเร็ว
ดีเอ็นเอโดยการต้มจากไม่กี่อาณานิคม การเพิ่มปริมาณของยีนที่ได้รับอนุญาตโดย
ส่วนหนึ่งของรหัสที่ถูกต้องของ
เอ็นเทโรค็อกคัสสายพันธุ์ในระดับสกุล และใช้ไพรเมอร์
รถตู้อนุญาตการตรวจสอบของวนา vanb vanc1
, , และ vanc2 / C3 ได้ยีนต้านทาน . ตั้งแต่ vand
ใบพัด , และความต้านทานเท่านั้น
เมื่อวางได้ถูกตรวจพบในไม่กี่สายพันธุ์ ( perichon et al . , 1997 ; ostrowsky
et al . , 1999 ; ค่าปรับ et al . , 1999 ; mckessar et al . ,
2 )ไพรเมอร์ในการตรวจหายีนเหล่านี้ไม่ได้ถูกรวมอยู่ใน mpcr

) ของเรา ใช้เทคนิค mpcr นี้เราได้มา 6 ดีลักษณะ
สายพันธุ์อ้างอิงและ 46 คลินิกสายพันธุ์ก่อนหน้านี้
ระบุโดยไวเทคระบบอัตโนมัติจากผู้ป่วย
ของโรงพยาบาลหลักของ Canary Islands
ผลแสดงในรูปที่ 1 ทั้งหมด enterococcal ให้
ไอโซเลทเพิ่มขึ้นเป็น 112 BP PCR ส่วนที่สอดคล้องกับส่วนของ
ไฮยีน ซึ่งจะขยายโดยใช้คู่ไพรเมอร์ . ในทางตรงกันข้าม
ส่วนนี้ไม่ได้เมื่อพบว่า S . aureus ATCC
จากดีเอ็นเอของเชื้อ S . แลคเตีย 13286 หรือ
S . bovis atcc9809 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ ( รูปที่ 1 ;
6 เลน และผลลัพธ์ไม่แสดง ) ในความเป็นจริง , Ke et al . ( 1999 ) ได้
ก่อนหน้านี้พบว่า การสื่อสารกับใช้ไพรเมอร์คู่
ไม่ได้ผลส่วน 112 BP ส่วนใหญ่
ชนิด nonenterococcal . 2 ) ผลิตภัณฑ์ 112 BP
และ 732 BP จากแบบของบริษัทจีน และวนา
ยีนตามลำดับ พบว่าเมื่อ DNA ของ E .
bm4147 ( อ้างอิงจากความเครียดสำหรับวนา ) คือใช้ ( ซอย 2 )
ผลพบว่าเมื่อ DNA จากแวนโคมัยซิน
ทน . faecalis uie-478 clinical isolate ใช้ ( เลน
10 ) เมื่อเราใช้ดีเอ็นเอจาก E . faecalis v583 ( อ้างอิง
ความเครียดสำหรับ vanb PCR ) เพื่อขยายกลุ่ม 635 BP
สอดคล้องกับส่วนของ vanb ยีนพบด้วยกัน
กับ 112 BP โดยจำเพาะ ( ซอย 3 ) ดีเอ็นเอจาก
อ้างอิง vanc1 ทนความเครียด เช่น gallinarum
Ebm4174 พบว่ามีเศษ vanc1 822 BP และ 112 BP
โดยจำเพาะ ( ช่องที่ 1 ) ผลลัพธ์เท่ากับที่ได้จาก E .
gallinarum uie-298 และ E . gallinarum uie-470 คลินิก
ไอโซเลต ( ซอย 11 และ 13 ) ในกรณีของการอ้างอิง vanc2
ทนความเครียด เช่น casseliflavus ATCC 25788 , ขนาดของ
vanc2 / C3 PCR ส่วนคือ 439 BP ตามที่คาดไว้ ( ซอย 4 ) .
เพียง 112 BP กำไรส่วนถูกขยายเมื่อใช้ดีเอ็นเอจากเชื้อไว

faecalis และไกลโคเปปไทด์อ้างอิงเช่น 29212 ( ช่องที่ 5 ) ผลเดียวกันได้
เมื่อ DNA จากอื่น ๆได้ทดสอบสายพันธุ์อ่อนแอ
: E . จาก uie-468 ( ช่อง 7 ) , E . จาก
uie-218 ( ซอย 8 ) , E . durans uie-226 ( ช่อง 9 ) , E . avium
uie-533 ( ซอย 12 ) และ E . faecalis uie-196 ( ซอย 14 )
รูปแบบดีเอ็นเอที่ได้รับกับดีเอ็นเอจากส่วนที่เหลือของ
คลินิกสายพันธุ์เป็นตามที่คาดไว้ตามการเกิดของพวกเขา
( ผลลัพธ์ไม่แสดง ) ใช้วิธีต้ม
การสกัดดีเอ็นเอมีข้อดีในทางห้องปฏิบัติการ
เพราะมันไม่แพง อย่างรวดเร็วและง่ายและยังหลีกเลี่ยง
ฟีนอลคลอโรฟอร์มสกัด .