Total protein extraction was perfor

Total protein extraction was performed as described [8]. For immunoblot analysis, total protein extracts were separated by SDS-PAGE (acrylamide [40%] 29:1; Biorad) [18] and transferred to Protran 0.45-mm nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell) with a wet transfer cell. Membranes were blocked in phosphate-buffered saline solution containing 5% non-fat dry milk and 0.1% Tween 20 (PBS-T). For primary antibodies, dilutions in PBS-T containing 5% nonfat milk were prepared as follows: D2 (1:5000), D1 (1:5000), PsaA (1:1000), PsaD (1:1000), PsaC (1:1000), CP47 (2:1500), CP43 (1:2500), CP26 (1:3000), CP29 (1:10,000) (Agrisera), Rps12 and Rpl37 antibodies (1:10,000 dilution). Incubation was performed for 1 h at room temperature. Subsequently, the membrane was washed three times for 10 to 15 min in PBS-T containing 1 or 5% nonfat milk. For secondary antibodies, the membrane was incubated for 1 h at room temperature using goat anti-rabbit IgG (H + L), horseradish peroxidase conjugate (Agrisera) in PBS-T containing 1 or 5% nonfatmilk at a final antibody dilution of 1:5000. Membranes were incubated for 5 min in ECL Plus horseradish peroxidase substrate (GE Healthcare Bio-Sciences),

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

รวมโปรตีนสกัดทำเป็นอธิบาย [8] สำหรับการวิเคราะห์ immunoblot สารสกัดจากโปรตีนทั้งหมดถูกคั่น ด้วย SDS-หน้า (อะคริลาไมด์ [40%] คง Biorad) [18] และโอนย้ายไป Protran 0.45 มม.ไนโตรเซลลูโลสเมมเบรน (Schleicher และ Schuell) มีเซลล์เปียกโอน เยื่อหุ้มถูกบล็อกในบัฟเฟอร์ฟอสเฟตเกลือที่ประกอบด้วยนมแห้งปลอดไขมัน 5% และ 0.1% แต่ 20 (PBS T) สำหรับแอนติบอดีหลัก PBS T ที่มี 5% nonfat นมเจือจางวจัดเป็นดังนี้: D2 (1:5000), D1 (1:5000), PsaC (1: 1000) PsaD (1: 1000) PsaA (1: 1000) CP47 (2:1500), CP43 (1:2500), CP26 (1:3000), CP29 (1:10, 000) (Agrisera), Rps12 และ Rpl37 แอนติบอดี (1:10, 000 เจือจาง) ดำเนินการกกไข่สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ต่อมา เมมเบรนถูกซักสามครั้งสำหรับ 10 ถึง 15 นาทีใน PBS-T ที่มี 1 หรือ 5% nonfat นม สำหรับรองแอนติบอดี เมมเบรน incubated สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องใช้แพะป้องกันกระต่าย IgG (H + L), conjugate ฮอสดิช (Agrisera) ใน PBS-T nonfatmilk ที่มี 1 หรือ 5% ที่การเจือจางสุดท้ายแอนติบอดีของ 1:5000 เยื่อได้รับการกก 5 นาทีในพื้นผิวฮอสดิช ECL พลัส (GE สุขภาพชีวภาพวิทยาศาสตร์),

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การสกัดโปรตีนรวมได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ [8] สำหรับการวิเคราะห์ immunoblot, สารสกัดโปรตีนทั้งหมดถูกแยกออกโดยวิธี SDS-PAGE (ริลาไมด์ [40%] 29: 1; Biorad) [18] และโอนไปยังเมมเบรน Protran nitrocellulose 0.45 มิลลิเมตร (Schleicher และ Schuell) ที่มีการถ่ายโอนเซลล์เปียก เยื่อถูกบล็อกในฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือที่มี 5% นมแห้งไม่มีไขมันและ 0.1% Tween 20 (PBS-T) สำหรับแอนติบอดีหลักเจือจางในพีบีเอส-T ที่มีนมไม่มีน้ำมัน 5% ถูกจัดเตรียมดังนี้ D2 (1: 5000) D1 (1: 5000) PsaA (1: 1000), psad (1: 1000), PSAC (1 : 1000), CP47 (2: 1500) CP43 (1: 2,500) CP26 (1: 3000) CP29 (1: 10,000) (Agrisera) Rps12 และ Rpl37 แอนติบอดี (1: 10,000 เจือจาง) บ่มเพาะได้ดำเนินการเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ต่อมาเมมเบรนถูกล้างสามครั้งสำหรับ 10 ถึง 15 นาทีในพีบีเอส-T ที่มีนมไม่มีน้ำมัน 1 หรือ 5% สำหรับแอนติบอดีรองเมมเบรนถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยใช้แพะป้องกันกระต่าย IgG (H + L) มะรุม peroxidase ผัน (Agrisera) ในพีบีเอส-T มี nonfatmilk 1 หรือ 5% ที่เจือจางแอนติบอดีสุดท้ายของ 1: 5000 เยื่อถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาทีในพื้นผิวมะรุม peroxidase พลัส (GE Healthcare Bio-วิทยาศาสตร์)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดโปรตีนทั้งหมด ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ [ 8 ] สำหรับการวิเคราะห์มมูโนบล็ สารสกัดโปรตีนทั้งหมด ถูกแยกจากกันโดย SDS-PAGE ( acrylamide [ 40% ] 29:1 ; biorad ) [ 18 ] และย้ายไป protran 0.45-mm ไนโตรเซลลูโลสเมมเบรน ( ไชลเคอร์ และ schuell ) พร้อมโอน เปียก เซลล์ เยื่อที่ถูกบล็อกในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยน้ำเกลือ 5% ไม่มีไขมันนมแห้งและ 0.1% Tween 20 ( pbs-t ) สำหรับใช้ในการเจือจาง pbs-t ที่มีถึง 5 % ไขมันต่ำนมเตรียมดังนี้ : D2 ( 1:5000 ) D1 ( 1:5000 ) psaa ( 000 ) psad ( 000 ) psac ( 000 ) cp47 ( 2:1500 ) cp43 ( 1:2500 ) cp26 ( 1:3000 ) cp29 ( 1:10000 ) ( agrisera ) rps12 rpl37 , และแอนติบอดี ( 1:10000 เจือจาง ) ทำการบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง และเยื่อแผ่นล้าง 3 ครั้ง เป็นเวลา 10 ถึง 15 นาทีใน pbs-t ที่มี 1 หรือ 5 % นมไร้ไขมันนม สำหรับใช้รองเมมเบรนถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้องโดยใช้แพะ IgG anti กระต่าย ( H + L ) , พืชชนิดหนึ่ง ( peroxidase ) agrisera ) ใน pbs-t ที่มี 1 หรือ 5 % nonfatmilk ที่เจือจาง ) สุดท้ายของ 1:5000 . เยื่อแผ่นแบบบ่มเป็นเวลา 5 นาทีในการทดสอบบวกเปอร์ ( GE Healthcare . ( วิทยาศาสตร์ชีวภาพ )