2.7. HPLC-UV/DAD method validationT

2.7. HPLC-UV/DAD method validation

The validation of the HPLC-UV/DAD method was performed in

agreement with international guidelines for analytical techniques

for the quality control of pharmaceuticals (ICH guidelines).

The stock standard solution of each compound (quercetin-

3-O-rutinoside, quercetin-3-O-galactoside, 6-methoxyluteolin,

quercetin and isorhamnetin) was prepared as follows: an accu-
rately weighed amount of pure compound (1.9–2.8 mg) was

placed into a 10 mL volumetric flask; DMSO was added and the

solution was diluted to volume with the same solvent. The external

standard calibration curve was generated by using five data points,

covering the concentration ranges: 5.4–216.0 g/mL for quercetin-

3-O-rutinoside; 7.1–283.0 g/mL for quercetin-3-O-galactoside;

4.9–194.0 g/mL for 6-methoxyluteolin; 11.7–233.0 g/mL for

quercetin; 16.0–228.0 g/mL for isorhamnetin. 10 L aliquots of each standard solution were used for HPLC analysis. Injections were

performed in triplicate for each concentration level. The calibration

curve was obtained by plotting the peak area of the compound

at each level versus the concentration of the sample. The amount

of flavonoids in P. argentea extracts was determined by using the

calibration curves of the compounds with the same chromophore.

In particular, the calibration curve of quercetin-3-O-rutinoside

was used for compounds 1–3, that of quercetin-3-O-galactoside

for compounds 4–7, that of 6-methoxyluteolin for compounds 8

and 10. The quantification of compounds 9 and 11 was performed

by using their own calibration curves.

For reference compounds, the limit of detection (LOD) and the

limit of quantification (LOQ) were experimentally determined by

HPLC analysis of serial dilutions of a standard solution to reach a

signal-to-noise (S/N) ratio of 3 and 10, respectively.

The accuracy ofthe analytical procedure was evaluated by using

the recovery test. This involved the addition of a known quantity

of standard compound to half the amount of a P. argentea ethanolic

extract to reach 100% of the test concentration. The spiked samples

were then analyzed with the proposed method.

The precision of the chromatographic system was tested by per-
forming intra- and inter-day multiple injections of a P. argentea

ethanolic extract and then checking the %RSD of retention times

and peak areas. Six injections were performed each day for three

consecutive days.

The stability was assessed by using a P. argentea ethanolic

extract stored in amber glass flasks at 4 ◦C and at room temperature

(about 25 ◦C) and analyzed every 12 h for 72 h.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.7 HPLC-UV / DAD การตรวจสอบวิธีการตรวจสอบของ HPLC-UV / วิธี DAD ได้ดำเนินการในข้อตกลงกับแนวทางระหว่างประเทศสำหรับเทคนิคการวิเคราะห์สำหรับการควบคุมคุณภาพของยา (แนวทาง ICH). หุ้นสารละลายมาตรฐานของแต่ละสารประกอบ (quercetin- 3 O-rutinoside, quercetin-3-O-galactoside 6 methoxyluteolin, quercetin และ isorhamnetin) ถูกจัดทำขึ้นดังนี้แม่นยำจำนวน rately ชั่งน้ำหนักสารบริสุทธิ์ (1.9-2.8 มก.) ถูกวางลงในขวดปริมาตรมิลลิลิตร 10; DMSO ถูกเพิ่มเข้ามาและวิธีการแก้ปัญหาถูกเจือจางปริมาณที่มีตัวทำละลายเดียวกัน ภายนอกเส้นโค้งการสอบเทียบมาตรฐานถูกสร้างขึ้นโดยใช้ห้าจุดข้อมูลที่ครอบคลุมช่วงความเข้มข้น: 5.4-216.0 กรัม / มิลลิลิตรสำหรับ quercetin- 3-O-rutinoside; 7.1-283.0 กรัม / มิลลิลิตรสำหรับ quercetin-3-O-galactoside; 4.9-194.0 กรัม / มิลลิลิตรสำหรับ 6 methoxyluteolin; 11.7-233.0 กรัม / มิลลิลิตรสำหรับquercetin; 16.0-228.0 กรัม / มิลลิลิตรสำหรับ isorhamnetin 10 aliquots L ของแต่ละสารละลายมาตรฐานถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์ HPLC ฉีดได้รับการดำเนินการในการเพิ่มขึ้นสามเท่าสำหรับแต่ละระดับความเข้มข้น การสอบเทียบโค้งได้มาจากพล็อตในพื้นที่จุดสูงสุดของสารในแต่ละระดับเมื่อเทียบกับความเข้มข้นของกลุ่มตัวอย่าง จำนวนของ flavonoids ในสารสกัดจากพี argentea ถูกกำหนดโดยใช้เส้นโค้งการสอบเทียบของสารที่มี chromophore เดียวกัน. โดยเฉพาะอย่างยิ่งเส้นโค้งการสอบเทียบ quercetin-3-O-rutinoside ใช้สำหรับสารที่ 1-3 ของ quercetin- 3-O-galactoside สารประกอบ 4-7 ที่ 6 methoxyluteolin สารประกอบ 8 และ 10 ปริมาณของสารที่ 9 และ 11 ที่ได้ดำเนินการโดยใช้เส้นโค้งการสอบเทียบของตัวเอง. สำหรับสารประกอบอ้างอิงขีด จำกัด ของการตรวจสอบ (LOD) และขีด จำกัด ของปริมาณ (LOQ) ได้รับการพิจารณาการทดลองโดยการวิเคราะห์ HPLC ของเจือจางอนุกรมของการแก้ปัญหามาตรฐานในการเข้าถึงสัญญาณต่อเสียงรบกวน (S / N) อัตราส่วน 3 และ 10 ตามลำดับ. ความถูกต้อง ofthe ขั้นตอนการวิเคราะห์ที่ได้รับการประเมินโดยใช้ทดสอบการกู้คืน เรื่องนี้เกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของปริมาณที่รู้จักกันของสารมาตรฐานเพื่อให้ครึ่งหนึ่งของจำนวนของพี argentea เอทานอลสารสกัดที่จะไปถึง 100% ของความเข้มข้นของการทดสอบ กลุ่มตัวอย่างถูกแทงมาวิเคราะห์ด้วยวิธีการที่นำเสนอ. แม่นยำของระบบโครมาได้รับการทดสอบโดยทำการรับสร้าง intra- และระหว่างวันฉีดหลายพี argentea สารสกัดและจากนั้นตรวจสอบ% RSD ครั้งการเก็บรักษาและพื้นที่สูงสุด . หกฉีดได้ดำเนินการในแต่ละวันเป็นเวลาสามวันติดต่อกัน. ความมั่นคงได้รับการประเมินโดยใช้พี argentea เอทานอลสารสกัดที่เก็บไว้ในขวดแก้วสีเหลืองอำพันที่ 4 ◦Cและที่อุณหภูมิห้อง(ประมาณ 25 ◦C) และวิเคราะห์ทุก 12 ชั่วโมงเป็นเวลา 72 ชั่วโมง .

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.7 . hplc-uv / พ่อ

วิธีการตรวจสอบความถูกต้องของวิธี hplc-uv / พ่อในการปฏิบัติ

ตกลงระหว่างประเทศแนวทางเทคนิคการวิเคราะห์

สำหรับการควบคุมคุณภาพของยา ( ICH แนวทาง ) .

โซลูชั่นมาตรฐานสินค้าของแต่ละสารประกอบเควอซิติน ( -

3-o-rutinoside quercetin-3-o-galactoside 6-methoxyluteolin

, , , quercetin และ ไอโซแรมเนติน ) ได้เตรียมการดังนี้เป็น ACCU -
rately ชั่งปริมาณสารบริสุทธิ์ ( 1.9 ) 2.8 มิลลิกรัม ) คือ

ใส่เข้าไปในขวดปริมาตร 10 มิลลิลิตร ; เพิ่มและ DMSO สารละลายเจือจางปริมาณ

กับตัวทำละลาย ภายนอก

มาตรฐานรูปโค้งถูกสร้างขึ้นโดยใช้จุดห้าข้อมูล

ครอบคลุมช่วงความเข้มข้น 4.0 – 216.0 g / ml สำหรับเคอร์ -

3-o-rutinoside ; 7.1 – 283.0 g / ml quercetin-3-o-galactoside

;4.9 – 194.0 g / ml 6-methoxyluteolin ; 11.7 – 233.0 g / ml สารเคอร์ซิทิน (

; ) 228.0 g / ml สำหรับไอโซแรมเนติน . 10 ผมเฉยๆของแต่ละมาตรฐานวิธีวิเคราะห์ปริมาณซูโครส การฉีด (

) ทั้งสามใบในแต่ละระดับความเข้มข้น ค่า

โค้งได้โดยวางแผนยอดพื้นที่บริเวณ

ในแต่ละระดับเมื่อเทียบกับความเข้มข้นของตัวอย่าง จํานวน

ของ flavonoids ในหน้า argentea สกัดถูกกำหนดโดยการใช้

เส้นโค้งสอบเทียบของสารประกอบที่มีสีเดียวกันด้วย

โดยเฉพาะ รูปโค้งของ quercetin-3-o-rutinoside

ใช้สารประกอบ 1 – 3 ของ quercetin-3-o-galactoside

สำหรับสารประกอบ 4 – 7 , ของ 6-methoxyluteolin สำหรับสารประกอบ 8

10 . ส่วนปริมาณของสารประกอบที่ 9 และ 11 แสดง

โดยการใช้เส้นโค้งสอบเทียบของตัวเอง

สำหรับสารอ้างอิง ขีดจำกัดของการตรวจหา ( LOD ) และ

จำกัดปริมาณ ( loq ) มีการทดลองด้วย

เทคนิคการวิเคราะห์อนุกรมของมาตรฐาน วิธีการแก้ปัญหาการเข้าถึงสัญญาณ

( s / n ) เท่ากับ 3 และ 10 ตามลำดับ

ความถูกต้องของการวิเคราะห์กระบวนการประเมินโดยใช้

การกู้คืนแบบนี้เกี่ยวข้องกับการเพิ่มของปริมาณ

รู้จักสารมาตรฐาน ครึ่งหนึ่งของจำนวนหน้า argentea (

แยกถึง 100% ของการทดสอบความเข้มข้น จากตัวอย่าง

นำมาวิเคราะห์ด้วยวิธีที่เสนอ

ความแม่นยำของระบบ และถูกทดสอบโดยต่อ -
รูปภายในและระหว่างวันหลายฉีดหน้า argentea

สิ่งสกัดและจากนั้นตรวจสอบ % RSD ของพื้นที่กักเก็บครั้ง

และ สูงสุด หก ฉีดได้ทุกวัน

ติดต่อกัน 3 วัน

ความมั่นคงประเมินโดยใช้ ( หน้า argentea

แยกเก็บไว้ในขวดแก้วสีเหลืองอำพันที่ 4 ◦

C และที่อุณหภูมิห้อง ( ประมาณ 25 ◦ C ) และวิเคราะห์ทุก 12 ชั่วโมงเป็นเวลา 72 ชั่วโมง