2.5. Microbial community analysisPC

2.5. Microbial community analysisPCR-DGGE technology based on the 16S rRNA gene was used todetermine the main bacterial species in the microbial communitypresent in the aerobic granulation. Aerobic granulation sampleswere collected from R1 and R2 on day 85 at the end of the exper-iment by centrifugation (7000 × g for 5 min). The cell pellets werewashed twice with phosphate-buffered saline solution (137 MmNaCl, 2 Mm KH2PO4, 2.7 Mm KCl, 10 Mm Na2HPO4; pH 7.4). Totalgenomic deoxyribonucleic acid (DNA) was extracted according tothe manufacturer’s instructions using the PowerSoilTMDNA Isola-tion Kit (MO BIO Laboratories, USA).The variable V3 region of the 16S rRNA gene sequence (cor-responding to positions 341–534 of the Escherichia coli sequence)was amplified using primers of F338GC/R518 by PCR [26,27]. PCRswere performed with a PCR authorized thermocycler (Bio-Rad,USA) under conditions of an initial denaturing step of 5 min at95◦C followed by 20 cycles of denaturing (at 94◦C for 30 s), 45 sannealing and elongation (at 72◦C for 45 s), the annealing time wasdecreased 0.5◦C every second cycle from 65◦C to 55◦C followed by10 additional cycles with fixed annealing temperature at 55◦C anda final extension at 72◦C for 5 min. PCR samples were separated byDGGE on 8% (w/v) polyacrylamide gels with a 35%–60% gradientof urea-formadie denaturant. DGGE was conducted at 60◦C in 1×TAE for 7.5 h with 120 V using a Dcode system (Bio-Rad). The gelwas stained with ethidium bromide and visualized under ultravi-olet transillumination. Predominant bands were excised from theDGGE gel to determine the nucleotide sequence.The gel containing each selected band was crushed in tris-EDTAbuffer and then eluted to recover 16S rRNA fragments. The targetDNA fragments were excised and reamplified using the primer setF338/R518 without a GC clamp. Thus, a pure sample was obtainedfor the subcloning and sequencing step. Amplicons were ligatedinto pMD 19-T Vector (Takara, Japan) and transformed into com-petent cells JM109 (Takara). Sequencing was carried out using anABI Prism 3730 Sequencing System (Applied Biosystems, USA). Theobtained sequences were compared with sequences in GenBankusing the BLAST Search program.
3. Results and discussion
3.1. Formation of aerobic granules in SBARsThe seed sludge in SBARs was activated sludge collected froma full-scale, municipal wastewater treatment plant; nearly allnitrogen had been removed from the sludge. The initial MLVSSconcentration in the SBARs was 2090 mg L−1. The seed sludge wasgrayish brown and had morphology of loose and irregular flocs.The start-up strategy was designed to gradually decrease thesettling time from 20 to 10 min and thus promote granule formationwhile avoiding excess washout of biomass. Decreasing the settlingtime from 20 to 15 min on day 6 increased the EVSS concentrationfrom 135 to 246 mg L−1and decreased the MLVSS concentrationfrom over 2000 mg L−1to less than 1500 mg L−1. However, over thenext 2 days, the EVSS concentration decreased and the MLVSS con-centration stabilized. Decreasing the settling time to 10 min on day12 caused similar spikes in the EVSS concentration, followed by arapid decrease in EVSS levels 2–3 days thereafter.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5. จุลินทรีย์ชุมชน analysisPCR-DGGE เทคโนโลยีตามยีน 16S rRNA เป็น todetermine ใช้สายพันธุ์แบคทีเรียหลักใน communitypresent จุลินทรีย์ในแกรนูลเต้นแอโรบิก แกรนูลแอโรบิก sampleswere เก็บจาก R1 และ R2 ในวันที่ 85 ที่ exper-iment โดยการหมุนเหวี่ยง (7000 × g 5 นาที) เซลล์ขี้ werewashed สองครั้งกับบัฟเฟอร์ฟอสเฟตเกลือ (137 MmNaCl, 2 Mm KH2PO4, 2.7 Mm KCl, 10 Mm Na2HPO4 ค่า pH 7.4) Totalgenomic เป็นส่วนประกอบของกรด (ดีเอ็นเอถูกแยกตามคำแนะนำของผู้ผลิตที่ใช้กับ PowerSoilTMDNA ไอโซลาทางการค้าชุด (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ MO สหรัฐอเมริกา) ภูมิภาค V3 ตัวแปรของการ 16S rRNA ที่ลำดับยีน (ประกอบ ตอบตำแหน่งที่ 341 – 534 ของ Escherichia coli ลำดับ) ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ของ F338GC/R518 โดย PCR [26, 27] PCRswere ดำเนินการกับ thermocycler PCR ที่ได้รับอนุญาต (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) ภายใต้เงื่อนไขของการเป็นขั้นตอนของ at95◦C 5 นาทีตาม ด้วย 20 รอบของ denaturing denaturing แรก (ที่ 94◦C 30 s), sannealing และยืด 45 (ที่ 72◦C สำหรับ 45 s), การหลอมทุกรอบสองจาก 65◦C ไป 55◦C 0.5◦C wasdecreased เวลาตามรอบ by10 เพิ่มเติม ด้วยคงหลอมอุณหภูมิที่นามสกุลสุดท้ายอันดา 55◦C ที่ 72◦C ตัวอย่าง 5 นาที PCR ได้แยก byDGGE ใน polyacrylamide 8% (w/v) เจ มีเป็น 35%-60% gradientof ยูเรีย-formadie denaturant ดำเนินการ DGGE ที่ 60◦C ใน 1 × TAE สำหรับ 7.5 ชม.กับ 120 V ใช้ระบบ Dcode (Bio Rad) Gelwas การย้อม ด้วยโบรไมด์ ethidium ดู และใต้ transillumination ultravi olet วงเด่นถูกสรรพสามิตจากเจ theDGGE เพื่อกำหนดลำดับของนิวคลีโอไทด์ เจประกอบด้วยแต่ละแถบเลือกถูกบดทริ EDTAbuffer และ eluted แล้ว กู้คืนชิ้นส่วน 16S rRNA TargetDNA มีสรรพสามิต และ reamplified ใช้ setF338/R518 รองพื้นโดยไม่ต้องหนีบ GC ดังนั้น ตัวอย่างบริสุทธิ์เป็น obtainedfor subcloning และการจัดลำดับขั้นตอน Amplicons ได้ ligatedinto pMD 19 T เวกเตอร์ (Takara ญี่ปุ่น) และเปลี่ยนเป็นเซลล์ com petent JM109 (Takara) ลำดับดำเนินการโดยใช้ anABI ปริซึม 3730 จัดลำดับระบบ (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ สหรัฐอเมริกา) Theobtained ลำดับเปรียบเทียบกับลำดับใน GenBankusing โปรแกรมค้นหาระเบิด3. Results and discussion3.1. Formation of aerobic granules in SBARsThe seed sludge in SBARs was activated sludge collected froma full-scale, municipal wastewater treatment plant; nearly allnitrogen had been removed from the sludge. The initial MLVSSconcentration in the SBARs was 2090 mg L−1. The seed sludge wasgrayish brown and had morphology of loose and irregular flocs.The start-up strategy was designed to gradually decrease thesettling time from 20 to 10 min and thus promote granule formationwhile avoiding excess washout of biomass. Decreasing the settlingtime from 20 to 15 min on day 6 increased the EVSS concentrationfrom 135 to 246 mg L−1and decreased the MLVSS concentrationfrom over 2000 mg L−1to less than 1500 mg L−1. However, over thenext 2 days, the EVSS concentration decreased and the MLVSS con-centration stabilized. Decreasing the settling time to 10 min on day12 caused similar spikes in the EVSS concentration, followed by arapid decrease in EVSS levels 2–3 days thereafter.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 กลุ่มจุลินทรีย์เทคโนโลยี analysisPCR-DGGE อยู่บนพื้นฐานของการแสดงออกของยีน 16S rRNA ถูกใช้ todetermine สายพันธุ์แบคทีเรียหลักใน communitypresent จุลินทรีย์ในแกรนูลแอโรบิก แอโรบิก sampleswere แกรนูลที่เก็บรวบรวมจาก R1 และ R2 ในวันที่ 85 ในตอนท้ายของ exper-iment โดยการหมุนเหวี่ยง (7000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาที) เซลล์เม็ด werewashed สองครั้งด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (137 MmNaCl, 2 mm KH2PO4 2.7 มมโพแทสเซียมคลอไรด์ 10 มม Na2HPO4; ค่า pH 7.4) Totalgenomic ดีเอ็นเอ (DNA) ถูกสกัดตาม tothe คำแนะนำของผู้ผลิตโดยใช้ชุด PowerSoilTMDNA Isola-การ (MO BIO ห้องปฏิบัติการ, สหรัฐอเมริกา) ได้โดยง่ายภูมิภาค V3 ตัวแปรของยีน 16S rRNA (Cor ตอบสนองไปยังตำแหน่งที่ 341-534 ของ Escherichia coli ลำดับ) ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ของ F338GC / R518 โดยวิธี PCR [26,27] PCRswere ดำเนินการกับผู้มีอำนาจ thermocycler PCR (Bio-Rad, USA) ภายใต้เงื่อนไขของการเป็นขั้นตอนเริ่มต้นของขั้นเปลี่ยน 5 นาทีat95◦Cตามด้วย 20 รอบของ denaturing (ที่94◦C 30 s), 45 sannealing และการยืดตัว (ที่ 72 ◦C 45 s), เวลาอบอ่อน wasdecreased 0.5◦Cทุกรอบที่สองจาก65◦Cจะ55◦Cตาม by10 รอบเพิ่มเติมกับอุณหภูมิการอบคงที่ขยายสุดท้าย55◦C Anda ที่72◦Cเป็นเวลา 5 นาที ตัวอย่าง PCR ถูกแยกออก byDGGE เมื่อวันที่ 8% (w / v) เจลอะคริเลตที่มี 35% -60% gradientof denaturant ยูเรีย formadie DGGE ได้ดำเนินการที่60◦Cใน 1 × TAE 7.5 H 120 V ใช้ระบบ Dcode (Bio-Rad) gelwas ย้อมด้วย ethidium bromide และมองเห็นภายใต้ ultravi-olet transillumination วงดนตรีที่โดดเด่นถูกตัดจาก theDGGE เจลเพื่อตรวจสอบเจลเบส sequence.The มีวงดนตรีที่เลือกแต่ละคนถูกบดในทริสเรทติ้ง-EDTAbuffer แล้วชะการกู้คืนเศษ 16S rRNA targetDNA ชิ้นส่วนที่ถูกตัดและ reamplified ใช้ไพรเมอร์ setF338 / R518 โดยไม่ต้องยึด GC ดังนั้นตัวอย่างที่บริสุทธิ์เป็น obtainedfor subcloning และลำดับขั้นตอน Amplicons เป็น ligatedinto PMD 19-T เวกเตอร์ (Takara ประเทศญี่ปุ่น) และกลายเป็นดอทคอมสามารถผู้ JM109 เซลล์ (Takara) ลำดับได้ดำเนินการโดยใช้ anABI ปริซึม 3730 ลำดับระบบ (Applied Biosystems, สหรัฐอเมริกา) ลำดับ Theobtained ถูกเมื่อเทียบกับในลำดับ GenBankusing โปรแกรม BLAST ค้นหา.
3 ผลการค้นหาและการอภิปราย
3.1 การก่อตัวของเม็ดแอโรบิกใน SBARsThe ตะกอนเมล็ด SBARs ถูกกากตะกอนที่เก็บรวบรวม froma เต็มรูปแบบ, ระบบบำบัดน้ำเสียในเขตเทศบาลเมือง; เกือบ allnitrogen ได้ถูกลบออกจากกากตะกอน MLVSSconcentration เริ่มต้นในการ SBARs เป็น 2,090 มก. L-1 สีน้ำตาลเมล็ดตะกอน wasgrayish และสัณฐานวิทยาของ flocs.The กลยุทธ์เริ่มต้นขึ้นหลวมและที่ผิดปกติได้รับการออกแบบที่จะค่อยๆลดเวลา thesettling 20-10 นาทีจึงส่งเสริมเม็ด formationwhile หลีกเลี่ยงการล้มละลายส่วนที่เกินจากชีวมวล การลด settlingtime 20-15 นาทีในวันที่ 6 ที่เพิ่มขึ้น EVSS concentrationfrom 135-246 mg L-1 และลดลง concentrationfrom MLVSS กว่า 2000 mg L-1 ในน้อยกว่า 1,500 มิลลิกรัม L-1 อย่างไรก็ตามในช่วง 2 วันที่ thenext เข้มข้น EVSS ลดลงและ MLVSS Con-centration เสถียร การลดเวลาการตกตะกอน 10 นาที day12 เกิดแหลมคล้ายกันในความเข้มข้น EVSS ตามการลดลงในระดับ arapid EVSS 2-3 วันหลังจากนั้น