INTRODUCTIONPrecise genome modifica

INTRODUCTION
Precise genome modification with engineered, site-directed nucleases such as meganucleases, zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and Cas9/sgRNAs has emerged as a powerful genome-enabling tool for fundamental and applied biological research. These technologies rely on DNA double strand breaks (DSBs) generated in a targeted fashion in the genomic region of interest by the potent nucleases (1–3). DSBs stimulate cellular DNA repair mechanisms and are repaired through error-prone nonhomologous end joining (NHEJ) and/or homologous recombination (HR) in vivo, leading to site-specific genetic alterations (4–7). NHEJ has been exploited to generate mutagenic insertions/deletions in transcription
regulatory or protein-coding region of genes of interest that often result in gene inactivation. HR-associated molecules drawn to a specific DSB created by a site-specific engineered nuclease have been harnessed to allow incorporation of desired small or large genetic elements that are flanked by DNA sequences homologous to regions present on either side of the DSB. In most cases, NHEJ events are more predominant than HR in eukaryotic cells and thus are associated with the large majority of targeted genomic events (8–10). To generate a site-specific DSB in
the genomic region, meganucleases, ZFNs and TALENs were developed successively (11–15). Both customizable hybrid nucleases are composed of programmable, sequencespecific
DNA-binding modules fused with the non-specific cleavage domain of FokI nuclease. Such molecules, acting in pairs that recognize adjacent DNA sequences, have enabled precise genomic modifications in a broad range of species, including yeast, plants and animals [reviewed by (2,3)]. However, they often are effectively unavailable for routine use in many laboratories because of the time consuming and labor-intensive process needed for engineering the nucleases genes; furthermore, their sensitivity to the DNA methylation state of the target sites limits the application of those nucleases in genome-wide analysis due to the widespread existence of cytosine methylation in complex genomes (16,17).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แนะนำปรับเปลี่ยนกลุ่มแม่นยำกับ วิศวกรรม nucleases ไซต์โดยตรงเช่น meganucleases นิ้วสังกะสี nucleases (ZFNs), nucleases effector activator เหมือน transcription (TALENs) และ Cas9/sgRNAs ได้ผงาดขึ้นเป็นการเปิดกลุ่มมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการวิจัยทางชีวภาพพื้นฐาน และใช้ เทคโนโลยีเหล่านี้อาศัยดีเอ็นเอคู่สาระแบ่ง (DSBs) สร้างขึ้นในเป้าหมายในภูมิภาค genomic น่าสนใจ โดย nucleases มีศักยภาพ (1-3) DSBs กระตุ้นกลไกการซ่อมแซมดีเอ็นเอเซลล์ และซ่อมแซม โดยสิ้นสุด nonhomologous ข้อผิดพลาดเสี่ยงที่เข้าร่วม (NHEJ) และ/หรือ homologous recombination (HR) ในสัตว์ทดลอง ผู้นำการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมเฉพาะ (4-7) NHEJ ได้รับสามารถสร้างลบ mutagenic แทรกใน transcriptionกฎระเบียบ หรือโปรตีนรหัสภูมิภาคของยีนที่น่าสนใจที่มักส่งผลให้ยกเลิกการเรียกยีน มีการควบคุม HR เชื่อมโยงโมเลกุลออกไป DSB เฉพาะที่สร้างขึ้น โดย nuclease ออกแบบเฉพาะให้ประสานต้องเล็ก หรือใหญ่พันธุกรรมองค์ที่ขนาบข้าง ด้วย homologous กับภูมิภาคอยู่ด้านใดด้านหนึ่งของ DSB ลำดับดีเอ็นเอ ในกรณีส่วนใหญ่ NHEJ เหตุการณ์อยู่กันมากขึ้นกว่า HR ใน eukaryotic เซลล์ และเกี่ยวข้องกับใหญ่เหตุการณ์ genomic เป้าหมาย (8-10) สร้าง DSB เฉพาะในภูมิภาค genomic, meganucleases, ZFNs และ TALENs ได้พัฒนาติด ๆ กัน (11-15) ทั้ง nucleases ผสมเองจะประกอบด้วยโปรแกรม sequencespecificโมดูลดีเอ็นเอรวม fused กับโดเมนไม่ใช่เฉพาะปริ FokI nuclease โมเลกุลดังกล่าว ทำหน้าที่ในคู่ที่รู้จักติดลำดับดีเอ็นเอ ได้ปรับเปลี่ยน genomic แม่นยำในหลากหลายชนิด ยีสต์ พืช และสัตว์ [ตรวจทาน โดย (2,3)] อย่างไรก็ตาม มักจะไม่พร้อมใช้งานได้อย่างมีประสิทธิภาพสำหรับใช้ประจำในห้องปฏิบัติการมากเนื่องจากกระบวนการใช้เวลานาน และ labor-intensive ที่จำเป็นสำหรับวิศวกรรมยีน nucleases นอกจากนี้ ความไวของดีเอ็นเอปรับสถานะของไซต์เป้าหมายจำกัดของ nucleases เหล่านั้นในการวิเคราะห์จีโนมทั้งเนื่องจากการดำรงอยู่อย่างกว้างขวางของปรับ cytosine genomes ซับซ้อน (16,17)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บทนำ
การเปลี่ยนแปลงจีโนมที่แม่นยำด้วยวิศวกรรม nucleases เว็บไซต์กำกับเช่น meganucleases, nucleases นิ้วสังกะสี (ZFNs) Effector กระตุ้นเหมือนถอดความ nucleases (Talens) และ Cas9 / sgRNAs ได้กลายเป็นเครื่องมือที่มีจีโนมที่มีประสิทธิภาพสำหรับการเปิดใช้งานพื้นฐานและการประยุกต์ใช้การวิจัยทางชีววิทยา . เทคโนโลยีเหล่านี้พึ่งพาแบ่งสาระคู่ดีเอ็นเอ (DSBs) สร้างขึ้นในแฟชั่นที่กำหนดเป้าหมายในภูมิภาคจีโนมที่น่าสนใจโดย nucleases ที่มีศักยภาพ (1-3) DSBs กระตุ้นกลไกการซ่อมแซมดีเอ็นเอของเซลล์และมีการซ่อมแซมผ่านปลายผิดพลาดได้ง่าย nonhomologous เข้าร่วม (NHEJ) และ / หรือรวมตัวกันอีกคล้ายคลึงกัน (HR) ในร่างกายนำไปสู่เว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม (4-7) NHEJ ได้ถูกนำมาใช้ในการสร้างการแทรกการกลายพันธุ์ / ลบในการถอดความ
ภูมิภาคกฎระเบียบหรือโปรตีนการเข้ารหัสของยีนที่น่าสนใจที่มักจะส่งผลในการยับยั้งการแสดงออกของยีน โมเลกุลของบุคคลที่เกี่ยวข้องดึงไป DSB เฉพาะที่สร้างขึ้นโดยนิวิศวกรรมเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงได้รับการควบคุมเพื่อให้การรวมตัวกันขององค์ประกอบทางพันธุกรรมที่มีขนาดเล็กหรือขนาดใหญ่ที่ต้องการที่ขนาบข้างด้วยดีเอ็นเอลำดับคล้ายคลึงกับภูมิภาคอยู่บนด้านข้างของ DSB อย่างใดอย่างหนึ่ง ในกรณีส่วนใหญ่เหตุการณ์ NHEJ เด่นมากกว่าบุคคลในเซลล์ยูคาริโอจึงมีความเกี่ยวข้องกับส่วนใหญ่ของเหตุการณ์ที่กำหนดเป้าหมายจีโนม (8-10) เพื่อสร้าง DSB เว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงใน
ภูมิภาคจีโนม meganucleases, ZFNs Talens และได้รับการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง (11-15) ทั้งไฮบริดที่สามารถปรับแต่ง nucleases จะประกอบด้วยโปรแกรม sequencespecific
โมดูลดีเอ็นเอผูกพันผสมกับโดเมนแตกแยกไม่ใช่เฉพาะของนิ Foki โมเลกุลดังกล่าวทำหน้าที่ในคู่ที่รับรู้ลำดับดีเอ็นเอที่อยู่ติดกันได้เปิดใช้งานการแก้ไขจีโนมที่แม่นยำในความหลากหลายของสายพันธุ์รวมทั้งยีสต์พืชและสัตว์ [การสอบทานจาก (2,3)] แต่พวกเขามักจะไม่สามารถใช้งานได้อย่างมีประสิทธิภาพสำหรับการใช้งานประจำวันในห้องปฏิบัติการจำนวนมากเพราะใช้เวลานานและกระบวนการที่ใช้แรงงานเข้มข้นที่จำเป็นสำหรับวิศวกรรมยีน nucleases; นอกจากนี้ความไวของพวกเขาไปยังรัฐ methylation ดีเอ็นเอของเว็บไซต์เป้าหมาย จำกัด การประยุกต์ใช้ nucleases ผู้ที่อยู่ในการวิเคราะห์จีโนมทั้งเนื่องจากการดำรงอยู่อย่างกว้างขวางของ methylation cytosine ในจีโนมที่ซับซ้อน (16,17)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

บทนำ
แม่นยำกับจีโนมการออกแบบเว็บไซต์โดยตรง เช่น meganucleases nucleases nucleases , สังกะสีนิ้ว ( zfns ) ถอดความ Activator ชอบโต้ง nucleases ( talens ) และ cas9 / sgrnas ได้กลายเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพเพื่อช่วยให้กลุ่มพื้นฐานและการวิจัยทางชีวภาพใช้เทคโนโลยีเหล่านี้ต้องอาศัยดีเอ็นเอเส้นคู่แบ่ง ( dsbs ) สร้างขึ้นในแฟชั่นที่เป็นเป้าหมายในภูมิภาคอย่างน่าสนใจ โดย nucleases ต้า ( 1 – 3 ) dsbs กระตุ้นกลไกการซ่อมแซมดีเอ็นเอเซลล์ และซ่อมแซมข้อผิดพลาดที่มักจะผ่าน nonhomologous สิ้นสุดการเข้าร่วม ( nhej ) และ / หรือการเปรียบเทียบ ( HR ) โดยเฉพาะ ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม ( 4 และ 7 )nhej ได้รับการใช้ประโยชน์เพื่อสร้างผลแทรก / ลบในการถอดรหัส
กฎระเบียบหรือโปรตีนรหัสภูมิภาคของยีนที่สนใจมักจะผลในการยับยั้งยีน .HR เชื่อมโยงโมเลกุลวาดเฉพาะ DSB ที่สร้างขึ้นโดยเฉพาะวิศวกรรมนิวเคลียสได้ควบคุมการอนุญาตการขนาดเล็กหรือขนาดใหญ่ที่ต้องการองค์ประกอบทางพันธุกรรมที่ถูกขนาบข้างด้วยลำดับดีเอ็นเอความคล้ายคลึงกับภูมิภาคปัจจุบันบนด้านใดด้านหนึ่งของบ . ในกรณีส่วนใหญ่เหตุการณ์ nhej โดดกว่า HR ในยูคาริโอติกเซลล์ และดังนั้นจึงเกี่ยวข้องกับส่วนใหญ่ของเหตุการณ์ที่มีเป้าหมาย ( 8 – 10 ) การสร้างบเฉพาะในเขตที่มี meganucleases
, , และ zfns talens ถูกพัฒนาอย่างต่อเนื่อง ( 11 - 15 ) ทั้งแบบที่ปรับแต่ง nucleases ประกอบด้วยโปรแกรม sequencespecific
,ดีเอ็นเอมัดโดเมนเฉพาะโมดูลผสมกับความแตกแยกของ Foki นิวเคลียส . โมเลกุลดังกล่าว เป็นคู่ที่จำติดลำดับจีโนมดีเอ็นเอ ได้เปิดใช้งานแม่นยำปรับเปลี่ยนในหลากหลายชนิด ได้แก่ ยีสต์ พืชและสัตว์ [ ดูโดย ( 2 ) ] อย่างไรก็ตามพวกเขามักจะมีประสิทธิภาพไม่พร้อมใช้งานสำหรับใช้ในงานประจำห้องปฏิบัติการมากเพราะเวลานานและใช้แรงงานกระบวนการที่จำเป็นสำหรับวิศวกรรม nucleases ยีน นอกจากนี้ความไวของดีเอ็นเอ methylation สถานะของเป้าหมายเว็บไซต์ จำกัด การใช้ nucleases ในการวิเคราะห์ genome-wide เนื่องจากการดำรงอยู่อย่างกว้างขวางของไซโตซีนจากในจีโนมที่ซับซ้อน ( อันเป็น )