Aspergillus parasiticus mutant stra

Aspergillus parasiticus mutant strains resistant to DMIs were isolated in a high mutation frequency after UV-mutagenesis and selection on media containing flusilazole. Two different resistant phenotypes, R1 and R2, on the basis of their aflatoxigenic ability were identified. All R1 mutant strains produced aflatoxins at concentrations significantly higher (up to 3-fold) than the wild-type parent strain on yeast extract sucrose medium, whereas the majority of mutant strains (R2 phenotype) lost their aflatoxigenic ability. Real-time PCR analysis of the expression levels of the aflR gene, a pathway transcriptional regulatory gene in aflatoxin biosynthesis, showed that this gene was not expressed in R2 mutant strains tested. Study of fitness determining parameters showed that most flusilazole-resistant mutant strains had mycelial growth rate, sporulation and spore germination lower that the sensitive one. Cross-resistance studies with other fungicides showed that all R1 mutant strains were also resistant to the DMIs imazalil and tebuconazole, but retained their parental sensitivity to fungicides affecting other metabolic pathways and/or cellular processes. Contrary to the above, all R2 mutant strains exhibited a low to moderate multi-drug resistance to DMIs and to several other fungicide classes. Two different homologous genes, cyp51A and cyp51B, encoding C-14 alpha sterol demethylase (Cyp51) and an mdr gene encoding an ATP-binding cassette protein which may be involved in multidrug resistance were cloned and characterized. Sequence comparison of cyp51A gene revealed an amino acid substitution from glycine (GGG) to tryptophan (TGG) at position 54 (G54W) in two out of three of R1 mutant strains. Analysis of deduced amino acid sequence of cyp51B showed that no mutations were associated with DMI resistance. Study for the transcriptional levels of cyp51A showed that this gene was over-expressed in the third aflatoxigenic mutant strain. Neither amino acid substitutions nor an overexpression of the cyp51A gene were found in the R2 mutant strains tested. Real-time PCR analysis showed high levels (up to 25-fold higher) of the mdr transcript in all R2 mutant strains tested. This is the first report describing the existence of two cyp51 genes and a potential mdr gene coding for an ATP binding cassette protein in A. parasiticus. These results also indicate that multiple biochemical mechanisms, including target-site modification due to mutation at cyp51A gene, overexpression of cyp51A gene and the function of an ABC transporter protein, are responsible for DMI-resistance in A. parasiticus. Our findings suggest that A. parasiticus have the genetic and biochemical potential for the appearance of highly aflatoxigenic DMI-resistant isolates in the field.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Aspergillus parasiticus กลายพันธุ์สายพันธุ์ทนต่อ DMIs แยกต่างหากในความถี่ของการกลายพันธุ์สูง UV mutagenesis และเลือกสื่อที่ประกอบด้วย flusilazole สองต่างทนฟี R1 และ R2 ตามความสามารถในการ aflatoxigenic ที่ระบุ กลายพันธุ์สายพันธุ์ทั้งหมด R1 ผลิต aflatoxins ที่ความเข้มข้นสูงมาก (ถึง 3-fold) มากกว่าพันธุ์หลักป่าชนิดเชื้อยีสต์สกัดซูโครสกลาง ในขณะที่สายพันธุ์กลายพันธุ์ (R2 phenotype) ส่วนใหญ่สูญเสียความสามารถในการ aflatoxigenic วิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ในระดับนิพจน์ของยีน aflR เป็นทางเดิน transcriptional regulatory ยีนในการสังเคราะห์ aflatoxin แสดงให้เห็นว่า ยีนนี้ไม่ได้ถูกแสดงใน R2 ทดสอบสายพันธุ์กลายพันธุ์ ศึกษากำหนดพารามิเตอร์ออกกำลังกายพบว่า สุดทน flusilazole กลายพันธุ์สายพันธุ์มีอัตราการเติบโต mycelial, sporulation และการงอกของสปอร์ที่ลดได้ที่สำคัญ ศึกษา cross-resistance ด้วยซึ่งเกิดจากเชื้ออื่น ๆ แสดงให้เห็นว่า กลายพันธุ์สายพันธุ์ทั้งหมด R1 ก็ยังทนต่อ DMIs imazalil และ tebuconazole แต่สะสมความใวซึ่งเกิดจากเชื้อที่มีผลต่อการเผาผลาญมนต์อื่น ๆ และ/หรือกระบวนการโทรศัพท์มือถือของผู้ปกครอง ขัดต่อข้าง สายพันธุ์กลายพันธุ์ R2 ทั้งหมดจัดแสดงต่ำถึงปานกลางต้านยาหลาย DMIs และประเภทสารเคมีอื่น ๆ หลาย สองยีน homologous ต่าง ๆ cyp51A และ cyp51B เข้ารหัส C-14 สเตอรอลอัลฟา demethylase (Cyp51) และยีน mdr เข้ารหัสโปรตีนเทปผูก ATP ซึ่งอาจจะเกี่ยวข้องกับการต้านทาน multidrug โคลน และลักษณะการ เปรียบเทียบลำดับของยีน cyp51A เปิดเผยแทนที่กรดอะมิโนจาก glycine (GGG) กับทริปโตเฟน (TGG) ตำแหน่ง 54 (G54W) ที่สองจากสามสายพันธุ์กลายพันธุ์ R1 วิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโน deduced ของ cyp51B แสดงให้เห็นว่า ไม่กลายพันธุ์ที่สัมพันธ์กับความต้านทาน DMI ศึกษาสำหรับระดับ transcriptional ของ cyp51A พบว่า ยีนนี้ไม่แสดงมากเกินไปในสายพันธุ์กลายพันธุ์ aflatoxigenic ที่สาม ไม่แทนกรดอะมิโนและการ overexpression ของยีน cyp51A ไม่พบใน R2 กลายพันธุ์สายพันธุ์ทดสอบ ทดสอบแบบ real-time PCR วิเคราะห์พบว่าระดับสูง (สูงถึง 25-fold) เสียงบรรยาย mdr ในสายพันธุ์กลายพันธุ์ R2 ทั้งหมด นี้เป็นรายงานแรกที่อธิบายการดำรงอยู่ของยีน cyp51 ที่สองและเป็น mdr ยีนรหัสสำหรับโปรตีนเทปผูก ATP ใน A. parasiticus ผลลัพธ์เหล่านี้ระบุว่า กลไกชีวเคมีหลาย รวมทั้งปรับเปลี่ยนไซต์เป้าหมายเนื่องจากการกลายพันธุ์ในยีน cyp51A, overexpression ของยีน cyp51A และการทำงานของโปรตีนขนส่งมี ABC รับผิดชอบสำหรับต้านทาน DMI ใน A. parasiticus ผลการวิจัยของเราแนะนำว่า A. parasiticus มีศักยภาพทางพันธุกรรม และชีวเคมีสำหรับลักษณะที่ปรากฏของ aflatoxigenic สูงทน DMI ที่แยกได้ในฟิลด์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ Aspergillus parasiticus ทนต่อ DMIS ที่แยกได้ในความถี่สูงหลังจากการกลายพันธุ์ UV-ฉับและการเลือกในสื่อที่มี flusilazole สอง phenotypes ทนที่แตกต่างกัน R1 และ R2 บนพื้นฐานของความสามารถใน aflatoxigenic ของพวกเขาที่ถูกระบุ ทุกสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ R1 ผลิต aflatoxins ที่ความเข้มข้นที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ถึง 3 เท่า) กว่าสายพันธุ์พ่อแม่ป่าชนิดในสารสกัดจากยีสต์กลางน้ำตาลซูโครสในขณะที่ส่วนใหญ่ของสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ (ฟีโนไทป์ R2) สูญเสียความสามารถของพวกเขา aflatoxigenic Real-time PCR วิเคราะห์ของระดับการแสดงออกของยีน aflR ทางเดินกำกับดูแลการถอดรหัสยีนสังเคราะห์อะฟลาท็อกซินในการแสดงให้เห็นว่ายีนนี้ไม่ได้แสดงในสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ R2 ทดสอบ การศึกษาของการออกกำลังกายการกำหนดค่าพารามิเตอร์ที่แสดงให้เห็นว่าส่วนใหญ่สายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ flusilazole ทนมีอัตราการเจริญเติบโตของเส้นใย, สร้างสปอร์และการงอกของสปอต่ำกว่าที่หนึ่งที่มีความสำคัญ การศึกษาข้ามกับความต้านทานสารฆ่าเชื้อราอื่น ๆ ที่แสดงให้เห็นว่าทุกสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ R1 ก็ยังทนกับ imazalil DMIS และ tebuconazole แต่ก็ยังคงความไวของผู้ปกครองของพวกเขาเพื่อฆ่าเชื้อราที่มีผลต่อการเผาผลาญอาหารอื่น ๆ อย่างทุลักทุเลและ / หรือกระบวนการโทรศัพท์มือถือ ตรงกันข้ามกับที่กล่าวข้างต้นทุกสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ R2 แสดงต่ำถึงปานกลางต้านทานหลาย DMIS ยาและสารเคมีหลายชั้นเรียนอื่น ๆ สองยีนคล้ายคลึงกันที่แตกต่างกันและ cyp51A cyp51B เข้ารหัส sterol C-14 อัลฟา demethylase (Cyp51) และยีน MDR เข้ารหัสเอทีพีผูกพันโปรตีนเทปซึ่งอาจจะมีส่วนร่วมในการต่อต้าน multidrug ถูกโคลนและลักษณะ การเปรียบเทียบลำดับของยีน cyp51A เปิดเผยทดแทนกรดอะมิโนจากไกลซีน (GGG) เพื่อโพรไบโอ (TGG) ที่ 54 ตำแหน่ง (G54W) ในสองในสามของสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ R1 การวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนที่แปลรหัสของ cyp51B แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ที่ไม่เกี่ยวข้องกับความต้านทาน DMI การศึกษาในระดับการถอดรหัสของ cyp51A แสดงให้เห็นว่ายีนนี้ได้มากกว่าที่แสดงในสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ที่สาม aflatoxigenic ทั้งแทนกรดอะมิโนหรือแสดงออกของยีน cyp51A พบในสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ R2 ทดสอบ Real-time PCR การวิเคราะห์แสดงให้เห็นระดับสูง (สูงถึง 25 เท่าสูงกว่า) ของหลักฐาน MDR ในทุกสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ R2 ทดสอบ รายงานนี้เป็นรายงานแรกที่อธิบายถึงการดำรงอยู่ของสองยีน cyp51 และ MDR ศักยภาพการเข้ารหัสยีนเอทีพีผูกพันโปรตีนในเทป A. parasiticus ผลเหล่านี้ยังแสดงให้เห็นว่ากลไกทางชีวเคมีหลายรวมถึงการปรับเปลี่ยนเป้าหมายสถานที่เกิดจากการกลายพันธุ์ของยีนที่ cyp51A, แสดงออกของยีน cyp51A และหน้าที่ของโปรตีนขนส่งเอบีซีที่มีความรับผิดชอบใน DMI ต้านทานใน A. parasiticus ค้นพบของเราแสดงให้เห็นว่าเอ parasiticus มีศักยภาพทางพันธุกรรมและชีวเคมีสำหรับการปรากฏตัวของ aflatoxigenic สูงสายพันธุ์ DMI ทนในเขต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เชื้อกลายพันธุ์สายพันธุ์ที่ทน dmis ผู้ดูแล เพื่อแยกความถี่ในการกลายพันธุ์สูงหลังจากการเลือก UV และสื่อที่มีฟลูซิลาซ . สองเกิดความต้านทาน R1 R2 แตกต่างกัน และบนพื้นฐานของความสามารถ aflatoxigenic ของพวกเขาถูกระบุสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ R1 ทั้งหมดผลิตซินที่ความเข้มข้นสูงกว่า ( ถึง 3-fold ) มากกว่าของพ่อแม่สายพันธุ์ยีสต์สกัดปริมาณปานกลาง ในขณะที่ส่วนใหญ่ของสายพันธุ์กลายพันธุ์ ( R2 + ) aflatoxigenic สูญเสียความสามารถของพวกเขา การวิเคราะห์ PCR เวลาจริงของระดับการแสดงออกของยีนทาง aflr , particle กฎระเบียบยีนชีวสังเคราะห์สาร ,พบว่า ยีนไม่แสดงออกใน R2 กลายพันธุ์สายพันธุ์ทดสอบ ศึกษาการกำหนดพารามิเตอร์ของฟิตเนส พบว่า ส่วนใหญ่มีอัตราการดื้อยาฟลูซิลาซกลายพันธุ์สายพันธุ์เจริญการสร้างสปอร์งอกลดลง , และที่สําคัญอย่างหนึ่ง ความต้านทานข้ามกับการศึกษาอื่น ๆพบว่าสายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ fungicides R1 ทั้งหมดยังทนทานต่อ dmis มาซาลิล และ ทีบูโคนาโซล ,แต่ยังคงความไวของสารเคมีที่มีผลต่อการเผาผลาญของเซลล์อื่น และ / หรือ มือถือระบบ ตรงกันข้ามกับข้างต้น สายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ R2 ทั้งหมดมีต่ำถึงปานกลางหลายยาต้านทาน dmis และชั้นเรียนสารเคมีอื่น ๆ ที่แตกต่างกันสองโฮโมโลกัสยีน cyp51a cyp51b , และ ,C-14 ลสเตอรอลตรงกับการเข้ารหัส ( cyp51 ) และยีนเอทีพี มัดเทป 2547 เป็นโปรตีนซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการต้านทานเข้ารหัสถูกโคลนและศึกษาคุณสมบัติ การเปรียบเทียบลำดับของยีน cyp51a เปิดเผยการใช้กรดอะมิโนจากไกลซีน ( GGG ) ทริปโตเฟน ( tgg ) ที่ตำแหน่ง 54 ( g54w ) 2 ใน 3 ของสายพันธุ์กลายพันธุ์ R1 .การวิเคราะห์สรุปลำดับกรดอะมิโนของ cyp51b ไม่พบการกลายพันธุ์ที่ถูกเชื่อมโยงกับ DMI ต้านทาน การศึกษาระดับ cyp51a ลองพบว่า ยีนนี้ถูกแสดงออกในสายพันธุ์กลายพันธุ์ aflatoxigenic 3 หรือกรดอะมิโนเปลี่ยนหรือ overexpression ของ cyp51a ยีนกลายพันธุ์ที่พบใน 2 สายพันธุ์ทดสอบการวิเคราะห์ Real Time PCR พบระดับสูง ( ถึง 25 เท่าสูงกว่า ) ของบันทึกใน 2547 ทั้งหมด R2 กลายพันธุ์สายพันธุ์ทดสอบ นี่เป็นครั้งแรกที่รายงานอธิบายการดำรงอยู่ของสอง cyp51 ยีนและศักยภาพของการเข้ารหัสสำหรับการเข้าเล่ม 2547 เอทีพีเทปโปรตีน . ผู้ดูแล . นอกจากนี้ยังชี้ให้เห็นว่าหลายกลไกชีวเคมีรวมทั้งการปรับเปลี่ยนเป้าหมายเว็บไซต์เนื่องจากการกลายพันธุ์ในยีน cyp51a overexpression cyp51a , การแสดงออกของยีนและการทำงานของโปรตีนขนย้ายเอบีซีมีความต้านทานในผู้ดูแลดี . . . ผลการวิจัยบ่งชี้ว่า 1 . ผู้ดูแลมีศักยภาพทางพันธุกรรมสำหรับลักษณะของ aflatoxigenic สูงป้องกันสายพันธุ์ดีในฟิลด์