Enriched haustoria to be used as an

Enriched haustoria to be used as antigen were prepared exactly
as described by Song et al. [18] following a modified
procedure of Tiburzy et al. [20]. Briefly, leaves were homogenized
in a blender with extraction buffer (0.1 M K-phosphate
pH 6.7, 0.1 M sucrose, 1.5 mM MgSO4, 1.0 mM phenylmethylsulfonyl
fluoride), filtered successively through 100
and 25m pore size nylon mesh and then enriched by sucrose
density gradient centrifugation, using the gradient-steps detailed
in Song et al. [18]. The final fraction, enriched in haustoria
but also contaminated with hyphae, chloroplasts, and
other debris, was used to immunize three Balb/c mice for the
production of monoclonal antibodies. The mouse with the
strongest response, as determined visually from a dot blot
using serum, was sacrificed for a fusion that was performed
using the standard polyethylene glycol procedure. After the
fusion, hybridomas were screened initially by ELISA using
the tissue culture supernatant directly as primary antibody
solution. For ELISA, the antigen was either a plant extract
or the injected antigen mixture used to immunize the mice,
and was bound directly to 96-well plates (Maxisorp: Nunc,
ThermoFisher Scientific, NJ). The plant extract was obtained
in the same way as haustoria, but using mock-inoculated
plants. Only hybridomas reacting to the injected antigen mixture
alone, and not to the plant extract, were retained. All
others were discarded. Retained hybridomas were screened
further by microscopy as follows. Tissue culture supernatant
was used to decorate haustoria in the enriched haustoria samples
by mixing the two in equal volumes for 30 min at room
temperature. Haustoria were then collected by centrifugation
at 13 000 g, 5 min and washed three times with standard
PBS. A fluorescent-labeled anti-mouse conjugate (donkey anti
mouse-whole antibody-FITC-labeled: Jackson Immuno Research,
West Grove, PA) was then incubated with the decorated
haustoria for 30 min at room temperature, and washed
as before. The screen was completed by observing the haustoria
under a fluorescence microscope and overlaying phase
contrast bright-field images with fluorescent images to identify
hybridomas producing anti-haustoria-specific antibody.
Such clones were retained and single-cell cloned twice by

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

อุดม haustoria ใช้ antigen ได้เตรียมความพร้อมทุกประการตามที่อธิบายไว้โดยเพลง et al. [18] ต่อการแก้ไขขั้นตอนของ Tiburzy et al. [20] สั้น ๆ ใบถูก homogenizedในเครื่องปั่นแยกบัฟเฟอร์ (0.1 M K-ฟอสเฟตค่า pH 6.7 ซูโครส 0.1 M, 1.5 มม. MgSO4, phenylmethylsulfonyl 1.0 มิลลิเมตรฟลูออไรด์), กรองอย่างต่อเนื่องผ่าน 100และ 25 เมตรตาข่ายไนล่อนขนาดรูขุมขน และอุดมไป ด้วยน้ำตาลซูโครสนั้นหมุนไล่ระดับความหนาแน่น ใช้การไล่ระดับสีขั้นตอนรายละเอียดในเพลง et al. [18] เศษส่วนสุดท้าย อุดมใน haustoriaแต่ยัง ปนเปื้อน ด้วย hyphae, chloroplasts และใช้เศษอื่น ๆ การ immunize หนู Balb/c สามสำหรับการการผลิตแอนตี้ monoclonal เมาส์ที่มีการการตอบสนองที่แข็งแกร่ง กำหนดสายตาจากจุดบล็อทใช้ซีรั่ม คือการเสียสละในการหลอมรวมที่มีดำเนินโดยใช้กระบวนการมาตรฐานเอทิลีนไกลคอล หลังจากหลอม hybridomas ต้องเริ่มต้น ด้วยการใช้ ELISAเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ supernatant เป็นแอนติบอดีหลักโดยตรงการแก้ไขปัญหา ELISA, antigen เป็นสารสกัดจากพืชตัวอย่างใดอย่างหนึ่งหรือส่วนผสมฉีด antigen ใช้การ immunize หนูและถูกผูกไว้กับแผ่น 96 หลุมโดยตรง (Maxisorp: NuncThermoFisher วิทยาศาสตร์ NJ) สารสกัดจากพืชได้รับในลักษณะเดียวกับ haustoria แต่ใช้ inoculated จำลองพืช เพียง hybridomas ปฏิกิริยาผสมฉีด antigenคนเดียว และไม่ให้สารสกัดจากพืช ถูกเก็บไว้ ทั้งหมดคนอื่น ๆ ถูกละทิ้ง ต้องสะสม hybridomasเพิ่มเติม โดยไมโครสโคเป็นดังนี้ เนื้อเยื่อ supernatantใช้ในการตกแต่ง haustoria ในตัวอย่าง haustoria อุดมโดยการผสมทั้งสองในปริมาณที่เท่ากันสำหรับ 30 นาทีที่ห้องอุณหภูมิ Haustoria ถูกเก็บรวบรวม โดยการหมุนเหวี่ยงแล้วที่ 13 000 g, 5 นาทีและล้างสามเวลามาตรฐานPBS มีป้ายเรืองแสงเปลี่ยนเมาส์ป้องกัน conjugate (ลากันเมาส์ทั้งแอนติบอดี FITC ชื่อ: Jackson Immuno วิจัยตะวันตกโกรฟ PA) ถูกแล้วได้รับการกกกับการตกแต่งhaustoria 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ความสะอาดเป็นมาก่อน หน้าจอเสร็จสิ้น โดยสังเกต haustoriaภายใต้การเรืองแสงกล้องจุลทรรศน์และซ้อนระยะความคมชัดภาพสดใสฟิลด์ภาพฟลูออเรสเซนต์เพื่อระบุhybridomas ผลิตแอนติบอดีต่อต้าน haustoria เฉพาะโคลนดังกล่าวถูกเก็บไว้ และเซลล์เดียวลอกแบบสองเท่าด้วย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

haustoria อุดมที่จะใช้เป็นแอนติเจนได้จัดทำตรง
ตามที่อธิบายเพลง, et al [18] ต่อไปนี้มีการปรับเปลี่ยน
ขั้นตอนของการ Tiburzy et al, [20] สั้น ๆ ใบถูกปั่น
ในเครื่องปั่นกับกันชนสกัด (0.1 M K-ฟอสเฟต
พีเอช 6.7, 0.1 M ซูโครส 1.5 มิลลิ MgSO4 1.0 มิลลิ phenylmethylsulfonyl
ลูออไรด์) กรองอย่างต่อเนื่องผ่าน 100
และขนาด 25m รูขุมขนไนลอนตาข่ายและจากนั้นอุดมไปด้วยน้ำตาลซูโครส
ความหนาแน่น การหมุนเหวี่ยงการไล่ระดับสีโดยใช้การไล่ระดับสีขั้นตอนรายละเอียด
ในเพลง et al, [18] ส่วนสุดท้ายที่อุดมด้วย haustoria
แต่ยังปนเปื้อนด้วยเส้นใย, คลอโรพลาและ
เศษอื่น ๆ ถูกนำไปฉีดสามหนู Balb / C สำหรับ
การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดี เมาส์ที่มี
การตอบสนองที่แข็งแกร่งตามที่กำหนดสายตาจากจุดลบ
โดยใช้เซรั่มได้รับการเสียสละเพื่อฟิวชั่นที่ได้รับการดำเนินการ
ตามขั้นตอน polyethylene glycol มาตรฐาน หลังจากที่
ฟิวชั่นไฮบริถูกคัดกรองครั้งแรกโดยวิธี ELISA โดยใช้
ใสเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อโดยตรงเป็นแอนติบอดีหลัก
วิธีการแก้ปัญหา สำหรับวิธี ELISA แอนติเจนเป็นทั้งสารสกัดจากพืช
หรือส่วนผสมแอนติเจนฉีดนำไปฉีดหนู
และผูกพันโดยตรงกับ 96 หลุมแผ่น (Maxisorp: Nunc,
ThermoFisher วิทยาศาสตร์, นิวเจอร์ซีย์) สารสกัดจากพืชที่ได้รับ
ในลักษณะเดียวกับ haustoria แต่ใช้จำลองเชื้อ
พืช เฉพาะไฮบริปฏิกิริยากับส่วนผสมแอนติเจนฉีด
เพียงอย่างเดียวและไม่ให้สารสกัดจากพืชที่ถูกเก็บไว้ ทุก
คนถูกทิ้ง ไฮบริสะสมถูกคัดกรอง
ต่อไปโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ดังต่อไปนี้ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อใส
ถูกนำมาใช้ในการตกแต่ง haustoria ในตัวอย่าง haustoria อุดม
โดยการผสมทั้งสองในปริมาณเท่า ๆ กันเป็นเวลา 30 นาทีที่ห้อง
อุณหภูมิ Haustoria ถูกเก็บรวบรวมแล้วโดยการหมุนเหวี่ยง
ที่ 13 000 กรัม 5 นาทีและล้างสามครั้งด้วยมาตรฐาน
พีบีเอส เรืองแสงป้ายผันป้องกันเมาส์ (ลาต่อต้าน
เมาส์ทั้งแอนติบอดี FITC ป้าย: แจ็คสัน Immuno วิจัย
เวสโกรฟ, PA) ถูกบ่มแล้วกับการตกแต่ง
haustoria เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องและล้าง
เป็นมาก่อน หน้าจอเป็นที่เรียบร้อยแล้วโดยการสังเกต haustoria
ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและซ้อนทับเฟส
ความคมชัดภาพที่สว่างสดใสสนามด้วยภาพเรืองแสงเพื่อแจ้ง
ไฮบริการผลิตแอนติบอดีต่อต้าน haustoria เฉพาะ.
โคลนดังกล่าวถูกเก็บไว้และเซลล์เดียวโคลนครั้งที่สองโดย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อุดม haustoria เพื่อใช้เป็นแอนติเจนที่เตรียมจริงๆตามที่อธิบายไว้โดยเพลง et al . [ 18 ] ต่อไปนี้แก้ไขขั้นตอน tiburzy et al . [ 20 ] สั้น ใบ เป็นโฮโมในเครื่องปั่นกับบัฟเฟอร์ ( 0.1 M k-phosphate การสกัดพีเอช 6.7 0.1 M sucrose MgSO4 ใ phenylmethylsulfonyl 1.5 มม. 1.0 มม.ฟลูออไรด์ , กรองอย่างต่อเนื่องผ่าน 100แล้ว 25m ขนาดรูตาข่ายไนล่อนและอุดมด้วยน้ำตาลซูโครสความหนาแน่นของการปั่นโดยใช้ขั้นตอนรายละเอียดการไล่ระดับสีในเพลง et al . [ 18 ] ส่วนสุดท้ายใน haustoria อุดมสมบูรณ์แต่ยังปนเปื้อนด้วย ) และคลอโรพลาสต์ , ,เศษอื่น ๆที่ถูกใช้ใน 3 หนูสายพันธุ์ Balb / C สำหรับการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดี เมาส์กับการตอบสนองที่แข็งแกร่งเมื่อพิจารณาสายตาจากจุดเปรอะเปื้อนการใช้เซรั่ม สละให้ฟิวชั่นที่แสดงเอทิลีนไกลคอลโดยใช้มาตรฐานกระบวนการ หลังจากฟิวชั่น , ทำให้มีเริ่มต้นด้วยวิธี ELISA โดยใช้การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อโดยตรง เช่น การนำแอนติบอดีโซลูชั่น สำหรับวิธี ELISA , แอนติเจนเป็นสารสกัดจากพืชทั้งหรือฉีดแอนติเจนส่วนผสมที่ใช้ในหนูและถูกผูกไว้ตรง 96 ดีแผ่น ( maxisorp : ขณะนี้ ,thermofisher ทางวิทยาศาสตร์ , NJ ) สารสกัดจากพืชที่ได้รับในลักษณะเดียวกับที่ haustoria แต่ใช้หัวเชื้อเยาะเย้ยพืช เท่านั้น ทำให้มีปฏิกิริยาต่อแอนติเจนฉีดผสมคนเดียวและไม่สารสกัดจากพืช , สะสม ทั้งหมดคนอื่นทิ้ง สะสม ทำให้มีต่อด้วยกล้องจุลทรรศน์ดังนี้ นำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อถูกใช้ในการตกแต่ง haustoria ในอุดม haustoria ตัวอย่างโดยการผสมสองในปริมาณเท่ากับ 30 นาที ที่ห้องอุณหภูมิ haustoria แล้วเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยง13 , 000 G , 5 นาทีและล้างสามครั้งด้วยมาตรฐานPBS เป็นหลอดป้ายต่อต้านเมาส์ ) ( ลา ป้องกันป้าย : วิจัยแอนติบอดีเมาส์ทั้ง fitc มมูโนแจ็คสัน ,West Grove , PA ) แล้วบ่มกับตกแต่งhaustoria 30 นาที ที่อุณหภูมิห้อง และล้างเช่นเดิม หน้าจอเสร็จสมบูรณ์โดยสังเกต haustoriaภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง และซ้อนทับ เฟสภาพคมชัดสดใสด้วยหลอดภาพเพื่อระบุเขตต่อต้าน ทำให้การผลิต haustoria แอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงการโคลนและโคลนนั้นเป็นเซลล์เดี่ยวสองครั้งโดย