Sequencing and analysis of the 16S

Sequencing and analysis of the 16S rRNA gene
For the second PCR reaction, the following primers, designed
by Prof. Leonardo M. Cruz (Dept. Biochemistry,
Federal University of Paraná, Curitiba, PR, Brazil),
were used: 362f (5′ CTCCTACGGGAGGCAGCAGTG
GGG 3′), 786f (5′ CGAAAGCGTGGGGAGCAAAC
AGG 3′), in addition to the fD1 primer (Weisburg et al.
1991). Eighty ng of the purified product from the first PCR
reaction, 0.25 mM of primer and 2 μL ET mixture were
used for sequencing. Ultrapure water was added to reach
the final volume of 10 μL. Amplification was performed for
35 cycles of 30 s at 94°C, 15 s at 50°C and 90 s at 60°C.
After amplification, purification was performed with
Sephadex™ filtration gel, G-50 medium (GE® Healthcare)
and then the product was submitted to electrophoresis
with an automated DNA sequencing analyser, model
MegaBACE1000 (Amersham Biosciences The quality of the bases and the fragment assembly
were analyzed with the PhredPhrapConsed software
(Ewing et al.1998). Alignments were carried out with
the PRANK software (Löytynoja and Goldman 2010).
The percentage of similarity was obtained from the RDP
(Ribosomal Database Project).
The phylogenetic analysis was made using Bayesian inference
with the MrBayes 3.1.2 software (Ronquist and

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จัดลำดับและการวิเคราะห์ยีน rRNA 16Sปฏิกิริยา PCR สอง ไพรเมอร์ต่อ ออกแบบโดยศาสตราจารย์ Leonardo เมตรครัซ (แผนกชีวเคมีมหาวิทยาลัยของรัฐบาลกลาง Paraná, Curitiba, PR บราซิล),ใช้: 362f (5′ CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG 3′), 786f (5′ CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG 3′), นอกจากรองพื้น fD1 (Weisburg et al1991) . ng แปดผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์จาก PCR ครั้งแรกปฏิกิริยา 0.25 มม.รองพื้นและผสม ET μL 2 ได้ใช้สำหรับการจัดลำดับ น้ำ ultrapure เพิ่มถึงปริมาตรสุดท้ายของ 10 μL ดำเนินการขยายรอบ 35 30 s ที่ 94° C, 15 s ที่ 50° C และ 90 s ที่ 60 องศาเซลเซียสหลังจากขยาย ทำฟอกด้วยเจ Sephadex ™กรอง กลาง G 50 (GE ®ดูแลสุขภาพ)แล้ว ส่งผลิตภัณฑ์ไป electrophoresisด้วยการอัตโนมัติ DNA ลำดับ analyser รุ่นMegaBACE1000 (เวลาออก Amersham คุณภาพฐานและแอสเซมบลีส่วนได้วิเคราะห์ ด้วยซอฟต์แวร์ PhredPhrapConsed(Ewing et al.1998) จัดแนวที่ดำเนินการด้วยซอฟต์แวร์เล่นตลก (Löytynoja และโกลด์แมน 2010)เปอร์เซ็นต์ของความคล้ายคลึงกันได้รับจากการ RDP(โครงการฐานข้อมูล ribosomal)ทำการวิเคราะห์ phylogenetic ใช้ข้อทฤษฎีกับซอฟต์แวร์ MrBayes 3.1.2 (Ronquist และ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ลำดับและการวิเคราะห์ยีน 16S rRNA
สำหรับปฏิกิริยา PCR
สองไพรเมอร์ต่อไปนี้ได้รับการออกแบบโดยศาสตราจารย์เลโอนาร์โดเอ็มครูซ(ฝ่ายชีวเคมีมหาวิทยาลัยสหพันธ์ Parana, กูรีตีบา, PR, บราซิล), ถูกนำมาใช้: 362f (5 ' CTCCTACGGGAGGCAGCAGTG GGG 3 ') 786f (5' CGAAAGCGTGGGGAGCAAAC AGG 3 ') นอกเหนือไปจากไพรเมอร์ fd1 (Weisburg et al. 1991) แปดสิบงะของผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์จาก PCR แรกปฏิกิริยา0.25 มิลลิของไพรเมอร์และ 2 ส่วนผสมไมโครลิตร ET ถูกใช้สำหรับการจัดลำดับ น้ำบริสุทธิ์ถูกเพิ่มเข้ามาในการเข้าถึงเล่มสุดท้าย 10 ไมโครลิตร ขยายได้ดำเนินการสำหรับ35 รอบของ 30 วินาทีที่ 94 ° C, 15 วินาทีที่ 50 องศาเซลเซียสและ 90 s ที่ 60 ° C. หลังจากที่ขยายบริสุทธิ์ได้ดำเนินการกับเจลกรอง™ Sephadex G-50 ขนาดกลาง (GE®การดูแลสุขภาพ) และ แล้วผลิตภัณฑ์ที่ถูกส่งไปยังอิเล็กที่มีการวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเออัตโนมัติรุ่นMegaBACE1000 (Amersham ชีววิทยาศาสตร์ที่มีคุณภาพของฐานและการประกอบชิ้นส่วนที่ถูกนำมาวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์PhredPhrapConsed (วิง et al.1998). Alignments ได้ดำเนินการกับซอฟแวร์เล่นตลก(Löytynojaและโกลด์แมน 2010). ร้อยละของความคล้ายคลึงกันที่ได้ที่ได้รับจากไลบรารี(ยีน ribosomal โครงการฐานข้อมูล). การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้การอนุมานแบบเบย์กับ MrBayes 3.1.2 ซอฟแวร์ (Ronquist และ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

และการวิเคราะห์ลำดับของเบส 16S rRNA ยีน
สำหรับปฏิกิริยา PCR 2 ไพรเมอร์ต่อไปนี้ ออกแบบโดย ศาสตราจารย์ ลีโอนาร์โด ครูซ ( เมตร

ภาควิชาชีวเคมี มหาวิทยาลัยสหพันธ์รัฐอามาปาสุด , พีอาร์ , บราซิล ) ,
ใช้ : 362f ( 5 นั้น ctcctacgggaggcagcagtg GGG
3 นั้น 786f ( 5 นั้น cgaaagcgtggggagcaaac )
agg 3 นั้น ) นอกจากการใช้เพื่อการวิเคราะห์ ( weisburg et al .
1991 )80 นาโนบริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยา PCR
แรก 0.25 มม. และ 2 ลิตรและผสมรองพื้นμถูก
ใช้ของ บริสุทธิ์มาก น้ำเพิ่มถึง 10 เล่มสุดท้าย
μล. ขยายได้สำหรับ
35 รอบ 30 s ที่ 94 ° C , 15 เป็น 50 ° C ที่ 60 องศา และ 90 s
หลังจากขยายบริสุทธิ์ได้ด้วย
™ Sephadex G-50 gel filtration , ขนาดกลาง ( GE ®
สุขภาพ )แล้วผลิตภัณฑ์ที่ถูกส่งไปยัง electrophoresis
กับอัตโนมัติลำดับดีเอ็นเอวิเคราะห์แบบ
megabace1000 ( ชีววิทยาศาสตร์ที่คุณภาพของฐานและประกอบชิ้นส่วน
วิเคราะห์ด้วย phredphrapconsed ซอฟต์แวร์
( วิง et al . 2541 ) การจัดแนวทดลองกับ
แกล้งซอฟต์แวร์ ( L ö ytynoja และโกลด์แมน 2010 ) .
เปอร์เซ็นต์ความเหมือนได้จาก Comment
( Protein โครงการฐานข้อมูล การวิเคราะห์ ซึ่งได้ใช้

mrbayes คชกรรมการอนุมาน ด้วยการดาวน์โหลดซอฟต์แวร์ ronquist และ