ubiquitous in the aquatic environme

ubiquitous in the aquatic environment and the possibility
of dual infections is likely (Hawke & Khoo 2004).
Our detection of A. hydrophila in catfish Ictalurus
punctatus injected with F. columnaris and E. ictaluri
corroborate findings of others that infection with E.
ictaluri elicits shedding of previously inapparent A.
hydrophila (Nusbaum & Morrison 2002). In most
instances, little more than anecdotal experience with
mixed infections is available (Wagner et al. 2002).
Thus, the need for increased awareness of mixed infections
and rapid diagnosis of disease in food fish caused
by these 3 important bacterial pathogens, prompted us
to develop a multiplex-PCR.
In this study, 3 sets of primers, each specific for a
conserved gene segment of the cognate bacterial species,
were used for simultaneous detection of
Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri and
Aeromonas hydrophila. We designed oligonucleotide
primers corresponding to short unique segments
within the E. ictaluri 16S rRNA gene. Recent analysis
of the 16S–23S intergenic spacer regions of the rRNA
operons in E. ictaluri has revealed that this genospecies
represents a coherent homogeneous cluster
within the family Enterobacteriaceae (Panangala et al.
2005). Amplification using our primers specific for the
E. ictaluri 16S rRNA gene generated a 407 bp product
from 10 archived E. ictaluri isolates from different
geographic locations.
For identification of Flavobacterium columnare, we
used primers that were specific for a region of the
16S–23S intergenic spacer region of F. columnare that
had been previously designed and used by Welker et
al. (2005). In contrast to Edwardsiella ictaluri, several
studies have indicated distinctive genotypic diversity
among F. columnare isolates (Triyanto & Wakabayashi
1999, Arias et al. 2004). Despite the genetic polymorphism,
primers designed by Welker et al. (2005) were
able to amplify DNA from all F. columnare fish isolates
included in the study by Arias et al. (2004) and the
10 F. columnare isolates when used in the m-PCR
assay in this study.
As with Flavobacterium and Edwardsiella, members
of the genus Aeromonas are autochthonous to freshwater
aquatic ecosystems world-wide and can survive
over a wide range of temperatures (Altwegg & Geiss
1989). A great deal of confusion and controversy has
prevailed over the taxonomic classification of Aeromonas
species due to the lack of precise biochemical
and/or other phenotypic properties and inadequacy of
reliable typing schemes (Kaznowski 1998, Abbott et al.
2003). On the basis of 16S rDNA sequencing, all species
of the genus Aeromonas are presently included
under a distinct family, Aeromonadaceae. Most, if not
all, fish-pathogenic A. hydrophila produce a cytolytic
toxin aerolysin. The primer pairs previously designed
for PCR amplification of a portion of the aerolysin gene
(Pollard et al. 1990) were used in the m-PCR. These
primers were originally designed to avoid regions
of homology in the structural genes for A. sobria aerolysin,
Escherichia coli hemolysin A, and/or Staphylococcus
aureus α-toxin (Lior & Johnson 1991). The
primers target a 209 bp fragment of the aerolysin gene,
which was present in all aerolysin-positive fish isolates
of A. hydrophila used in this study.
The diagnostic sensitivity and specificity of the m-
PCR assay was evaluated by testing nucleic acid prepared
from 10 biochemically characterized strains
of each of the bacterial species Flavobacterium
columnare, Edwardsiella ictaluri and Aeromonas
hydrophila and from 13 other bacterial species that are
phylogenetically related or frequently isolated from
fish. Positive m-PCR amplification of the targeted DNA
templates from each of the bacteria with predicted-size
amplicons indicated that the test identified various
isolates of the respective microbial pathogens. As
expected, A. hydrophila isolates lacking aerolysin
were negative in the m-PCR assay. With the exception
of A. salmonicida subsp. salmonicida, no DNA amplification
was observed with any of the other bacteria
included in this study. However, amplification of A.
salmonicida subsp. salmonicida DNA is relatively
inconsequential to the diagnosis of bacterial infections
in warm-water-cultured food fish species because
typical A. salmonicida subsp. salmonicida is psychrophilic,
has not been isolated from warm water cultured
food fish species such as channel catfish or
tilapia, and is largely a pathogen of salmonids (Dalsgaard
et al. 1994).
PCR techniques have previously been developed for
identification of each of the 3 bacterial species (Pollard
et al. 1990, Bader et al. 2003, Bilodeau et al. 2003). All
of these studies used PCR amplification of a single targeted
gene segment of a given bacterium with a single
set of primers. In the m-PCR, where several sets of
primers are used in the reaction for amplification of
multiple target genes, the diagnostic sensitivity or
detection limit is generally considered to be low
(Rosenfield & Jaykus 1999, Jean et al. 2004, Lee et al.
2005). In at least 1 study, a 10-fold decrease in detection
sensitivity compared to single PCR was recorded
(Jean et al. 2004). In an m-PCR-based method for
simultaneous detection of 4 pathogens involved in
warm-water streptococcosis in fish tissues, Mata et al.
(2004) recorded detection limits of 5 × 103 cells g–1 of
tissue for Streptococcus iniae, 1.2 × 104 cells g–1 for
S. difficilis, 1 × 104 cells g–1 for S. paraubiris, and 2.5 ×
103 cells g–1 for Lactococcus garviae. In the present
study, the m-PCR diagnostic sensitivity threshold for
detection of the 3 bacteria in tissues was comparable to
that obtained by Mata et al. (2004).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ในสภาพแวดล้อมทางน้ำและเป็นไปได้ของการติดเชื้อสองเป็นแนวโน้ม (Hawke และ Khoo 2004)ของเราตรวจหา A. hydrophila ในปลาดุก Ictalurusฉีดกับ F. columnaris E. ictaluri punctatuscorroborate ผลการวิจัยของผู้อื่นที่ติดเชื้อกับอีictaluri elicits ส่องของก่อนหน้านี้นั้นhydrophila (Nusbaum & 2002 มอร์ริสัน) ในที่สุดอินสแตนซ์ น้อยประสบการณ์เล็ก ๆ ด้วยการติดเชื้อผสมเป็นว่าง (วากเนอร์ et al. 2002)ดังนั้น ต้องการเพิ่มความตระหนักของการติดเชื้อผสมและวินิจฉัยโรคในปลาอาหารเกิดอย่างรวดเร็วโดยเหล่านี้ 3 สำคัญแบคทีเรียโรค ให้เราพัฒนาล็ก-PCRในการศึกษานี้ ชุดที่ 3 ของไพรเมอร์ เฉพาะสำหรับแต่ละตัวส่วนนำยีนของแบคทีเรียชนิด cognateใช้สำหรับการตรวจสอบพร้อมColumnare Flavobacterium, Edwardsiella ictaluri และAeromonas hydrophila เราออกแบบ oligonucleotideไพรเมอร์ที่สอดคล้องกับเซ็กเมนต์เฉพาะระยะสั้นภายใน E. ictaluri 16S rRNA ยีน วิเคราะห์ล่าสุดของภูมิภาคเป็นตัวเว้นวรรค intergenic 16S – 23S rRNAoperons ใน E. ictaluri ได้เปิดเผยที่นี้ genospeciesแทนคลัสเตอร์เหมือน coherentภายในครอบครัว Enterobacteriaceae (Panangala et al2005) ขยายใช้เฉพาะไพรเมอร์ของเราสำหรับการE. ictaluri 16S rRNA ยีนสร้างผลิตภัณฑ์ bp 407จาก 10 เก็บ E. ictaluri แยกจากแตกต่างกันตำแหน่งทางภูมิศาสตร์สำหรับรหัสของ Flavobacterium columnare เราใช้ไพรเมอร์ที่มีเฉพาะในพื้นที่ภูมิภาคเป็นตัวเว้นวรรค intergenic 16S – 23S F. columnare ที่ได้เคยออกแบบ และใช้ Welker ร้อยเอ็ดal. (2005) ตรงข้าม Edwardsiella ictaluri หลายศึกษาได้ระบุจีโนไทป์หลากหลายโดดเด่นระหว่าง F. columnare แยก (Triyanto และ Wakabayashi1999, Arias et al. 2004) แม้ มีการพันธุโพลิมอร์ฟิซึมไพรเมอร์ที่ออกแบบโดย Welker et al. (2005) ได้สามารถขยายดีเอ็นเอจากทั้งหมด F. columnare ปลาแยกรวมอยู่ในการศึกษาโดย Arias และ al. (2004) และ10 เอฟ columnare ที่แยกได้เมื่อใช้ใน m-PCRassay ในการศึกษานี้เช่นเดียวกับความ Flavobacterium และ Edwardsiella สมาชิกตระกูลนี้ Aeromonas เป็น autochthonous กับปลาระบบนิเวศน้ำทั่วโลก และสามารถอยู่รอดช่วงกว้างของอุณหภูมิ (Altwegg และ Geiss1989) มีความสับสนและถกเถียงมากแผ่ขยายไปกว่าประเภทอนุกรมวิธานของ Aeromonasพันธุ์เนื่องจากมีความแม่นยำเชิงชีวเคมีและ/หรืออื่น ๆ คุณสมบัติไทป์และ inadequacy ของโครงร่างการพิมพ์เชื่อถือได้ (Kaznowski 1998 แอ็บ et al2003) ตามลำดับ 16S rDNA สปีชีส์ทั้งหมดมีอยู่ในปัจจุบันของตระกูลนี้ Aeromonasภายใต้ทั้งครอบครัว Aeromonadaceae ที่สุด ไม่ทั้งหมด A. hydrophila ปลา pathogenic ผลิตแบบ cytolyticพิษ aerolysin คู่รองพื้นมาก่อนหน้านี้สำหรับขยาย PCR ของบางส่วนของยีน aerolysin(Pollard et al. 1990) ใช้ใน m-PCR เหล่านี้ไพรเมอร์ออกแบบเพื่อหลีกเลี่ยงการภูมิภาคของ homology ในยีนโครงสร้างที่ aerolysin A. sobriaEscherichia coli hemolysin A และ/หรือ Staphylococcusหมอเทศข้างลายด้วยกองทัพพิษ (Lior และ Johnson 1991) ที่ไพรเมอร์เป้าหมายส่วน bp 209 ของยีน aerolysinที่มีในปลา aerolysin เป็นบวกทั้งหมดที่แยกได้ของ A. hydrophila ที่ใช้ในการศึกษานี้ความไวในการวินิจฉัยและ specificity m-PCR assay ถูกประเมิน โดยการทดสอบกรดนิวคลีอิกที่เตรียมไว้จากสายพันธุ์ biochemically ลักษณะ 10ของแต่ละสายพันธุ์แบคทีเรีย Flavobacteriumcolumnare, Edwardsiella ictaluri และ Aeromonashydrophila จาก 13 แบคทีเรียชนิดอื่นที่มีphylogenetically ที่เกี่ยวข้อง หรือมักโดดเดี่ยวปลา M-PCR บวกขยายของดีเอ็นเอเป้าหมายแม่แบบจากแบคทีเรียมีขนาดทำนายamplicons ระบุว่า การทดสอบระบุต่าง ๆแยกของโรคจุลินทรีย์เกี่ยวข้อง เป็นคาด A. hydrophila ที่แยกได้ขาด aerolysinถูกลบในการทดสอบ m PCR มีข้อยกเว้นของ A. salmonicida ถั่ว salmonicida ขยายดีเอ็นเอไม่ได้พบกับแบคทีเรียอื่น ๆรวมอยู่ในการศึกษานี้ อย่างไรก็ตาม ขยายของsalmonicida salmonicida ถั่วดีเอ็นเอจะค่อนข้างขึ้นเป็นการวินิจฉัยการติดเชื้อแบคทีเรียในพันธุ์อบอุ่นน้ำอ่างอาหารปลาเนื่องจากโดยทั่วไป A. salmonicida ถั่ว salmonicida เป็น psychrophilicไม่ได้แยกจากอ่างน้ำอุ่นพันธุ์อาหารปลาเช่นปลากดอเมริกัน หรือปลานิล และส่วนใหญ่ศึกษาของ salmonids (Dalsgaardร้อยเอ็ด al. 1994)เทคนิค PCR ได้ก่อนหน้านี้ถูกพัฒนาขึ้นสำหรับรหัสของแต่ละสายพันธุ์แบคทีเรีย 3 (Pollardร้อยเอ็ด al. 1990, Bader et al. 2003, Bilodeau et al. 2003) ทั้งหมดการศึกษานี้ใช้ขยาย PCR ของเป้าหมายเดียวส่วนยีนของแบคทีเรียให้กับซิงเกิลชุดไพรเมอร์ ใน m-PCR ที่หลายชุดไพรเมอร์ใช้ในปฏิกิริยาการขยายของหลายยีนเป้าหมาย ความไวในการวินิจฉัย หรือโดยทั่วไปถือว่าเป็นการตรวจสอบวงเงินจะต่ำ(Rosenfield & Jaykus 1999 ฌอง et al. 2004, Lee et al2005) . ในการศึกษา 1 ลดลงตรวจ 10-foldบันทึกความไวเทียบกับ PCR ที่เดียว(Jean et al. 2004) ในวิธีการ m PCR-ใช้สำหรับพร้อมตรวจ 4 โรคที่เกี่ยวข้องในstreptococcosis น้ำอุ่นในเนื้อเยื่อปลา ภะรัตมะตะ et al(2004) จำกัดตรวจสอบบันทึกของ 5 × 103 g – 1 ของเซลล์เนื้อเยื่อสำหรับอุณหภูมิ iniae, 1.2 × 104 เซลล์ราคา g-1 สำหรับS. difficilis, g – 1 S. paraubiris และ 2.5 × 1 × 104 เซลล์103 เซลล์ g – 1 สำหรับ Lactococcus garviae ในปัจจุบันศึกษา ขีดจำกัดความไวในการวินิจฉัย m-PCR สำหรับตรวจพบแบคทีเรีย 3 ในเนื้อเยื่อได้เปรียบไปที่ได้รับโดยภะรัตมะตะและ al. (2004)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

แพร่หลายในสิ่งแวดล้อมทางน้ำและความเป็นไปได้ของการติดเชื้อคู่มีโอกาส (ฮอว์คและคู 2004). การตรวจสอบของเรา A. hydrophila ในปลาดุก Ictalurus punctatus ฉีด Columnaris เอฟและอี ictaluri ยืนยันผลการวิจัยของคนอื่น ๆ ที่ติดเชื้ออีองค์ictaluri การไหลของ inapparent ก่อนหน้านี้ A. hydrophila (Nusbaum และมอร์ริสัน 2002) ในส่วนกรณีน้อยกว่าประสบการณ์พอสมควรกับการติดเชื้อผสมใช้ได้(แว็กเนอร์ et al. 2002). ดังนั้นความจำเป็นในการเพิ่มความตระหนักของการติดเชื้อผสมและการวินิจฉัยอย่างรวดเร็วของการเกิดโรคในอาหารปลาที่เกิดจากทั้ง3 แบคทีเรียที่สำคัญแจ้งให้เราในการพัฒนาหลาย-PCR. ในการศึกษานี้ 3 ชุดไพรเมอร์แต่ละเฉพาะสำหรับส่วนอนุรักษ์ยีนของแบคทีเรียสายพันธุ์สายเลือด, ถูกนำมาใช้สำหรับการตรวจสอบพร้อมกันของFlavobacterium columnare, ictaluri Edwardsiella และAeromonas hydrophila เราได้ออกแบบ oligonucleotide ไพรเมอร์ที่สอดคล้องกับกลุ่มที่ไม่ซ้ำกันสั้นภายในอี ictaluri 16S rRNA ยีน การวิเคราะห์ล่าสุดของ 16S-23S ภูมิภาค spacer intergenic ของ rRNA operons ในอี ictaluri ได้เปิดเผยว่า genospecies นี้หมายถึงกลุ่มที่เป็นเนื้อเดียวกันสอดคล้องกันภายในครอบครัวEnterobacteriaceae (ที่ Panangala et al. 2005) การขยายการใช้ไพรเมอร์ของเราที่เฉพาะเจาะจงสำหรับอี ictaluri 16S rRNA ยีนสร้างผลิตภัณฑ์ 407 bp จาก 10 อี ictaluri เก็บแยกจากที่แตกต่างกันสถานที่ทางภูมิศาสตร์. สำหรับบัตรประจำตัวของ Flavobacterium columnare เราใช้ไพรเมอร์ที่มีความเฉพาะเจาะจงสำหรับภูมิภาคที่16S-23S ภูมิภาค spacer intergenic ของเอฟ columnare ที่มีรับการออกแบบมาก่อนหน้านี้และใช้โดยเกอร์และอัล (2005) ในทางตรงกันข้ามกับ Edwardsiella ictaluri หลายการศึกษาได้แสดงให้เห็นความหลากหลายทางพันธุกรรมที่โดดเด่นในหมู่เอฟไอโซเลทcolumnare (Triyanto และ Wakabayashi ปี 1999 เรียส et al. 2004) แม้จะมีความแตกต่างทางพันธุกรรมไพรเมอร์ที่ออกแบบโดยเกอร์, et al (2005) มีความสามารถในการขยายดีเอ็นเอจากปลาทั้งหมดเอฟcolumnare แยกรวมอยู่ในการศึกษาโดยเรียสเอตอัล (2004) และcolumnare เอฟ 10 แยกเมื่อใช้ M-PCR ทดสอบในการศึกษานี้. เช่นเดียวกับ Flavobacterium และ Edwardsiella สมาชิกของพืชและสัตว์ที่มีเชื้อAeromonas autochthonous น้ำจืดเพื่อระบบนิเวศทางน้ำทั่วโลกและสามารถอยู่รอดได้ในช่วงกว้างของอุณหภูมิ (Altwegg และ Geiss 1989) การจัดการที่ดีของความสับสนและความขัดแย้งได้ชนะการจัดหมวดหมู่การจัดหมวดหมู่ของเชื้อ Aeromonas สายพันธุ์เนื่องจากการขาดความแม่นยำทางชีวเคมีและ / หรืออื่น ๆ คุณสมบัติฟีโนไทป์และไม่เพียงพอของรูปแบบการพิมพ์ที่เชื่อถือได้(Kaznowski ปี 1998 แอ๊บบอต et al. 2003) บนพื้นฐานของการจัดลำดับ 16S rDNA ที่ทุกชนิดของพืชและสัตว์Aeromonas จะรวมอยู่ในปัจจุบันภายใต้ครอบครัวที่แตกต่างกันAeromonadaceae ส่วนใหญ่ถ้าไม่ทั้งหมด hydrophila A. ปลาที่ทำให้เกิดโรคผลิต cytolytic aerolysin สารพิษ คู่ไพรเมอร์ที่ออกแบบมาก่อนหน้านี้สำหรับการขยาย PCR จากส่วนของยีน aerolysin ที่ (พอลลาร์ et al. 1990) ถูกนำมาใช้ในม-PCR เหล่านี้ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบมาเพื่อหลีกเลี่ยงการภูมิภาคของที่คล้ายคลึงกันในยีนโครงสร้างA. sobria aerolysin, Escherichia coli hemolysin A, และ / หรือ Staphylococcus aureus α-toxin (Lior และจอห์นสัน 1991) ไพรเมอร์ส่วนเป้าหมาย 209 bp ของยีน aerolysin, ซึ่งเป็นของขวัญในทุกสายพันธุ์ปลา aerolysin บวกของA. hydrophila ใช้ในการศึกษาครั้งนี้. ความไวและความจำเพาะในการวินิจฉัยของ m- ทดสอบ PCR ถูกประเมินโดยการทดสอบกรดนิวคลีเตรียมจาก10 สายพันธุ์ที่มีลักษณะทางชีวเคมีของแต่ละสายพันธุ์แบคทีเรียFlavobacterium columnare, ictaluri Edwardsiella และเชื้อ Aeromonas hydrophila และจาก 13 ชนิดของเชื้อแบคทีเรียอื่น ๆ ที่มีphylogenetically ที่เกี่ยวข้องหรือที่แยกได้บ่อยจากปลา บวกการขยายเมตร-PCR ของการกำหนดเป้าหมายดีเอ็นเอแม่แบบจากกันของเชื้อแบคทีเรียที่มีการคาดการณ์ขนาดamplicons ชี้ให้เห็นว่าการทดสอบต่างๆระบุสายพันธุ์ของเชื้อโรคจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้อง ในฐานะที่เป็นที่คาดหวัง A. hydrophila แยกขาด aerolysin เป็นลบในการทดสอบของ m-PCR ด้วยข้อยกเว้นของเอ subsp salmonicida salmonicida ขยายดีเอ็นเอไม่สังเกตเห็นใดๆ ของแบคทีเรียอื่น ๆรวมอยู่ในการศึกษาครั้งนี้ อย่างไรก็ตามการขยายของเอsubsp salmonicida salmonicida ดีเอ็นเอค่อนข้างเล็กน้อยกับการวินิจฉัยการติดเชื้อแบคทีเรียในน้ำอุ่นเพาะเลี้ยงพันธุ์ปลาอาหารเพราะปกติเอsubsp salmonicida salmonicida เป็น psychrophilic, ไม่ได้รับการแยกออกจากน้ำอุ่นเพาะเลี้ยงพันธุ์ปลาอาหารเช่นปลาดุกช่องทางหรือปลานิลและส่วนใหญ่เป็นเชื้อโรคของsalmonids (Dalsgaard et al. 1994). เทคนิค PCR ได้รับการพัฒนาก่อนหน้านี้สำหรับบัตรประจำตัวของแต่ละ3 สายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรีย (พอลลาร์et al. 1990 Bader et al. 2003 Bilodeau et al. 2003) ทั้งหมดของการศึกษาเหล่านี้นำมาใช้ขยาย PCR ของเป้าหมายเดียวส่วนยีนของแบคทีเรียที่ได้รับมีเพียงหนึ่งเดียวชุดของไพรเมอร์ ในม-PCR ซึ่งหลายชุดของไพรเมอร์ที่ใช้ในปฏิกิริยาสำหรับการขยายของยีนเป้าหมายหลายความไวในการวินิจฉัยหรือการจำกัด การตรวจสอบโดยทั่วไปถือว่าอยู่ในระดับต่ำ(Rosenfield และ Jaykus ปี 1999 ฌอง et al. 2004 ลี et al, . 2005) ในอย่างน้อย 1 การศึกษาลดลง 10 เท่าในการตรวจสอบความไวเมื่อเทียบกับวิธีPCR เดียวที่ได้รับการบันทึกไว้(ฌอง et al. 2004) ในวิธีการของ m-PCR ที่ใช้สำหรับการตรวจสอบพร้อมกันของ4 เชื้อโรคที่เกี่ยวข้องในการstreptococcosis น้ำอุ่นในเนื้อเยื่อปลา Mata และ al. (2004) บันทึกข้อ จำกัด การตรวจสอบของ 5 × 103 เซลล์ G-1 จากเนื้อเยื่อStreptococcus iniae 1.2 × 104 เซลล์ G-1 สำหรับเอส difficilis 1 × 104 เซลล์ G-1 สำหรับเอส paraubiris และ 2.5 × 103 เซลล์ G-1 สำหรับ Lactococcus garviae ในปัจจุบันการศึกษา M-PCR ไวเกณฑ์การวินิจฉัยสำหรับการตรวจสอบของ3 แบคทีเรียในเนื้อเยื่อก็เปรียบได้กับการที่ได้รับจากการมาตาฮารีเอตอัล (2004)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ทั่วไปในสิ่งแวดล้อมทางน้ำและความเป็นไปได้
เชื้อคู่มีโอกาส ( Hawke &คู 2004 ) .
การตรวจสอบของเราของ . hydrophila ในปลาดุก ictalurus
punctatus ฉีด columnaris F . ictaluri
ยืนยันผลการวิจัยของผู้อื่นที่เชื้อ E .
ictaluri ให้ส่องของก่อนหน้านี้ inapparent .
hydrophila ( นีอิสเบาม์&มอร์ริสัน 2002 ) . ในกรณีส่วนใหญ่
,มากกว่าประสบการณ์ anecdotal กับ
เชื้อผสมใช้ได้ ( Wagner et al . 2002 ) .
จึงต้องเพิ่มความตระหนักของ
เชื้อผสมและการวินิจฉัยอย่างรวดเร็วของโรคในปลาอาหารเหล่านี้ทำให้แบคทีเรียก่อโรคที่สำคัญ 3
,
แจ้งเราเพื่อพัฒนาเทคนิค multoplex PCR .
ในการศึกษา 3 ชุดของไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับแต่ละส่วนของเชื้อสาย
อนุรักษ์ยีนแบคทีเรียชนิด
,ใช้สำหรับการตรวจหา
ฟลาโวแบคทีเรียม columnare การ edwardsiella ictaluri hydrophila และ
. เราได้ออกแบบไพรเมอร์ ซึ่งสอดคล้องกับส่วนเฉพาะสั้น

ภายในเช่น ictaluri 16S rRNA ยีน
การวิเคราะห์ล่าสุดของ 16S - 23s ส่า spacer ภูมิภาคของ rRNA
operons ใน ictaluri ได้เปิดเผยว่า genospecies

กลุ่มนี้เป็นเนื้อเดียวกัน ติดต่อกันภายในผิดเพี้ยนครอบครัว ( panangala et al .
2005 ) การใช้ไพรเมอร์แบบเฉพาะของเราสำหรับ
E ictaluri เบส 16S rRNA ยีนที่สร้างผลิตภัณฑ์ BP 407
10 เก็บแยกจากที่ตั้งทางภูมิศาสตร์ที่แตกต่างกัน เช่น ictaluri
.
สำหรับการฟลาโวแบคทีเรียม columnare เรา
ใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะสำหรับภูมิภาคของ
( - 23s ส่า spacer ภูมิภาคของ columnare ที่
Fได้ออกแบบมาก่อนหน้านี้ และใช้ โดย เวลเกอร์ ร้อยเอ็ด
อัล ( 2005 ) ในทางตรงกันข้ามกับ edwardsiella ictaluri การศึกษาหลายได้แสดงความหลากหลายทางพันธุกรรมที่โดดเด่น

ระหว่าง F . columnare ไอโซเลต ( triyanto &วาคาบายาชิ
1999 Arias et al . 2004 ) แม้พันธุกรรม
, ไพรเมอร์ที่ออกแบบโดย เวลเกอร์ et al . ( 2005 )
สามารถขยาย DNA จากปลาทั้งหมด columnare สายพันธุ์
Fรวมอยู่ในการศึกษาโดย Arias et al . ( 2004 ) และ
10 F . columnare ไอโซเลทเมื่อใช้ใน m-pcr

) ในการศึกษาครั้งนี้ เป็น กับ ฟลาโวแบคทีเรียม edwardsiella
และสมาชิกของสกุลเชื้อจะ autochthonous กับระบบนิเวศสัตว์น้ำจืด

ทั่วโลกและสามารถอยู่รอดได้มากกว่าที่หลากหลายของอุณหภูมิ ( altwegg & geiss
1989 ) จัดการที่ดีของความสับสนและความขัดแย้งได้
การจำแนกทางอนุกรมวิธานของเชื้อก็ชนะ
ชนิดเนื่องจากการขาดความแม่นยำชีวเคมี
และ / หรือคุณสมบัติอื่น ๆและความไม่เพียงพอของฟีโนไทป์
ที่เชื่อถือได้พิมพ์โครงร่าง ( kaznowski 1998 Abbott et al .
2003 ) บนพื้นฐานของ 16S rDNA ลำดับการผลิตทั้งหมดชนิดของพืชสกุลเชื้อปัจจุบัน

รวมภายใต้ครอบครัวที่แตกต่างกัน , aeromonadaceae . ส่วนใหญ่ ถ้าไม่ทั้งหมด โรคปลา
, aในการผลิต cytolytic
สารพิษ aerolysin . ไพรเมอร์คู่ออกแบบมาก่อนหน้านี้
สำหรับ PCR แบบส่วนของ aerolysin ยีน
( Pollard et al . 1990 ) สถิติที่ใช้ใน m-pcr . ไพรเมอร์เหล่านี้ถูกออกแบบมาเพื่อหลีกเลี่ยง

ของภูมิภาคซึ่งในยีนโครงสร้างของ sobria aerolysin
ตรง , Escherichia coli , Staphylococcus aureus และ / หรือแอลฟาทอกซิน ( ไลออ
&จอห์นสัน 1991 )เป้าหมาย 209 BP ส่วนของ aerolysin ยีน

ไพรเมอร์ที่เป็นปัจจุบันใน aerolysin บวกปลาสายพันธุ์
A . hydrophila ที่ใช้ในการศึกษาความไวและความจำเพาะของการวินิจฉัย
M -
PCR assay ถูกประเมินโดยการทดสอบกรดนิวคลีอิกที่เตรียมจาก 10 biochemically ลักษณะสายพันธุ์

ของแบคทีเรีย
columnare ชนิดฟลาโวแบคทีเรียม ,และ edwardsiella ictaluri เชื้อและแบคทีเรียอื่น ๆ
ใน 13 ชนิดที่เป็น phylogenetically ที่เกี่ยวข้องหรือแยกบ่อย

ปลา การเพิ่มปริมาณของดีเอ็นเอเป้าหมายบวก m-pcr
แม่แบบจากแต่ละชนิดของแบคทีเรียกับคาดการณ์ขนาด
amplicons พบว่าแบบทดสอบต่าง ๆที่เกี่ยวข้องระบุ
ไอโซเลทของจุลินทรีย์เชื้อโรค คาดว่าเป็น
Aการทดสอบแยกขาด aerolysin
เป็นลบใน m-pcr ตามลำดับ มีข้อยกเว้น
. salmonicida subsp . salmonicida ไม่มี DNA Amplification
พบใด ๆ ของแบคทีเรียอื่น
รวมอยู่ในการศึกษา อย่างไรก็ตาม การขยายของ A .
salmonicida subsp . salmonicida ดีเอ็นเอค่อนข้าง
เล็กน้อยเพื่อการวินิจฉัยการติดเชื้อแบคทีเรีย
เลี้ยงปลาในน้ำอุ่นอาหารชนิดเนื่องจาก
ทั่วไป . salmonicida subsp . salmonicida เป็นไซโครฟิลิก
, ยังไม่ได้แยกจากน้ำอุ่นอาหารเพาะเลี้ยงปลาชนิดต่างๆ เช่น ช่อง

ปลานิล ปลาดุก หรือ และ ส่วนใหญ่เป็นเชื้อโรคของ salmonids ( dalsgaard
et al . 1994 )
เทคนิค PCR ก่อนหน้านี้ได้รับการพัฒนาสำหรับ
รหัสของแต่ละ 3 แบคทีเรียสายพันธุ์ ( Pollard
et al . 1990Bader et al . 2003 , บิเลอโด้ et al . 2003 ) ทั้งหมด
การศึกษาเหล่านี้ใช้ PCR แบบเดียวส่วนของยีนเป้าหมาย

เดียวให้ซึ่งชุดรองพื้น ใน m-pcr ที่หลายชุดถูกใช้ในปฏิกิริยา PCR

สำหรับเพิ่มปริมาณยีนเป้าหมายหลาย ความไวในการวินิจฉัยหรือ
ยักท่าจะถือโดยทั่วไปจะต่ำ
( & โรเซ่นฟี ลด์ jaykus 1999Jean et al . 2004 ลี et al .
2005 ) อย่างน้อย 1 , 10 เท่าเมื่อเทียบกับการลดลงในความไว

เดี่ยว PCR ถูกบันทึกไว้ ( Jean et al . 2004 ) ใน m-pcr-based วิธีการตรวจหาเชื้อโรคที่เกี่ยวข้องใน 4

สเตรปโตค็อคโคซีส น้ำอุ่นๆ ในเนื้อเยื่อปลาพร้อมกัน มาตา , et al .
( 2004 ) จำกัดบันทึกการตรวจ 5 × 103 เซลล์จี– 1
เนื้อเยื่อสำหรับเชื้อแบคทีเรีย iniae 12 × 104 เซลล์จี– 1
. difficilis 1 × 104 เซลล์จี– 1 . paraubiris และ 2.5 ×
103 เซลล์จี– 1 แลคโตค คัส garviae . ในการศึกษา
, m-pcr เกณฑ์การวินิจฉัยความไว
3 แบคทีเรียในเนื้อเยื่อได้

ที่ได้ Mata et al . ( 2004 )