Intracellular IFN-γ expression in r

Intracellular IFN-γ expression in response to peptide stimulation was performed as previously described (19, 25). A total of 106 brain-derived monocytes or splenocytes per well were cultured for 5 h at 37°C in 200 μl of RPMI 1640 medium, supplemented with 5% fetal calf serum, 10 U of human recombinant interleukin-2, and brefeldin A (Golgiplug [1 μl/ml]; PharMingen) either with or without peptides. The peptides were used at a concentration of 1 μg/ml. Cells were then stained as described above for surface expression of CD8 and incubated overnight at 4°C. For intracellular IFN-γ staining, cells were then fixed and permeabilized using the Cytofix/Cytosperm kit (PharMingen) and stained with a fluorescein isothiocyanate-conjugated monoclonal rat anti-mouse IFN-γ antibody (clone XMG 1.2; PharMingen). Cells were washed and then suspended in PBS containing 2% paraformaldehyde and analyzed by FACSan flow cytometry (Becton-Dickinson).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Intracellular IFN-γนิพจน์ในการตอบสนองกระตุ้นเพปไทด์ทำอธิบายไว้ก่อนหน้านี้เป็น (19, 25) จำนวน 106 monocytes สมองมาหรือ splenocytes ต่อดีมีอ่างสำหรับ h 5 ที่ 37° C ใน μl 200 ของกลาง RPMI 1640 เสริม ด้วยเซรั่มลูกครรภ์ 5%, 10 U interleukin-2 recombinant มนุษย์ และ brefeldin A (Golgiplug [1 μl/ml]; PharMingen) อาจมี หรือไม่ มีเปปไทด์ เปปไทด์ถูกใช้ในความเข้มข้นของ 1 μg / มลเซลล์แล้วสีที่อธิบายข้างต้นสำหรับนิพจน์ผิวของ CD8 และ incubated ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส สำหรับ intracellular IFN-γย้อมสี เซลล์ได้ แล้วคง permeabilized ใช้ชุด Cytofix/Cytosperm (PharMingen) และสีกับการ fluorescein isothiocyanate กลวงโมโนหนูเมาส์ป้องกัน IFN-γแอนติบอดี (โคลน XMG 1.2 PharMingen) เซลล์ถูกล้าง และหยุดชั่วคราวใน PBS ประกอบด้วย paraformaldehyde 2% และวิเคราะห์ โดยเซลล์กระแส FACSan (Becton-สัน)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแสดงออกในเซลล์ IFN-γในการตอบสนองต่อการกระตุ้นเปปไทด์ที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (19, 25) รวมของ 106 monocytes สมองที่ได้มาหรือ splenocytes ต่อกันมาเลี้ยงเป็นเวลา 5 ชั่​​วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสใน 200 ไมโครลิตรของ RPMI 1640 กลางเสริมด้วย 5% ซีรั่มน่องทารกในครรภ์ 10 U ของมนุษย์ recombinant interleukin-2 และ brefeldin A ( Golgiplug [1 ไมโครลิตร / ml]; PharMingen) ทั้งที่มีหรือไม่มีเปปไทด์ เปปไทด์ถูกนำมาใช้ที่ความเข้มข้น 1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร เซลล์ที่ถูกย้อมสีแล้วตามที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับการแสดงออกของพื้นผิวของ CD8 และบ่มค้างคืนที่ 4 ° C สำหรับการย้อมสีเซลล์ IFN-γเซลล์ได้รับการแก้ไขแล้วและ permeabilized ใช้ Cytofix / Cytosperm ชุด (PharMingen) และสีที่มี fluorescein isothiocyanate-ผันโมโนโคลนอลหนูต่อต้านเมาส์แอนติบอดี IFN-γ (โคลน XMG 1.2; PharMingen) เซลล์ที่ถูกล้างและระงับแล้วในพีบีเอสที่มี paraformaldehyde 2% และวิเคราะห์โดยโฟ FACSan (Becton-ดิกคินสัน)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ภายในหนึ่งγ
การแสดงออกในการตอบสนองต่อการกระตุ้นเปปไทด์ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 19 , 25 ) ทั้งหมด 106 brain-derived โมโนไซท หรือเติบโตทางเศรษฐกิจต่อบ่อเพาะเลี้ยง 5 H ที่ 37 ° C ในμ RPMI 1640 200 ลิตร medium เสริมด้วยเซรั่ม 5 % ของลูกวัว , 10 U ของการเรียนแบบร่วมมือที่ใช้มนุษย์และ brefeldin ( golgiplug [ 1 μ L / ml ] ;pharmingen ) มีหรือไม่มีเปปไทด์ การใช้สารที่ระดับความเข้มข้น 1 กรัม / มิลลิลิตรμเซลล์แล้วย้อมสีตามที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับการแสดงออกของพื้นผิวสำหรับบ่มค้างคืนที่ 4 องศา สำหรับการหนึ่งγการย้อมสีเซลล์มีการแก้ไขแล้ว permeabilized และใช้ cytofix / cytosperm Kit ( pharmingen ) และย้อมด้วยไอโซไธโอไซยาเนต conjugated ี่หนูป้องกันเมาส์ IFN - γ โมโนโคลนอลแอนติบอดี ( โคลน xmg 1.2 ; pharmingen ) เซลล์มีการล้างและแขวนลอยใน PBS ที่มี 2% พาราฟอร์มาลดิไฮด์ และวิเคราะห์ข้อมูลด้วยเครื่องนับเซลล์ facsan ( เบคตอน
ดิกคินสัน )