variability of the wild cranes will

variability of the wild cranes will provide important ref-
erence data to assist in the effective genetic management of
the captive cranes in Japan.
Materials and methods
Sampling and DNA analyses
Blood samples were collected from captured juvenile
cranes within the framework of the annual banding project
operated by the Ministry of the Environment normally
from June to July, when juveniles are flightless (at the age
of approximately 1.5–3.0 months) and remain with their
parents around the nests. The locations where the juveniles
were captured were recorded. In this study, we used 80
blood samples collected from 1995 to 2006 across the
entire breeding range in eastern Hokkaido (approximately
70 % of them were collected between 1999 and 2005).
Because an adult pair bond usually lasts for years until the
partner dies, and because a breeding pair shows strong
fidelity to the nesting territory (Masatomi 2000), all the
samples were derived from different nest sites to avoid the
inclusion of closely related individuals. The collected
samples were grouped to Nemuro (n = 42), Kushiro
(n = 24), and Tokachi (n = 14), according to the geo-
graphic locations of the juvenile capture sites (Fig. 1). This
allows us to assess the genetic differences between Kushiro
and the other regions where other genetically distinct
groups may have persisted when the Kushiro group was
rediscovered. A few nests were found in northern Hok-
kaido in recent years (Masatomi et al. 2004), but their
number is too small to be considered a functional popula-
tion; thus, we did not include them in this study.
The blood samples were preserved in 100 % ethanol and
stored at -20 C until DNA extraction. DNA was extrac-
ted using the QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Tokyo,
Japan) following the manufacturer’s protocol. Eighteen
microsatellite loci were used for multilocus genotyping
(Gj-M8, Gj-M11a, Gj-M13, Gj-M15, Gj-M34, Gj-M40,
and Gj-M48b in Hasegawa et al. 2000; Gram6, Gram11,
Gram17, Gram20, Gram22, Gram24, Gram25, Gram32a,
Gram41, Gram42, and Gram45 in Jones et al. 2010). PCR
condition and cycling profile for each locus followed
Hasegawa et al. (2000) and Jones et al. (2010). The PCR
products were analyzed on an ABI PRISM

3100 genetic
analyzer (Applied Biosystems, Foster City, California) and
the genotyping data were collected using the program
GeneScan (Applied Biosystems). We sequenced a part of
the mtDNA control region (418 bp) to visualize the spatial
distribution of mtDNA haplotypes in Hokkaido. PCR
amplification and sequencing were performed following
Hasegawa et al. (1999).
Data analyses
The observed number of alleles per locus (A) and both
expected heterozygosity (H E ) and observed heterozygosity
(H O ) were calculated using the program GENEPOP 3.4
(Raymond and Rousset 1995). Allelic richness (AR), which
was corrected by the smallest sample size, was calculated
by the program FSTAT ver. 2.9.3.2 (Goudet 2001). Link-
age disequilibrium between all pairs of loci and Hardy–
Weinberg equilibrium for each locus in each group and
overall were assessed by the program GENEPOP 3.4,
where the sequential Bonferroni correction was used for
multiple tests (Rice 1989). The program MICRO-
CHECKER (Van Oosterhout et al. 2004) was used to check
the occurrence of null alleles and large allele dropout.
We assessed the genetic structure by several approaches.
First, the degree of genetic differentiation between each
pair of groups was evaluated by the fixation index, F ST (h;
Weir and Cockerham 1984), and tested by the log-likeli-
hood G-test using the program FSTAT ver. 2.9.3.2. Overall
F ST was estimated by the analysis of molecular variance
and tested for a significant difference from zero by 10,100
permutations using the program Arlequin ver. 3.11 (Ex-
coffier et al. 2005). Differences in the genetic diversity (i.e.
H E and AR) among the three groups were assessed by the
analysis of variance (ANOVA), where the loci served as
error. Prior to ANOVA, the data were confirmed not to
violate the assumption of normality and equality of vari-
ance by Shapilo–Wilk test and Bartlett’s test, respectively.
To test for a pattern of isolation by distance as a potential
cause of the genetic structure, we conducted spatial auto-
correlation analysis. We used Nason’s estimator of kinship
coefficient (F ij ; Loiselle et al. 1995) as a measure of pair-
wise genetic similarity between individuals. Negative val-
ues are possible and are interpreted as individuals being
less similar than expected by chance. We calculated the
average F ij between pairs of individuals, whose geographic
separation falls within a specified distance interval, by the
program SPAGeDi ver. 1.4 (Hardy and Vekemans 2002).
The seven distance intervals were defined by maintaining
similar numbers of pairwise comparisons. The significance
of the average kinship coefficients in each distance interval
was tested by permuting the spatial locations of individuals
10,000 times, which is equivalent to a Mantel test (Hardy
and Vekemans 2002), using the program SPAGeDi ver.
1.4. We repeated the analysis using another two distance
intervals (five and ten intervals) to ensure consistency of
the results. If a pattern of isolation by distance is present,
the average kinship coefficient will decrease as the distance
interval increases. Finally, Bayesian clustering analysis
implemented in the program STRUCTURE ver. 2.3.3
(Pritchard et al. 2000; Falush et al. 2003) was used to infer
the genetic structure without an a priori definition ofgroups. We used the admixture model with correlated
allele frequencies. Five independent runs were performed
for each K value (number of clusters) from 1 to 6 with
200,000 MCMC steps and 100,000 burn-in steps. We
determined the most likely number of clusters based on the
average log-likelihood value across the 5 runs.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จะทำให้ความแปรผันของเครนป่าสำคัญอ้างอิง-erence ข้อมูลเพื่อช่วยในการจัดการทางพันธุกรรมที่มีประสิทธิภาพของเชลยเครนในญี่ปุ่นวัสดุและวิธีการวิเคราะห์ดีเอ็นเอและการสุ่มตัวอย่างตัวอย่างเลือดที่เก็บจากเยาวชนจับเครนภายในกรอบของโครงการ banding ประจำปีดำเนินการ โดยกระทรวงสิ่งแวดล้อมปกติเดือนมิถุนายน-กรกฎาคม เมื่อ juveniles flightless (อายุประมาณ 1.5 – 3.0 เดือน) และยังคงอยู่กับพวกเขาผู้ปกครองสถานรัง สถานที่ juvenilesถูกจับถูกบันทึก ในการศึกษานี้ เราใช้ 80เลือดตัวอย่างที่เก็บรวบรวมจาก 1995 2006 ระหว่างการพันธุ์ทั้งช่วงในฮอกไกโดตะวันออก (โดยประมาณ70% ของพวกเขาถูกเก็บรวบรวมระหว่าง 1999 และ 2005)เนื่องจากมีพันธะคู่ผู้ใหญ่ปกติเวลาปีจนการหุ้นส่วนตาย และคู่ผสมพันธุ์แสดงแข็งแรงfidelity อาณาเขตซ้อน (Masatomi 2000), ทั้งหมดตัวอย่างได้มาจากเว็บไซต์รังอื่นเพื่อหลีกเลี่ยงการรวมของบุคคลที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด การรวบรวมตัวอย่างถูกจัดกลุ่มให้เนะมุโระ (n = 42), คุชิโร(n = 24), และโอะ (n = 14), ตาม geo -ตำแหน่งกราฟิกของอเมริกาจับเยาวชน (Fig. 1) นี้ช่วยให้เราสามารถประเมินความแตกต่างทางพันธุกรรมระหว่างคุชิโรและภูมิภาคอื่น ๆ ที่แปลงพันธุกรรมอื่น ๆ ทั้งหมดกลุ่มนี้อาจมี persisted เมื่อกลุ่มคุชิโรrediscovered บางรังพบในภาคเหนือหก-kaido ในปีที่ผ่านมา (Masatomi et al. 2004), แต่พวกเขาหมายเลขมีขนาดเล็กเกินไปจะถือว่าเป็นหน้าที่ popula-สเตรชัน ดังนั้น เราไม่มีพวกเขาในการศึกษานี้มีเก็บตัวอย่างเลือดในเอทานอล 100% และเก็บไว้ที่ -20 C จนสกัดดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอถูก extrac-เท็ดใช้ QIAamp ดีเอ็นเอขนาดเล็กชุดสินค้า (Qiagen โตเกียวญี่ปุ่น) ต่อไปนี้ของโพรโทคอลการ เอททีนใช้ชนิด microsatellite loci สำหรับ multilocus genotyping(Gj-M8, Gj M11a, Gj M13, Gj M15, Gj M34, Gj-บีเอ็ม M40และ Gj-M48b ใน Hasegawa et al. 2000 Gram6, Gram11Gram17, Gram20, Gram22, Gram24, Gram25, Gram32aGram41, Gram42 และ Gram45 ใน Jones et al. 2010) PCRตามเงื่อนไขและ profile ขี่จักรยานในแต่ละโลกัสโพลHasegawa et al. (2000) และ al. et โจนส์ (2010) การ PCRมีวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์บนปริซึมเป็นลักชัวรี่พันธุกรรม 3100วิเคราะห์ (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ แคลิฟอร์เนีย) และการ genotyping ได้รวบรวมข้อมูลโดยใช้โปรแกรมGeneScan (Biosystems ใช้) เราเรียงลำดับเป็นส่วนหนึ่งของพื้นที่ควบคุม mtDNA (418 bp) เห็นภาพพื้นที่กระจายของ mtDNA haplotypes ในฮอกไกโด PCRamplification และจัดลำดับได้ดำเนินการดังต่อไปนี้Hasegawa et al. (1999)วิเคราะห์ข้อมูลสังเกตจำนวน alleles ต่อโลกัสโพล (A) และทั้งสองคาด heterozygosity (H E) และสังเกต heterozygosity(H O) คำนวณได้โดยใช้โปรแกรม GENEPOP 3.4(เรย์มอนด์และ Rousset 1995) ร่ำรวย allelic (AR), ซึ่งถูกแก้ไข โดยขนาดตัวอย่างเล็กที่สุด คำนวณโดยโปรแกรม FSTAT ไม่ 2.9.3.2 (Goudet 2001) เชื่อมโยง-disequilibrium อายุระหว่างคู่ของ loci Hardy –Weinberg สมดุลสำหรับแต่ละโลกัสโพลในแต่ละกลุ่ม และโดยรวม ที่ประเมิน โดยโปรแกรม GENEPOP 3.4ที่ใช้สำหรับการแก้ไข Bonferroni ตามลำดับหลายการทดสอบ (ข้าว 1989) โปรแกรม MICRO-ตัวตรวจสอบ (Van Oosterhout et al. 2004) ถูกใช้เพื่อตรวจสอบการเกิดขึ้นของ null alleles และ allele ใหญ่เป็นถอนเราประเมินโครงสร้างทางพันธุกรรม โดยวิธีการต่าง ๆแรก ระดับของการสร้างความแตกต่างทางพันธุกรรมระหว่างแต่ละคู่ของกลุ่มถูกประเมิน โดยดัชนี fixation เซนต์ F (hฝายและ Cockerham 1984), และทดสอบ โดยล็อก-likeli -ควันใช้ไม่ FSTAT ของโปรแกรม 2.9.3.2 ทดสอบ G โดยรวมเซนต์ F ถูกประเมิน โดยการวิเคราะห์ผลต่างของโมเลกุลและทดสอบสำหรับ significant แตกต่างจากศูนย์โดย 10,100ใช้ไม่ Arlequin ของโปรแกรม 3.11 (อดีต-สับcoffier et al. 2005) ส่วนต่างในความหลากหลายทางพันธุกรรม (เช่นH E และ AR) ระหว่างกลุ่ม 3 ถูกประเมินโดยการวิเคราะห์ของผลต่าง (การวิเคราะห์ความแปรปรวน), loci ทำหน้าที่เป็นที่ข้อผิดพลาด ก่อนการวิเคราะห์ความแปรปรวน ข้อมูลไม่ confirmed ไปขัดต่อสมมติฐานของ normality และความเท่าเทียมกันของวารี-ance Shapilo – Wilk ทดสอบและทดสอบในบาร์ตเลตของ ตามลำดับการทดสอบแบบแยกโดยระยะทางเป็นเป็นไปทำให้โครงสร้างทางพันธุกรรม เราดำเนินการพื้นที่อัตโนมัติ-การวิเคราะห์สหสัมพันธ์ เราใช้ประมาณของ Nason ของญาติcoefficient (ij แค F Loiselle et al. 1995) เป็นวัดคู่-ปัญญาคล้ายคลึงทางพันธุกรรมระหว่างบุคคล ค่าลบ-ues เป็นไปได้ และการแปลความหมายเป็นบุคคลน้อยเหมือนกันกว่าที่คาดไว้โดยบังเอิญ เราได้ij แค F ค่าเฉลี่ยระหว่างคู่ของบุคคล ที่ทางภูมิศาสตร์แยกอยู่ภายในช่วงระยะ specified โดยการโปรแกรมไม่ SPAGeDi 1.4 (Hardy และ Vekemans 2002)ช่วงระยะเจ็ดถูก defined โดยรักษาจำนวนเปรียบเทียบแพร์ไวส์คล้าย Significanceของ coefficients ญาติเฉลี่ยในแต่ละช่วงระยะทดสอบ โดย permuting ตำแหน่งพื้นที่ของแต่ละบุคคล10000 ครั้ง ซึ่งจะเท่ากับการทดสอบหิ้ง (Hardyและ Vekemans 2002), ใช้ไม่ SPAGeDi โปรแกรม1.4. เราซ้ำการวิเคราะห์ใช้อีกระยะที่สองช่วงเวลา (five และช่วงสิบ) เพื่อตรวจสอบความสอดคล้องของผลลัพธ์ ถ้ารูปแบบแยกโดยระยะทางอยู่coefficient ญาติเฉลี่ยจะลดลงเป็นระยะช่วงเพิ่มขึ้น สุดท้าย ทฤษฎีระบบคลัสเตอร์การวิเคราะห์ดำเนินการในการโปรแกรมโครงสร้างไม่ 2.3.3(Pritchard et al. 2000 Falush et al. 2003) ใช้ในการอนุมานโครงสร้างทางพันธุกรรม โดยมี ofgroups definition priori ความ เราใช้แบบผลิตมี correlatedคลื่นความถี่ของ allele ทำงานอิสระห้าดำเนินสำหรับ K แต่ละค่า (หมายเลขของคลัสเตอร์) จาก 1 ถึง 6 มีตอน MCMC 200000 และ 100000 เขียนในขั้นตอน เราdetermined the most likely number of clusters based on theaverage log-likelihood value across the 5 runs.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ความผันแปรของป่าเครนจะให้สำคัญอ้างอิง --
erence ข้อมูลเพื่อช่วยในการจัดการที่มีประสิทธิภาพทางพันธุกรรมของ
เชลยเครนในญี่ปุ่น

) และวัสดุและวิธีการเก็บตัวอย่างดีเอ็นเอวิเคราะห์

เครนจากจับเยาวชนภายในกรอบของโครงการ ดำเนินการโดยปีแถบ
กระทรวงสิ่งแวดล้อมปกติ
จากเดือนมิถุนายน ถึง กรกฎาคม