- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2. Materials and methods2.1. Experi
2. Materials and methods
2.1. Experiment material and planting
Supersweet corn seeds (F1 hybrid with sh2), cv. Supersweet 17,were used in these studies. The hybrid seeds were produced by synchronous hand cross-pollination of the parental inbreds in the field at the experimental farm of Zhejiang University using production practices common for the region.
2.2. Seed harvest
Normally, it takes 30–40 days for supersweet corn seeds to fully mature but seed germination is possible 14 days after pollination (Cao et al., 2008b). Supersweet corn ears were harvested at different developmental stages from 14 to 42 days(at an interval of 4 days) after pollination (DAP).
At each harvest,10 plants were randomly chosen and the first ear from the top of the plant was harvested by hand. Seeds from the middle part of supersweet corn ears were threshed by hand and bulked for further tests
2.3. Germination test
Three replications of 50 seeds for each harvest were used, each50 seeds were placed in a 12 cm 18 cm germination box containing wet sand. Then, seeds were kept in a germination chamber at 25 8C with a diurnal cycle of 12 h light and 12 h darkness for 7 days. Seeds were considered germinated when a 1 mm length radicle protruded through the seed coat. The number of germinated seeds was counted daily. The energy of germination and germination percentage were calculated after 4 and 7 days,respectively. The germination index (GI = S(Gt Tt1)) was calculated by the method of Zhang et al. (2007) where Gt is the number of the germinated seeds on day t and Tt is the time corresponding
to Gt (in days). The energy of germination was the percentage of germinated seeds 4 days after planting relative to the number of seeds tested.
2.4. Measurements of physiological parameters
The seed length, width and thickness of 30 seeds were measured at each harvest manually with a ruler. The fresh and dry weights of 100 seeds were recorded at each harvest. Dry weights were recorded after 24 h in an oven at 80 8C (Cao et al.,2008a).The evaluation of kernel nutritive quality was performed with 3replications of 20 seeds for each harvest. Soluble protein was extracted from the seeds and determined by colorimetric assay with Coomassie Brilliant Blue G250 (Li, 2000). The concentration of total soluble sugar was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid method (Jiang, 1999)Malondialdehyde (MDA) concentration was determined using the thiobarbituric acid (TBA) reaction as described by Zhang et al. (2007). Briefly, 0.3 g fresh weight (FW) of corn seeds for each replication were collected at 14, 18, 22, 26, 30,34, 38 and 42 days after pollination, and homogenized in 3 ml of 5% trichloroacetic acid (TCA). The homogenate was centrifuged at 3600 g for 10 min and 2 ml of 0.67% TBA was added to 2 ml of supernatant. The mixture was heated at 100 8C for 30 min, cooled to room temperature and then centrifuged at 1800 g for 5 min. The optical density of the supernatant was measured at 450 nm, 532 nm and 600 nm. The MDA concentration was calculated according to the follow formula:C (mmol l1) = 6.45(A532 A600) 0.56A450, then the MDA concentration (nmol g1 FW) was calculated.
Electrolyte leakage as a measurement for membrane permeability was determined according to the method of Liu et al. (2000).Fresh seeds were cut into segments of about 5 mm respectively.Each tissue (0.2 g FW) was placed in the test tube with 10 ml deionized water and covered with a plug. After incubation at 25 8C for 6 h, the electrolyte leakage of the tissue was measured using a
conductivity meter (DDS-11A, made in Shanghai, China), the value was named E1. Subsequently, the test tube was kept in water at 100 8C for 30 min, and then cooled to 25 8C, the second electrolyte
leakage was measured as E2. The electrolyte leakage of deionized water was named E0. The relative electrolyte leakage (REL) was
calculated as follows:
REL ¼ E1 E0
E2 E0 100%
P
Peroxidase (POD) and catalase (CAT) activities of from seeds of each harvest were measured. Seeds (0.5 g FW) were harvested and homogenized in 10 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 0.1 mM EDTA and 2 mM dithiothreitol. The homogenate was centrifuged at 10,000 g for 15 min. The supernatant was used for enzyme assays and all of the extraction steps were carried out at 1–4 8C (Trevor and Fletcher, 1994).
POD activity was measured according to the method of Qiu et al. (2005). The assay mixture consisted of 3 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 1% guaiacol, 0.4% H2O2 and enzyme extract. The increase in absorbance due to oxidation of guaiacol was measured at 470 nm. Enzyme activity was calculated in terms of mmol of guaiacol oxidized min1 g1 fresh weight at 37 8C, and was expressed as U g1 FW min1. CAT activity was measured at 37 8C according to Trevor and Fletcher (1994). The enzyme assay contained 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.4% H2O2 and enzyme extract in a total volume of 4 ml. CAT activity was estimated by the decrease in absorbance of H2O2 at 240 nm and
was expressed as U g1 FW min1. Both POD and CAT were determined for three replications.
2.5. Polyamine concentration assay
PAs concentrations were measured by HPLC according to the method of Flores and Galston (1982) with minor modifications. 0.3 g FW seeds of each harvest were homogenized with 3 ml 5% (w/v) chilling perchloric acid using a cooled mortar and pestle.The homogenates were kept in an ice bath for 1 h, and thencentrifuged at 23,000 g for 30 min at 4 8C; the supernatant was transferred to new centrifugal tube and were stored at 70 8C for quantification of PAs. Seed extracts were benzoylated. One ml 2 mol l1 NaOH was mixed with 500 ml supernatant. After the addition of 10 ml benzoyl chloride, the samples were vortexed for 20 s then incubated for 20 min at 37 8C. Following the high temperature incubation, 2 ml saturated NaCl was added. Benzoyl-polyamines were extracted in 2 ml diethyl ether and vortexed for 10 s. After centrifugation at 1500 g for 5 min at 4 8C, 1 ml of the ether phase was collected, evaporated to dryness under a stream of warm air, and redissolved in 100 ml
methanol. The benzoylated extracts were filtered through a 0.22 mm membrane filter, and then eluted at room temperature through a 6.0 mm 150 mm, 5 mm particle size reverse-phase (C18) column (Shim-Pack CLC-ODS). PAs peaks were detected by an SPD-20A (Shimadzu) absorbance detector at 254 nm. The mobile phases consisted of methanol: water (64:36), at a flow rate of
1.0 ml min1. Three polyamine standards (Sigma Chemical Co.) of Put, Spd and Spm were prepared at different concentrations for the development of standard curves.
2.6. Statistical analysis
Statistical analysis was performed using the SAS software.Three replications were conducted for the parameter measure ments. All obtained percentage values were arcsine-transformed prior to statistical analysis. Regression equations between polyamine concentrations and physiological parameters during seed development were calculated.
2.1. Experiment material and planting
Supersweet corn seeds (F1 hybrid with sh2), cv. Supersweet 17,were used in these studies. The hybrid seeds were produced by synchronous hand cross-pollination of the parental inbreds in the field at the experimental farm of Zhejiang University using production practices common for the region.
2.2. Seed harvest
Normally, it takes 30–40 days for supersweet corn seeds to fully mature but seed germination is possible 14 days after pollination (Cao et al., 2008b). Supersweet corn ears were harvested at different developmental stages from 14 to 42 days(at an interval of 4 days) after pollination (DAP).
At each harvest,10 plants were randomly chosen and the first ear from the top of the plant was harvested by hand. Seeds from the middle part of supersweet corn ears were threshed by hand and bulked for further tests
2.3. Germination test
Three replications of 50 seeds for each harvest were used, each50 seeds were placed in a 12 cm 18 cm germination box containing wet sand. Then, seeds were kept in a germination chamber at 25 8C with a diurnal cycle of 12 h light and 12 h darkness for 7 days. Seeds were considered germinated when a 1 mm length radicle protruded through the seed coat. The number of germinated seeds was counted daily. The energy of germination and germination percentage were calculated after 4 and 7 days,respectively. The germination index (GI = S(Gt Tt1)) was calculated by the method of Zhang et al. (2007) where Gt is the number of the germinated seeds on day t and Tt is the time corresponding
to Gt (in days). The energy of germination was the percentage of germinated seeds 4 days after planting relative to the number of seeds tested.
2.4. Measurements of physiological parameters
The seed length, width and thickness of 30 seeds were measured at each harvest manually with a ruler. The fresh and dry weights of 100 seeds were recorded at each harvest. Dry weights were recorded after 24 h in an oven at 80 8C (Cao et al.,2008a).The evaluation of kernel nutritive quality was performed with 3replications of 20 seeds for each harvest. Soluble protein was extracted from the seeds and determined by colorimetric assay with Coomassie Brilliant Blue G250 (Li, 2000). The concentration of total soluble sugar was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid method (Jiang, 1999)Malondialdehyde (MDA) concentration was determined using the thiobarbituric acid (TBA) reaction as described by Zhang et al. (2007). Briefly, 0.3 g fresh weight (FW) of corn seeds for each replication were collected at 14, 18, 22, 26, 30,34, 38 and 42 days after pollination, and homogenized in 3 ml of 5% trichloroacetic acid (TCA). The homogenate was centrifuged at 3600 g for 10 min and 2 ml of 0.67% TBA was added to 2 ml of supernatant. The mixture was heated at 100 8C for 30 min, cooled to room temperature and then centrifuged at 1800 g for 5 min. The optical density of the supernatant was measured at 450 nm, 532 nm and 600 nm. The MDA concentration was calculated according to the follow formula:C (mmol l1) = 6.45(A532 A600) 0.56A450, then the MDA concentration (nmol g1 FW) was calculated.
Electrolyte leakage as a measurement for membrane permeability was determined according to the method of Liu et al. (2000).Fresh seeds were cut into segments of about 5 mm respectively.Each tissue (0.2 g FW) was placed in the test tube with 10 ml deionized water and covered with a plug. After incubation at 25 8C for 6 h, the electrolyte leakage of the tissue was measured using a
conductivity meter (DDS-11A, made in Shanghai, China), the value was named E1. Subsequently, the test tube was kept in water at 100 8C for 30 min, and then cooled to 25 8C, the second electrolyte
leakage was measured as E2. The electrolyte leakage of deionized water was named E0. The relative electrolyte leakage (REL) was
calculated as follows:
REL ¼ E1 E0
E2 E0 100%
P
Peroxidase (POD) and catalase (CAT) activities of from seeds of each harvest were measured. Seeds (0.5 g FW) were harvested and homogenized in 10 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 0.1 mM EDTA and 2 mM dithiothreitol. The homogenate was centrifuged at 10,000 g for 15 min. The supernatant was used for enzyme assays and all of the extraction steps were carried out at 1–4 8C (Trevor and Fletcher, 1994).
POD activity was measured according to the method of Qiu et al. (2005). The assay mixture consisted of 3 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 1% guaiacol, 0.4% H2O2 and enzyme extract. The increase in absorbance due to oxidation of guaiacol was measured at 470 nm. Enzyme activity was calculated in terms of mmol of guaiacol oxidized min1 g1 fresh weight at 37 8C, and was expressed as U g1 FW min1. CAT activity was measured at 37 8C according to Trevor and Fletcher (1994). The enzyme assay contained 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.4% H2O2 and enzyme extract in a total volume of 4 ml. CAT activity was estimated by the decrease in absorbance of H2O2 at 240 nm and
was expressed as U g1 FW min1. Both POD and CAT were determined for three replications.
2.5. Polyamine concentration assay
PAs concentrations were measured by HPLC according to the method of Flores and Galston (1982) with minor modifications. 0.3 g FW seeds of each harvest were homogenized with 3 ml 5% (w/v) chilling perchloric acid using a cooled mortar and pestle.The homogenates were kept in an ice bath for 1 h, and thencentrifuged at 23,000 g for 30 min at 4 8C; the supernatant was transferred to new centrifugal tube and were stored at 70 8C for quantification of PAs. Seed extracts were benzoylated. One ml 2 mol l1 NaOH was mixed with 500 ml supernatant. After the addition of 10 ml benzoyl chloride, the samples were vortexed for 20 s then incubated for 20 min at 37 8C. Following the high temperature incubation, 2 ml saturated NaCl was added. Benzoyl-polyamines were extracted in 2 ml diethyl ether and vortexed for 10 s. After centrifugation at 1500 g for 5 min at 4 8C, 1 ml of the ether phase was collected, evaporated to dryness under a stream of warm air, and redissolved in 100 ml
methanol. The benzoylated extracts were filtered through a 0.22 mm membrane filter, and then eluted at room temperature through a 6.0 mm 150 mm, 5 mm particle size reverse-phase (C18) column (Shim-Pack CLC-ODS). PAs peaks were detected by an SPD-20A (Shimadzu) absorbance detector at 254 nm. The mobile phases consisted of methanol: water (64:36), at a flow rate of
1.0 ml min1. Three polyamine standards (Sigma Chemical Co.) of Put, Spd and Spm were prepared at different concentrations for the development of standard curves.
2.6. Statistical analysis
Statistical analysis was performed using the SAS software.Three replications were conducted for the parameter measure ments. All obtained percentage values were arcsine-transformed prior to statistical analysis. Regression equations between polyamine concentrations and physiological parameters during seed development were calculated.
0/5000
2. วัสดุและวิธีการ2.1 การทดสอบวัสดุและการปลูกเมล็ดข้าวโพด supersweet (F1 ผสมกับ sh2), พันธุ์ Supersweet 17 ใช้ในการศึกษาเหล่านี้ เมล็ดพันธุ์ไฮบริดถูกผลิต โดยการผสมเกสรแบบซิงโครนัสมือของ inbreds โดยผู้ปกครองในฟิลด์ที่ฟาร์มทดลองใช้ผลิตปฏิบัติทั่วไปในภูมิภาคที่มหาวิทยาลัยเจ้อเจียง2.2. เมล็ดการเก็บเกี่ยวปกติ ใช้เวลา 30 – 40 วันสำหรับผู้ใหญ่ทั้งหมด แต่เมล็ดการงอกเมล็ดข้าวโพด supersweet ได้ 14 วันหลังจาก pollination (Cao et al., 2008b) หู supersweet ข้าวโพดเก็บเกี่ยวที่แตกต่างพัฒนาขั้น 14 42 วัน (ในช่วงวันที่ 4) หลังจาก pollination (DAP) ในฤดูเก็บเกี่ยว 10 ต้นไม้ที่ถูกเลือกแบบสุ่ม และหูแรกจากด้านบนของพืชถูกเก็บเกี่ยวด้วยมือ เมล็ดพืชจากส่วนกลางของหูข้าวโพด supersweet threshed ด้วยมือ และ bulked ทดสอบเพิ่มเติม2.3 ทดสอบการงอกใช้ระยะที่สามของเมล็ด 50 สำหรับฤดูเก็บเกี่ยว each50 เมล็ดพันธุ์ไว้ในกล่อง 18 ซม. 12 ซม.การงอกประกอบด้วยทรายเปียก เมล็ดถูกเก็บไว้ในหอการงอกที่ 8C 25 กับวงจร diurnal แสง 12 h และ 12 h ความมืด 7 วันแล้ว เมล็ดได้ถือเปลือกงอก radicle ความยาว 1 มม.แบบ protruded ผ่านหุ้มเมล็ด นับจำนวนเมล็ดเปลือกงอกทุกวัน พลังงานของการงอกและเปอร์เซ็นต์การงอกถูกคำนวณหลังจากวันที่ 4 และ 7 ตามลำดับ ดัชนีการงอก (GI = S(Gt Tt1)) ได้คำนวณ โดยวิธีของ Zhang et al. (2007) ที่ Gt จำนวนเมล็ดเปลือกงอกในวันที่ t และ Tt เวลาสอดคล้องกันกับ Gt (เป็นวัน) พลังงานของการงอกมีเปอร์เซ็นต์ของเมล็ดเปลือกงอก 4 วันหลังจากปลูกสัมพันธ์กับจำนวนของเมล็ดพืชทดสอบ2.4 การวัดพารามิเตอร์สรีรวิทยาเมล็ดยาว ความกว้าง และความหนาของเมล็ด 30 ถูกวัดที่เก็บเกี่ยวแต่ละด้วยตนเองด้วยไม้บรรทัด น้ำหนักสด และแห้งของเมล็ด 100 ถูกบันทึกในฤดูเก็บเกี่ยว ได้รับการบันทึกน้ำหนักแห้งหลังจาก 24 ชมในเตาอบที่ 80 8C (Cao et al., 2008a)ดำเนินการประเมินคุณภาพวิจัยเคอร์เนลกับ 3replications ของเมล็ด 20 สำหรับการเก็บเกี่ยวแต่ละ โปรตีนที่ละลายน้ำสกัดจากเมล็ด และกำหนด โดยวิเคราะห์เทียบเคียงกับ Coomassie G250 สีฟ้าสดใส (Li, 2000) ความเข้มข้นของน้ำตาลที่ละลายน้ำทั้งหมดถูกกำหนด โดยวิธีกรด 3,5-dinitrosalicylic (เจียง 1999) เข้มข้น Malondialdehyde (MDA) ถูกกำหนดโดยใช้ปฏิกิริยากรด (TBA) thiobarbituric ดังที่โดย Zhang et al. (2007) สั้น ๆ 0.3 g สดน้ำหนัก (FW) ของเมล็ดข้าวโพดสำหรับแต่ละแบบจำลองถูกเก็บที่ 14, 18, 22, 26, 30,34, 38 และ 42 วันหลัง pollination และมล homogenized เป็นกลุ่มใน 3 ของกรด 5% trichloroacetic (TCA) Homogenate ถูก centrifuged ที่ 3600 g สำหรับ 10 นาที และ 2 ml ของ TBA 0.67% ถูกเพิ่ม 2 ml ของ supernatant ส่วนผสมถูกความร้อนที่ 100 8C ใน 30 นาที ระบายความร้อนด้วยอุณหภูมิห้อง และ centrifuged แล้ว ที่ g 1800 สำหรับ 5 นาที มีที่วัดความหนาแน่นออปติคัลของ supernatant 450 nm, 532 nm และ 600 nm มีคำนวณความเข้มข้นของ MDA ตามตามสูตร: C (mmol l1) = 6.45(A532 A600) 0.56A450 แล้วความเข้มข้นของ MDA (nmol g1 FW) คำนวณอิเล็กโทรรั่วเป็นวัดสำหรับเมมเบรน permeability ได้กำหนดตามวิธีการของหลิวและ al. (2000)เมล็ดสดถูกตัดเป็นกลุ่มประมาณ 5 มม.ตามลำดับแต่ละเนื้อเยื่อ (0.2 g FW) ถูกวางลงในหลอดทดสอบน้ำ 10 ml deionized และครอบคลุมพร้อมปลั๊กแบบ หลังจากบ่มที่ 25 8C สำหรับ 6 h อิเล็กโทรการรั่วไหลของเนื้อเยื่อถูกวัดโดยใช้แบบนำมิเตอร์ (ทพ-11A ในเซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน), ค่าชื่อว่า E1 ในเวลาต่อมา หลอดทดสอบเก็บไว้ในน้ำที่ 8C 100 สำหรับ 30 นาที และระบายความร้อนด้วยการ 25 8C อิเล็กโทรที่สองแล้วรั่วไหลถูกวัดเป็น E2 การรั่วไหลของอิเล็กโทรน้ำ deionized ได้ชื่อ E0 มีการรั่วไหลอิเล็กโทรสัมพัทธ์ (REL)คำนวณดังนี้:E0 ¼ E1 RELE2 E0 100%Pมีวัด peroxidase (POD) และ catalase (CAT) กิจกรรมจากเมล็ดพืชของฤดูเก็บเกี่ยว เมล็ด (0.5 g FW) ถูกเก็บเกี่ยว แล้ว homogenized เป็นกลุ่มใน 10 ml ของ 50 มม.ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.8) ประกอบด้วย 0.1 mM EDTA และ 2 มม. dithiothreitol Homogenate ถูก centrifuged ที่ g 10000 สำหรับ 15 นาที ใช้สำหรับเอนไซม์ assays supernatant และขั้นตอนการสกัดทั้งหมดได้ดำเนินการ 1 – 4 8 C (เทรเวอร์และเฟล็ตเชอร์ 1994)กิจกรรมเท่านั้นถูกวัดตามวิธีของคู et al. (2005) วิเคราะห์ส่วนผสมประกอบด้วย 3 ml 50 มม.ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0), guaiacol 1%, 0.4% H2O2 และสารสกัดจากเอนไซม์ การเพิ่มขึ้นเนื่องจากการเกิดออกซิเดชันของ guaiacol absorbance มีวัดที่ 470 nm เอนไซม์ถูกคำนวณใน mmol ของน้ำหนักสดของ g1 min1 guaiacol ออกซิไดซ์ที่ 37 8C และถูกแสดงเป็น U g1 FW min1 กิจกรรมแมวถูกวัดที่ 8C 37 ตามเทรเวอร์และเฟล็ตเชอร์ (1994) ทดสอบเอนไซม์ที่มีอยู่ 50 มม.ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0), 0.4% H2O2 และสารสกัดจากเอนไซม์ในปริมาณรวมของกิจกรรม 4 ml. CAT ถูกประเมิน โดยลดลง absorbance ของ H2O2 ที่ 240 nm และถูกแสดงเป็น U g1 FW min1 ฝักและแมวถูกกำหนดสำหรับระยะที่ 32.5. วิเคราะห์ความเข้มข้นโพลีเอมีนความเข้มข้นของ pAs ถูกวัด โดย HPLC ตามวิธีการของฟลอเรสและ Galston (1982) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย 0.3 g FW เมล็ดของฤดูเก็บเกี่ยวมี homogenized เป็นกลุ่ม 3 ml 5% (w/v) ถือกรด perchloric ใช้แบบเย็น ๆ โกร่งHomogenates ถูกเก็บไว้ในอ่างอาบน้ำเป็นน้ำแข็งสำหรับ 1 h และ thencentrifuged ที่ 23,000 g ใน 30 นาทีที่ 4 8C supernatant ถูกถ่ายโอนไปหลอดใหม่แรงเหวี่ยง และถูกเก็บไว้ที่ 70 8C สำหรับนับของ PAs สารสกัดจากเมล็ด benzoylated ได้ Ml หนึ่ง 2 โมล l1 NaOH ถูกผสมกับ supernatant ขนาด 500 มล. หลังจากเพิ่ม 10 ml เบนโซอิลคลอไรด์ ตัวอย่างการถูก vortexed สำหรับ 20 s incubated แล้วสำหรับ 20 นาทีที่ 37 8C. ขั้นบ่มที่อุณหภูมิสูง 2 ml เพิ่ม NaCl อิ่มตัว เบนโซอิล polyamines ถูกสกัดใน 2 ml diethyl อีเทอร์และ vortexed 10 s หลังจาก centrifugation ที่ g 1500 สำหรับ 5 นาทีที่ 4 8C, 1 ml ของเฟสอีเทอร์รวบรวม หายไปกับความแห้งกร้านภายใต้กระแสของอากาศอบอุ่น และ redissolved ใน 100 มลเมทานอล สารสกัดจาก benzoylated มีกรองผ่านเยื่อกรอง 0.22 มม. และ eluted แล้ว ที่อุณหภูมิห้องโดยมม. 6.0 150 mm, 5 mm อนุภาคขนาดกลับเฟส (C18) คอลัมน์ (Shim Pack CLC-ODS) พีคส์ pAs ตรวจพบ โดยการตรวจ absorbance SPD-20A (Shimadzu) ที่ 254 nm ระยะเคลื่อนที่ประกอบด้วยเมทานอล: น้ำ (64:36), ที่อัตราการไหลของmin1 1.0 ml สามโพลีเอมีนมาตรฐาน (ซิกเคมี จำกัด) ย้าย Spd และ Spm ได้เตรียมที่ความเข้มข้นแตกต่างกันสำหรับการพัฒนาของเส้นโค้งมาตรฐาน2.6. สถิติวิเคราะห์วิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SASระยะที่ 3 ได้ดำเนินการ ments วัดพารามิเตอร์ ค่าเปอร์เซ็นต์ที่ได้รับทั้งหมดถูกแปลง arcsine ก่อนวิเคราะห์ทางสถิติ มีคำนวณสมการถดถอยระหว่างความเข้มข้นของโพลีเอมีนและพารามิเตอร์สรีรวิทยาในระหว่างการพัฒนาเมล็ด
การแปล กรุณารอสักครู่..
2. Materials and methods
2.1. Experiment material and planting
Supersweet corn seeds (F1 hybrid with sh2), cv. Supersweet 17,were used in these studies. The hybrid seeds were produced by synchronous hand cross-pollination of the parental inbreds in the field at the experimental farm of Zhejiang University using production practices common for the region.
2.2. Seed harvest
Normally, it takes 30–40 days for supersweet corn seeds to fully mature but seed germination is possible 14 days after pollination (Cao et al., 2008b). Supersweet corn ears were harvested at different developmental stages from 14 to 42 days(at an interval of 4 days) after pollination (DAP).
At each harvest,10 plants were randomly chosen and the first ear from the top of the plant was harvested by hand. Seeds from the middle part of supersweet corn ears were threshed by hand and bulked for further tests
2.3. Germination test
Three replications of 50 seeds for each harvest were used, each50 seeds were placed in a 12 cm 18 cm germination box containing wet sand. Then, seeds were kept in a germination chamber at 25 8C with a diurnal cycle of 12 h light and 12 h darkness for 7 days. Seeds were considered germinated when a 1 mm length radicle protruded through the seed coat. The number of germinated seeds was counted daily. The energy of germination and germination percentage were calculated after 4 and 7 days,respectively. The germination index (GI = S(Gt Tt1)) was calculated by the method of Zhang et al. (2007) where Gt is the number of the germinated seeds on day t and Tt is the time corresponding
to Gt (in days). The energy of germination was the percentage of germinated seeds 4 days after planting relative to the number of seeds tested.
2.4. Measurements of physiological parameters
The seed length, width and thickness of 30 seeds were measured at each harvest manually with a ruler. The fresh and dry weights of 100 seeds were recorded at each harvest. Dry weights were recorded after 24 h in an oven at 80 8C (Cao et al.,2008a).The evaluation of kernel nutritive quality was performed with 3replications of 20 seeds for each harvest. Soluble protein was extracted from the seeds and determined by colorimetric assay with Coomassie Brilliant Blue G250 (Li, 2000). The concentration of total soluble sugar was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid method (Jiang, 1999)Malondialdehyde (MDA) concentration was determined using the thiobarbituric acid (TBA) reaction as described by Zhang et al. (2007). Briefly, 0.3 g fresh weight (FW) of corn seeds for each replication were collected at 14, 18, 22, 26, 30,34, 38 and 42 days after pollination, and homogenized in 3 ml of 5% trichloroacetic acid (TCA). The homogenate was centrifuged at 3600 g for 10 min and 2 ml of 0.67% TBA was added to 2 ml of supernatant. The mixture was heated at 100 8C for 30 min, cooled to room temperature and then centrifuged at 1800 g for 5 min. The optical density of the supernatant was measured at 450 nm, 532 nm and 600 nm. The MDA concentration was calculated according to the follow formula:C (mmol l1) = 6.45(A532 A600) 0.56A450, then the MDA concentration (nmol g1 FW) was calculated.
Electrolyte leakage as a measurement for membrane permeability was determined according to the method of Liu et al. (2000).Fresh seeds were cut into segments of about 5 mm respectively.Each tissue (0.2 g FW) was placed in the test tube with 10 ml deionized water and covered with a plug. After incubation at 25 8C for 6 h, the electrolyte leakage of the tissue was measured using a
conductivity meter (DDS-11A, made in Shanghai, China), the value was named E1. Subsequently, the test tube was kept in water at 100 8C for 30 min, and then cooled to 25 8C, the second electrolyte
leakage was measured as E2. The electrolyte leakage of deionized water was named E0. The relative electrolyte leakage (REL) was
calculated as follows:
REL ¼ E1 E0
E2 E0 100%
P
Peroxidase (POD) and catalase (CAT) activities of from seeds of each harvest were measured. Seeds (0.5 g FW) were harvested and homogenized in 10 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 0.1 mM EDTA and 2 mM dithiothreitol. The homogenate was centrifuged at 10,000 g for 15 min. The supernatant was used for enzyme assays and all of the extraction steps were carried out at 1–4 8C (Trevor and Fletcher, 1994).
POD activity was measured according to the method of Qiu et al. (2005). The assay mixture consisted of 3 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 1% guaiacol, 0.4% H2O2 and enzyme extract. The increase in absorbance due to oxidation of guaiacol was measured at 470 nm. Enzyme activity was calculated in terms of mmol of guaiacol oxidized min1 g1 fresh weight at 37 8C, and was expressed as U g1 FW min1. CAT activity was measured at 37 8C according to Trevor and Fletcher (1994). The enzyme assay contained 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.4% H2O2 and enzyme extract in a total volume of 4 ml. CAT activity was estimated by the decrease in absorbance of H2O2 at 240 nm and
was expressed as U g1 FW min1. Both POD and CAT were determined for three replications.
2.5. Polyamine concentration assay
PAs concentrations were measured by HPLC according to the method of Flores and Galston (1982) with minor modifications. 0.3 g FW seeds of each harvest were homogenized with 3 ml 5% (w/v) chilling perchloric acid using a cooled mortar and pestle.The homogenates were kept in an ice bath for 1 h, and thencentrifuged at 23,000 g for 30 min at 4 8C; the supernatant was transferred to new centrifugal tube and were stored at 70 8C for quantification of PAs. Seed extracts were benzoylated. One ml 2 mol l1 NaOH was mixed with 500 ml supernatant. After the addition of 10 ml benzoyl chloride, the samples were vortexed for 20 s then incubated for 20 min at 37 8C. Following the high temperature incubation, 2 ml saturated NaCl was added. Benzoyl-polyamines were extracted in 2 ml diethyl ether and vortexed for 10 s. After centrifugation at 1500 g for 5 min at 4 8C, 1 ml of the ether phase was collected, evaporated to dryness under a stream of warm air, and redissolved in 100 ml
methanol. The benzoylated extracts were filtered through a 0.22 mm membrane filter, and then eluted at room temperature through a 6.0 mm 150 mm, 5 mm particle size reverse-phase (C18) column (Shim-Pack CLC-ODS). PAs peaks were detected by an SPD-20A (Shimadzu) absorbance detector at 254 nm. The mobile phases consisted of methanol: water (64:36), at a flow rate of
1.0 ml min1. Three polyamine standards (Sigma Chemical Co.) of Put, Spd and Spm were prepared at different concentrations for the development of standard curves.
2.6. Statistical analysis
Statistical analysis was performed using the SAS software.Three replications were conducted for the parameter measure ments. All obtained percentage values were arcsine-transformed prior to statistical analysis. Regression equations between polyamine concentrations and physiological parameters during seed development were calculated.
2.1. Experiment material and planting
Supersweet corn seeds (F1 hybrid with sh2), cv. Supersweet 17,were used in these studies. The hybrid seeds were produced by synchronous hand cross-pollination of the parental inbreds in the field at the experimental farm of Zhejiang University using production practices common for the region.
2.2. Seed harvest
Normally, it takes 30–40 days for supersweet corn seeds to fully mature but seed germination is possible 14 days after pollination (Cao et al., 2008b). Supersweet corn ears were harvested at different developmental stages from 14 to 42 days(at an interval of 4 days) after pollination (DAP).
At each harvest,10 plants were randomly chosen and the first ear from the top of the plant was harvested by hand. Seeds from the middle part of supersweet corn ears were threshed by hand and bulked for further tests
2.3. Germination test
Three replications of 50 seeds for each harvest were used, each50 seeds were placed in a 12 cm 18 cm germination box containing wet sand. Then, seeds were kept in a germination chamber at 25 8C with a diurnal cycle of 12 h light and 12 h darkness for 7 days. Seeds were considered germinated when a 1 mm length radicle protruded through the seed coat. The number of germinated seeds was counted daily. The energy of germination and germination percentage were calculated after 4 and 7 days,respectively. The germination index (GI = S(Gt Tt1)) was calculated by the method of Zhang et al. (2007) where Gt is the number of the germinated seeds on day t and Tt is the time corresponding
to Gt (in days). The energy of germination was the percentage of germinated seeds 4 days after planting relative to the number of seeds tested.
2.4. Measurements of physiological parameters
The seed length, width and thickness of 30 seeds were measured at each harvest manually with a ruler. The fresh and dry weights of 100 seeds were recorded at each harvest. Dry weights were recorded after 24 h in an oven at 80 8C (Cao et al.,2008a).The evaluation of kernel nutritive quality was performed with 3replications of 20 seeds for each harvest. Soluble protein was extracted from the seeds and determined by colorimetric assay with Coomassie Brilliant Blue G250 (Li, 2000). The concentration of total soluble sugar was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid method (Jiang, 1999)Malondialdehyde (MDA) concentration was determined using the thiobarbituric acid (TBA) reaction as described by Zhang et al. (2007). Briefly, 0.3 g fresh weight (FW) of corn seeds for each replication were collected at 14, 18, 22, 26, 30,34, 38 and 42 days after pollination, and homogenized in 3 ml of 5% trichloroacetic acid (TCA). The homogenate was centrifuged at 3600 g for 10 min and 2 ml of 0.67% TBA was added to 2 ml of supernatant. The mixture was heated at 100 8C for 30 min, cooled to room temperature and then centrifuged at 1800 g for 5 min. The optical density of the supernatant was measured at 450 nm, 532 nm and 600 nm. The MDA concentration was calculated according to the follow formula:C (mmol l1) = 6.45(A532 A600) 0.56A450, then the MDA concentration (nmol g1 FW) was calculated.
Electrolyte leakage as a measurement for membrane permeability was determined according to the method of Liu et al. (2000).Fresh seeds were cut into segments of about 5 mm respectively.Each tissue (0.2 g FW) was placed in the test tube with 10 ml deionized water and covered with a plug. After incubation at 25 8C for 6 h, the electrolyte leakage of the tissue was measured using a
conductivity meter (DDS-11A, made in Shanghai, China), the value was named E1. Subsequently, the test tube was kept in water at 100 8C for 30 min, and then cooled to 25 8C, the second electrolyte
leakage was measured as E2. The electrolyte leakage of deionized water was named E0. The relative electrolyte leakage (REL) was
calculated as follows:
REL ¼ E1 E0
E2 E0 100%
P
Peroxidase (POD) and catalase (CAT) activities of from seeds of each harvest were measured. Seeds (0.5 g FW) were harvested and homogenized in 10 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 0.1 mM EDTA and 2 mM dithiothreitol. The homogenate was centrifuged at 10,000 g for 15 min. The supernatant was used for enzyme assays and all of the extraction steps were carried out at 1–4 8C (Trevor and Fletcher, 1994).
POD activity was measured according to the method of Qiu et al. (2005). The assay mixture consisted of 3 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 1% guaiacol, 0.4% H2O2 and enzyme extract. The increase in absorbance due to oxidation of guaiacol was measured at 470 nm. Enzyme activity was calculated in terms of mmol of guaiacol oxidized min1 g1 fresh weight at 37 8C, and was expressed as U g1 FW min1. CAT activity was measured at 37 8C according to Trevor and Fletcher (1994). The enzyme assay contained 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.4% H2O2 and enzyme extract in a total volume of 4 ml. CAT activity was estimated by the decrease in absorbance of H2O2 at 240 nm and
was expressed as U g1 FW min1. Both POD and CAT were determined for three replications.
2.5. Polyamine concentration assay
PAs concentrations were measured by HPLC according to the method of Flores and Galston (1982) with minor modifications. 0.3 g FW seeds of each harvest were homogenized with 3 ml 5% (w/v) chilling perchloric acid using a cooled mortar and pestle.The homogenates were kept in an ice bath for 1 h, and thencentrifuged at 23,000 g for 30 min at 4 8C; the supernatant was transferred to new centrifugal tube and were stored at 70 8C for quantification of PAs. Seed extracts were benzoylated. One ml 2 mol l1 NaOH was mixed with 500 ml supernatant. After the addition of 10 ml benzoyl chloride, the samples were vortexed for 20 s then incubated for 20 min at 37 8C. Following the high temperature incubation, 2 ml saturated NaCl was added. Benzoyl-polyamines were extracted in 2 ml diethyl ether and vortexed for 10 s. After centrifugation at 1500 g for 5 min at 4 8C, 1 ml of the ether phase was collected, evaporated to dryness under a stream of warm air, and redissolved in 100 ml
methanol. The benzoylated extracts were filtered through a 0.22 mm membrane filter, and then eluted at room temperature through a 6.0 mm 150 mm, 5 mm particle size reverse-phase (C18) column (Shim-Pack CLC-ODS). PAs peaks were detected by an SPD-20A (Shimadzu) absorbance detector at 254 nm. The mobile phases consisted of methanol: water (64:36), at a flow rate of
1.0 ml min1. Three polyamine standards (Sigma Chemical Co.) of Put, Spd and Spm were prepared at different concentrations for the development of standard curves.
2.6. Statistical analysis
Statistical analysis was performed using the SAS software.Three replications were conducted for the parameter measure ments. All obtained percentage values were arcsine-transformed prior to statistical analysis. Regression equations between polyamine concentrations and physiological parameters during seed development were calculated.
การแปล กรุณารอสักครู่..
2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . วัสดุทดลอง และปลูกเมล็ดข้าวโพด
อ่อนหวาน ( F1 ผสมกับสินค้า ) , พันธุ์ อ่อนหวาน 17 ถูกใช้ในการศึกษาเหล่านี้ เมล็ดพันธุ์ลูกผสมที่ผลิตแบบมือข้ามการผสมของสายพันธุ์แท้ของผู้ปกครองในเขตที่ฟาร์มทดลองของมหาวิทยาลัยเจ้อเจียงใช้ผลิตแนวทางปฏิบัติทั่วไปสำหรับภูมิภาค .
2.2 . เมล็ดเก็บเกี่ยว
โดยปกติมันใช้เวลา 30 – 40 วันสำหรับอ่อนหวานข้าวโพดเมล็ดโตเต็มที่ แต่การงอกของเมล็ดได้ 14 วัน หลังการผสมเกสร ( เคา et al . , 2008b ) อ่อนหวานข้าวโพดหูเกี่ยวที่ระยะพัฒนาการต่าง ๆ จาก 14 42 วัน ( ในช่วง 4 วัน ) หลังจากการผสมเกสร ( DAP )
ที่แต่ละเก็บเกี่ยวพืช 10 สุ่มเลือกและหูครั้งแรกจากด้านบนของพืชที่ถูกเก็บเกี่ยวด้วยมือเมล็ดพันธุ์จากส่วนกลางอ่อนหวานหูข้าวโพดนวดข้าวด้วยมือและยกสำหรับการทดสอบ
2.3 เพิ่มเติม
การทดสอบความงอกของเมล็ด 3 ซ้ำ 50 แต่ละเก็บเกี่ยวใช้ each50 เมล็ดอยู่ใน 12 ซม. 18 ซม. มีกล่องบรรจุทรายเปียก แล้วเมล็ดถูกเก็บไว้ในห้องที่งอก 25 8C กับรอบวัน 12 ชั่วโมง 12 ชั่วโมงของแสงและความมืด เป็นเวลา 7 วันเมล็ดงอกเมื่อพิจารณา 1 มิลลิเมตรความยาวรากโดยมีผ่านเยื่อหุ้มเมล็ด . จำนวนเมล็ดงอกได้นับทุกวัน พลังงานของความงอกและความงอกได้หลัง 4 และ 7 วัน ตามลำดับ ดัชนีการงอก ( GI = S ( GT tt1 ) คำนวณโดยวิธีของ Zhang et al .( 2007 ) ที่ GT คือจำนวนของเมล็ดในวันและเวลาเดียวกัน
TT มีการ GT ( วัน ) พลังงานของการงอกของเมล็ดมีเปอร์เซ็นต์ 4 วัน หลังปลูกเมื่อเทียบกับจำนวนเมล็ดทดสอบ
2.4 . การวัดของสรีรวิทยา
เม็ด ความยาว ความกว้าง และความหนาของ 30 เมล็ด ในแต่ละผลผลิตด้วยตนเองวัดด้วยไม้บรรทัดน้ำหนักสดและแห้งของ 100 เมล็ดที่ถูกบันทึกไว้ในแต่ละเก็บเกี่ยว น้ำหนักแห้งที่ถูกบันทึกไว้หลังจาก 24 ชั่วโมงในเตาอบที่อุณหภูมิ 80 8C ( เคา et al . , 2008a ) การประเมินคุณภาพทางโภชนาการของเมล็ดได้ด้วย 3replications 20 เมล็ดในการเก็บเกี่ยว ปริมาณโปรตีนที่สกัดจากเมล็ดและกำหนดโดยวิธี Colorimetric กับเหล่านี้น่าจะเป็น g250 สีฟ้าสดใส ( Li , 2000 )ความเข้มข้นของน้ำตาลที่ละลายน้ำได้ทั้งหมดถูกกำหนดโดยวิธีกรด 3,5-dinitrosalicylic ( เจียง , 1999 ) มาลอนไดอัลดีไฮด์ ( MDA ) สมาธิ ตั้งใจใช้กรดเท่ากับ ( TBA ) ปฏิกิริยาตามที่อธิบายไว้โดย Zhang et al . ( 2007 ) สั้น ๆ , 0.3 กรัมน้ำหนักสด ( FW ) ของเมล็ดข้าวโพดแต่ละซ้ำจำนวน 14 , 18 , 22 , 26 , 30,34 , 38 และ 42 วัน หลังการผสมเกสรบด 3 ml และ 5% กรดไตรคลอโรอะซิติก ( TCA ) โดยแยกเป็นระดับที่ 3600 กรัมต่อ 10 นาที 2 มิลลิลิตรมีค่า 0.67 % เพิ่ม 2 ml ของน่าน . ส่วนผสมจะถูกความร้อนที่ 100 8C เป็นเวลา 30 นาที เย็นที่อุณหภูมิห้อง แล้วที่ระดับ 1 , 800 กรัม เป็นเวลา 5 นาที ความหนาแน่นสูง แสงของวัด 450 นาโนเมตร 532 nm และ 600 นาโนเมตรความเข้มข้นน้ำตาลถูกคำนวณตามตามสูตรเคมี : C ( mmol L1 ) = 6.45 ( a532 a600 ) 0.56a450 แล้ว ( สมาธิ ( nmol G1 FW ) คือค่า
อิเล็กโทรไลต์เยื่อซึมรั่วเป็นวัดถูกกำหนดตามวิธีการของ Liu et al . ( 2543 ) . เมล็ดสดที่ถูกตัดเป็นส่วน ประมาณ 5 มิลลิเมตร ตามลำดับ แต่ละเนื้อเยื่อ ( 02 g FW ) ลงในหลอดทดลองที่มี 10 น้ำคล้ายเนื้อเยื่อประสาน ml และปกคลุมด้วยปลั๊ก หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ 25 8C 6 H , อิเล็กโทรไลต์การรั่วไหลของเนื้อเยื่อถูกวัดโดยใช้เครื่องวัดค่า (
dds-11a ทำในเซี่ยงไฮ้ , จีน ) , ค่าชื่อ E1 ต่อมาหลอดทดลองที่ถูกเก็บไว้ในน้ำที่ 100 8C สำหรับ 30 นาทีแล้วเย็น 25 8C ,
อิเล็กโทรไลต์วินาทีการรั่วไหลถูกวัดเป็น E2 . การรั่วซึมของน้ำอิเล็กโทรไลต์คล้ายเนื้อเยื่อประสานชื่อ E0 . การรั่วไหลของอิเล็กโทรไลต์แบบสัมพัทธ์ ( rel ) คำนวณได้ดังนี้
¼ E1 E2 rel E0
p
% E0 100 เปอร์ออกซิเดส ( ฝัก ) และ Catalase ( แมว ) กิจกรรมจากเมล็ดของการเก็บเกี่ยวแต่ละวัด . เมล็ด ( 0.5 g FW ) มีการเก็บเกี่ยวและบดใน 10 มิลลิลิตร 50 มม. ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.8 ) ประกอบด้วย 01 mM EDTA และ บัตรแข็ง 2 มิลลิเมตร โดยแยกเป็นระดับที่ 10 , 000 กรัมเป็นเวลา 15 นาที และใช้วิธีนำเอนไซม์และทั้งหมดของการสกัดขั้นทดลองที่ 1 – 4 8C ( เทรเวอร์และเฟลทเชอร์ , 1994 ) .
กิจกรรมฝักได้ตามวิธีของคู et al . ( 2005 ) วิเคราะห์ส่วนผสมประกอบด้วย 3 มิลลิลิตร 50 มม. ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ) , ค่าร้อยละ 1 0แบตเตอรี่ 4 % และเอนไซม์ สารสกัด การเพิ่มค่าการดูดกลืนแสงเนื่องจากการเกิดออกซิเดชันของค่าวัดที่ 470 นาโนเมตร กิจกรรมของเอนไซม์ถูกคำนวณในแง่ของมิลลิโมลของไดออกซิไดซ์ min1 G1 น้ำหนักสดที่ 37 8C , และจะแสดงเป็นคุณ G1 FW min1 . กิจกรรมแมววัดที่ 37 8C ตาม Trevor และเฟลทเชอร์ ( 1994 ) เอนไซม์ที่มีอยู่ใน 50 มม. ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ) , 0
2.1 . วัสดุทดลอง และปลูกเมล็ดข้าวโพด
อ่อนหวาน ( F1 ผสมกับสินค้า ) , พันธุ์ อ่อนหวาน 17 ถูกใช้ในการศึกษาเหล่านี้ เมล็ดพันธุ์ลูกผสมที่ผลิตแบบมือข้ามการผสมของสายพันธุ์แท้ของผู้ปกครองในเขตที่ฟาร์มทดลองของมหาวิทยาลัยเจ้อเจียงใช้ผลิตแนวทางปฏิบัติทั่วไปสำหรับภูมิภาค .
2.2 . เมล็ดเก็บเกี่ยว
โดยปกติมันใช้เวลา 30 – 40 วันสำหรับอ่อนหวานข้าวโพดเมล็ดโตเต็มที่ แต่การงอกของเมล็ดได้ 14 วัน หลังการผสมเกสร ( เคา et al . , 2008b ) อ่อนหวานข้าวโพดหูเกี่ยวที่ระยะพัฒนาการต่าง ๆ จาก 14 42 วัน ( ในช่วง 4 วัน ) หลังจากการผสมเกสร ( DAP )
ที่แต่ละเก็บเกี่ยวพืช 10 สุ่มเลือกและหูครั้งแรกจากด้านบนของพืชที่ถูกเก็บเกี่ยวด้วยมือเมล็ดพันธุ์จากส่วนกลางอ่อนหวานหูข้าวโพดนวดข้าวด้วยมือและยกสำหรับการทดสอบ
2.3 เพิ่มเติม
การทดสอบความงอกของเมล็ด 3 ซ้ำ 50 แต่ละเก็บเกี่ยวใช้ each50 เมล็ดอยู่ใน 12 ซม. 18 ซม. มีกล่องบรรจุทรายเปียก แล้วเมล็ดถูกเก็บไว้ในห้องที่งอก 25 8C กับรอบวัน 12 ชั่วโมง 12 ชั่วโมงของแสงและความมืด เป็นเวลา 7 วันเมล็ดงอกเมื่อพิจารณา 1 มิลลิเมตรความยาวรากโดยมีผ่านเยื่อหุ้มเมล็ด . จำนวนเมล็ดงอกได้นับทุกวัน พลังงานของความงอกและความงอกได้หลัง 4 และ 7 วัน ตามลำดับ ดัชนีการงอก ( GI = S ( GT tt1 ) คำนวณโดยวิธีของ Zhang et al .( 2007 ) ที่ GT คือจำนวนของเมล็ดในวันและเวลาเดียวกัน
TT มีการ GT ( วัน ) พลังงานของการงอกของเมล็ดมีเปอร์เซ็นต์ 4 วัน หลังปลูกเมื่อเทียบกับจำนวนเมล็ดทดสอบ
2.4 . การวัดของสรีรวิทยา
เม็ด ความยาว ความกว้าง และความหนาของ 30 เมล็ด ในแต่ละผลผลิตด้วยตนเองวัดด้วยไม้บรรทัดน้ำหนักสดและแห้งของ 100 เมล็ดที่ถูกบันทึกไว้ในแต่ละเก็บเกี่ยว น้ำหนักแห้งที่ถูกบันทึกไว้หลังจาก 24 ชั่วโมงในเตาอบที่อุณหภูมิ 80 8C ( เคา et al . , 2008a ) การประเมินคุณภาพทางโภชนาการของเมล็ดได้ด้วย 3replications 20 เมล็ดในการเก็บเกี่ยว ปริมาณโปรตีนที่สกัดจากเมล็ดและกำหนดโดยวิธี Colorimetric กับเหล่านี้น่าจะเป็น g250 สีฟ้าสดใส ( Li , 2000 )ความเข้มข้นของน้ำตาลที่ละลายน้ำได้ทั้งหมดถูกกำหนดโดยวิธีกรด 3,5-dinitrosalicylic ( เจียง , 1999 ) มาลอนไดอัลดีไฮด์ ( MDA ) สมาธิ ตั้งใจใช้กรดเท่ากับ ( TBA ) ปฏิกิริยาตามที่อธิบายไว้โดย Zhang et al . ( 2007 ) สั้น ๆ , 0.3 กรัมน้ำหนักสด ( FW ) ของเมล็ดข้าวโพดแต่ละซ้ำจำนวน 14 , 18 , 22 , 26 , 30,34 , 38 และ 42 วัน หลังการผสมเกสรบด 3 ml และ 5% กรดไตรคลอโรอะซิติก ( TCA ) โดยแยกเป็นระดับที่ 3600 กรัมต่อ 10 นาที 2 มิลลิลิตรมีค่า 0.67 % เพิ่ม 2 ml ของน่าน . ส่วนผสมจะถูกความร้อนที่ 100 8C เป็นเวลา 30 นาที เย็นที่อุณหภูมิห้อง แล้วที่ระดับ 1 , 800 กรัม เป็นเวลา 5 นาที ความหนาแน่นสูง แสงของวัด 450 นาโนเมตร 532 nm และ 600 นาโนเมตรความเข้มข้นน้ำตาลถูกคำนวณตามตามสูตรเคมี : C ( mmol L1 ) = 6.45 ( a532 a600 ) 0.56a450 แล้ว ( สมาธิ ( nmol G1 FW ) คือค่า
อิเล็กโทรไลต์เยื่อซึมรั่วเป็นวัดถูกกำหนดตามวิธีการของ Liu et al . ( 2543 ) . เมล็ดสดที่ถูกตัดเป็นส่วน ประมาณ 5 มิลลิเมตร ตามลำดับ แต่ละเนื้อเยื่อ ( 02 g FW ) ลงในหลอดทดลองที่มี 10 น้ำคล้ายเนื้อเยื่อประสาน ml และปกคลุมด้วยปลั๊ก หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ 25 8C 6 H , อิเล็กโทรไลต์การรั่วไหลของเนื้อเยื่อถูกวัดโดยใช้เครื่องวัดค่า (
dds-11a ทำในเซี่ยงไฮ้ , จีน ) , ค่าชื่อ E1 ต่อมาหลอดทดลองที่ถูกเก็บไว้ในน้ำที่ 100 8C สำหรับ 30 นาทีแล้วเย็น 25 8C ,
อิเล็กโทรไลต์วินาทีการรั่วไหลถูกวัดเป็น E2 . การรั่วซึมของน้ำอิเล็กโทรไลต์คล้ายเนื้อเยื่อประสานชื่อ E0 . การรั่วไหลของอิเล็กโทรไลต์แบบสัมพัทธ์ ( rel ) คำนวณได้ดังนี้
¼ E1 E2 rel E0
p
% E0 100 เปอร์ออกซิเดส ( ฝัก ) และ Catalase ( แมว ) กิจกรรมจากเมล็ดของการเก็บเกี่ยวแต่ละวัด . เมล็ด ( 0.5 g FW ) มีการเก็บเกี่ยวและบดใน 10 มิลลิลิตร 50 มม. ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.8 ) ประกอบด้วย 01 mM EDTA และ บัตรแข็ง 2 มิลลิเมตร โดยแยกเป็นระดับที่ 10 , 000 กรัมเป็นเวลา 15 นาที และใช้วิธีนำเอนไซม์และทั้งหมดของการสกัดขั้นทดลองที่ 1 – 4 8C ( เทรเวอร์และเฟลทเชอร์ , 1994 ) .
กิจกรรมฝักได้ตามวิธีของคู et al . ( 2005 ) วิเคราะห์ส่วนผสมประกอบด้วย 3 มิลลิลิตร 50 มม. ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ) , ค่าร้อยละ 1 0แบตเตอรี่ 4 % และเอนไซม์ สารสกัด การเพิ่มค่าการดูดกลืนแสงเนื่องจากการเกิดออกซิเดชันของค่าวัดที่ 470 นาโนเมตร กิจกรรมของเอนไซม์ถูกคำนวณในแง่ของมิลลิโมลของไดออกซิไดซ์ min1 G1 น้ำหนักสดที่ 37 8C , และจะแสดงเป็นคุณ G1 FW min1 . กิจกรรมแมววัดที่ 37 8C ตาม Trevor และเฟลทเชอร์ ( 1994 ) เอนไซม์ที่มีอยู่ใน 50 มม. ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ) , 0
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- โอม ชยะ ศรี สรัสวตี มาตา
- การแนะนำ
- ส่วนอัลเบิร์ตได้นำการนำเสนออารมณ์ของความ
- Dizziness or nausea
- โอม ชยะ ศรี สรัสวตี มาตา
- the festival of colours
- กลุ่มตัวอย่างเป็นนักเรียนชั้นมัธยมศึกษาป
- เธอผูกคอตาย
- สายหูฟังข้างขวาขาด
- ซึ่งตัวละครทั้ง 2 ตั้งละครนั้นได้แสดงตีค
- ไป ไหน
- การนำเสนอ
- and they believed to bring color to play
- Improves blood circulation therefore has
- จะรักเธอไปทุกวัน
- perhaps i could use money to make him al
- ฉันอยากเห๋นหิมะฉันไม่เคยเห็นหิมะฉันอยากป
- ผู้สอนจึงได้สอดแทรกเนื้อหาการสอนเป็นภาษา
- วันนี้
- ห้ามดื่มน้ำเย็น
- ระหว่างคนสองคน
- ซึ่งตัวละครทั้งสองนั้นได้แสดงตีความของนิ
- 幸せな火曜日.
- ระหว่างคนสองคน
