Immunoprecipitation and immunoblott

Immunoprecipitation and immunoblotting. Cells were lysed in PBS
containing 1% Triton X-100 and a cocktail of protease inhibitors (Roche). The
lysates were subjected to immunoprecipitation (IP) using C-CFTR monoclonal
antibody (mAb 24-1; R and D Systems) cross-linked to protein A/G agarose
beads. After extensive washes with PBS/1% Triton X-100, the bound proteins
were analyzed by immunoblotting following transfer to polyvinylidenedifluoride membranes (BioRad) as previously described (Cormet-Boyakaet al.,
2004;Rennolds, Boyaka,et al., 2008). Membranes were blocked with PBS 5%
dry milk and primary antibodies were added at 1:2000 (C-CFTR; R and D
Systems), 1:5000 (b-actin; Santa Cruz Biotechnology), 1:1000 (metallothionein; Abcam), 1:1000 (SLC11A2; GeneTex), or 1:2000 (ubiquitin; Santa Cruz
Biotechnology) dilutions, respectively. Secondary antibodies (horseradish
peroxidase conjugated; Pierce, Rockford, IL) were diluted 1:10,000. Chemoluminescent signal was detected using West Pico (Pierce) following the
manufacturer’s instructions. The intensity of the bands was estimated by
Quantity One software (BioRad)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Immunoprecipitation และ immunoblotting เซลล์ที่ถูก lysed ใน PBSประกอบด้วย 1% ไตรตั้น X 100 และค็อกเทลของรติเอส inhibitors (Roche) ที่lysates ถูกต้อง immunoprecipitation (IP) ใช้ C CFTR โมโนแอนติบอดี (มาบ 24-1 R และ D ระบบ) cross-linked กับโปรตีน agarose A/Gลูกปัด หลังจาก washes อย่างละเอียดด้วย PBS/1% ไตรตั้น X-100 โปรตีนที่ถูกผูกไว้ได้วิเคราะห์ โดยวิธีโอนย้ายเพื่อเข้า polyvinylidenedifluoride (BioRad) ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้เป็น immunoblotting (อัล Cormet Boyakaet.,2004 Rennolds, Boyaka และ al., 2008) เข้าบล็อก ด้วย PBS 5%มีเพิ่มน้ำนมแห้งและแอนตี้หลักที่ 1:2000 (C-CFTR R และ Dระบบ), 1:5000 (บีแอกติน ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ), 1:1000 (metallothionein Abcam), 1:1000 (SLC11A2 GeneTex), 1:2000 (ubiquitin หรือ ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ) dilutions ตามลำดับ แอนตี้รอง (horseradishperoxidase กลวง เพียร์ซ ร็อคฟอร์ด IL) ได้แตกออกที่ 1:10, 000 สัญญาณ Chemoluminescent ถูกตรวจพบใช้ Pico ตะวันตก (เพียร์ซ) ต่อไปนี้คำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มของแถบถูกประเมินโดยปริมาณหนึ่งซอฟต์แวร์ (BioRad)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

immunoprecipitation และ immunoblotting เซลล์ที่ถูก lysed ในพีบีเอส
ที่มี 1% Triton X-100 และค๊อกเทลของน้ำย่อยโปรตีน (Roche)
lysates ถูกยัดเยียดให้ immunoprecipitation (IP) โดยใช้โมโนโคลนอล C-CFTR
แอนติบอดี (mAb 24-1; R & D ระบบ) เชื่อมโยงกับโปรตีน / G agarose
ลูกปัด หลังจากที่ล้างอย่างกว้างขวางกับพีบีเอส / 1% Triton X-100, โปรตีนผูกพัน
วิเคราะห์ immunoblotting ต่อไปนี้การถ่ายโอนไป polyvinylidenedifluoride เยื่อ (BioRad) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (CORMET-Boyakaet ล.
2004. Rennolds, Boyaka, et al, 2008) . เยื่อถูกบล็อกกับพีบีเอส 5%
นมแห้งและแอนติบอดีหลักถูกเพิ่ม 1: 2000 (C-CFTR; R & D
Systems) ที่ 1: 5000 (B-โปรตีน; ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ) ที่ 1: 1000 (เมทัลโล; Abcam) 1: 1000 (SLC11A2; GeneTex) หรือ 1: 2000 (ubiquitin; ซานตาครูซ
เทคโนโลยีชีวภาพ) เจือจางตามลำดับ แอนติบอดีรอง (มะรุม
peroxidase ผัน; เพียร์ซ, ฟอร์ด, IL) ได้รับการเจือจาง 1: 10,000 สัญญาณ Chemoluminescent ตรวจพบการใช้เวสต์ บริษัท ปิโก (เพียร์ซ) ตาม
คำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มของวงดนตรีที่ได้รับการประเมินโดย
จำนวนหนึ่งซอฟต์แวร์ (BioRad)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

immunoprecipitation Lines . เซลล์มี lysed ใน PBS
ที่มี 1% Triton X-100 และ protease inhibitors ( ค็อกเทลของโรช )
lysates ถูก immunoprecipitation ( IP ) โดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี ( 24-1 ) c-cftr
; R และ D ระบบเชื่อมโยงกับโปรตีน A / G (
ลูกปัด หลังจากล้างด้วย pbs อย่างละเอียด / 1% Triton X-100 , ผูกพันโปรตีน
วิเคราะห์ข้อมูลโดยวิธีต่อไปนี้เพื่อโอน polyvinylidenedifluoride เมมเบรน ( biorad ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( cormet boyakaet al . ,
2004 ; rennolds boyaka , et al . , 2008 ) เยื่อที่ถูกบล็อกด้วย PBS 5 %
นมแห้งและแอนติบอดีหลักถูกเพิ่มที่ 1:2000 ( c-cftr ; R และ D
ระบบ ) , 1:5000 ( b-actin ; Santa Cruz เทคโนโลยีชีวภาพ ) , 000 ( เมทัลโลไธโอนีน ; ABCAM ) , 000 ( slc11a2 ; genetex )หรือ 1:2000 ( ข้างนอก ; Santa Cruz
เทคโนโลยีชีวภาพ ) เจือจาง ตามลำดับ ชนิดทุติยภูมิ ( .
เอนไซม์ conjugated ; แทง , Rockford , IL ) ลด 1:10000 . สัญญาณ chemoluminescent ถูกตรวจพบใช้ West Pico ( เพียร์ซ )
ตามคําแนะนําของผู้ผลิต ความเข้มของวงถูกประมาณโดย
ปริมาณหนึ่งซอฟต์แวร์ ( biorad )