NF-YB1-regulated expression of sucr

NF-YB1-regulated expression of sucrose transporters in aleurone facilitates sugar loading to rice endosperm Cell Research advance online publication 25 September 2015; doi:10.1038/cr.2015.116
Dear Editor,
Cereal endosperms, which consist of an outer aleurone layer and an inner starchy endosperm, provide over 70% staple food for human [www.fao.org]. Rice endosperm development occurs in the caryopsis of a grain. During the grain filling stage, sucrose produced in photosynthetic leaves is transported to grains via the phloem [1, 2]. It has been proposed that sucrose, upon arrival in the caryopsis through the phloem located at the dorsal vascular bundle, is partially hydrolyzed by cell wall invertases (CINs) into glucose and fructose [3, 4]. Since endosperm is symplastically isolated from maternal tissues, it is assumed that these sugars are delivered to the endosperm actively through an apoplastic pathway by sugar transporters located in aleurone [5, 6]. However, the exact role of aleurone in regulating sugar transport remains unknown. In this study, microarray analyses were performed in rice (Oryza sativa L., Zhonghua 11) to identify transcription factors (TFs) differentially expressed between starchy endosperm and aleurone in caryopses collected at 11 to 14 days after pollination (DAP), a stage when grain filling is active. Out of 949 TFs that were differentially expressed, 505 were up-regulated in the aleurone. Real-time PCR was performed to examine their expression patterns further. Os02g0725900 encoding Nuclear Factor Y B1 (NF-YB1) was shown to be expressed in caryopses from 4 to 21 DAP (c4 to c21), similar to the result published recently [7], while no expression was detected in vegetative tissues examined (Figure 1A). Within caryopses, abundant NF-YB1 expression was detected in mixed aleurone-testa sample (a+t), but not in starchy endosperm (se; Figure 1A). NF-YB1 belongs to NF-Y family TFs that are conserved in all eukaryotic organisms. NF-Ys usually form trimers with one NF-YA, one NF-YB and one NF-YC, and bind to CCAAT-containing regulatory elements [8]. Ten NF-YAs, eleven NF-YBs and seven NF-YCs are present in the rice genome, which could potentially produce over 700 heterotrimeric complexes [8]. In situ hybridization showed that, during caryopsis development, expression of NF-YB1 was first detected at the
periphery of coenocytic endosperms at 4 DAP, and confined to dorsal aleurone (adjacent to the primary vascular bundle and nucellar projection) at 5 DAP, and then expanded to the whole aleurone at 7, 9 and 11 DAP (stronger at the dorsal side). No expression was observed in maternal tissues such as the dorsal vascular bundle and the nucellar projection (Figure 1B and Supplementary information, Figure S1A). The expression correlated with the rapid increase of fresh caryopsis weight during this period (Supplementary information, Figure S1B). GUS staining in transgenic plants carrying 3 018 base pairs (bp) of NF-YB1 5′ upstream sequence fused to β-Glucuronidase (GUS) confirmed the expression pattern, and revealed no GUS expression in any other tissues examined (Supplementary information, Figure S1C). These results together suggest NF-YB1 is specifically expressed in aleurone. Two CRISPR-Cas9 constructs expressing guide RNAs targeting different regions of the second exon of NF-YB1 were made and used to transform into rice (Zhonghua 11). Sequencing of PCR-amplified NF-YB1 genomic DNA from transgenic plants allowed us to identify two knockout mutants: nfyb1-1 with an adenine insertion and nfyb12 with a thymine insertion into the second exon (Figure 1C and Supplementary information, Figure S2A), predicted to produce truncated polypeptides with only 16 and 34 amino acids (AA) identical to NF-YB1 in nfyb1-1 and nfyb12, respectively (Supplementary information, Figure S2B). Although no visible phenotype was observed during vegetative growth, grains produced from homozygous nfyb1-1 and nfyb1-2 plants showed a chalky endosperm phenotype, suggesting a defect in grain filling (Figure 1D). Additionally, an RNA interference (RNAi) construct with a 350-bp fragment targeting the second exon of NF-YB1, expressed under the control of maize Ubiquitin 1 promoter, was made and transformed into rice (Zhonghua 11). Caryopses excised from 3 independent transgenic lines showed reduced NF-YB1 expression (Supplementary information, Figure S2C) and a similar chalky endosperm phenotype as nfyb1-1 and nfyb12 (Supplementary information, Figure S2D). These data together suggest that NF-YB1 plays an important role in rice grain filling.
2 Regulations of sucrose transporters in aleuronenpg
Cell Research | www.nature.com/cr
Figure 1 NF-YB1-regulated expression of three sucrose transporters facilitates grain filling in rice. (A) Real-time PCR analysis showing that NF-YB1 is expressed in caryopses at 4, 7, 11, 14 and 21 DAP; and in caryopses collected at 11 DAP, NFYB1 is highly expressed in mixed aleurone and testa tissues. l, leaves; r, roots; p, panicles; o, ovaries; c2 to c31, caryopses collected at 2 to 31 DAP; se and a+t, starchy endosperm and mixed aleurone and testa samples collected at 11 DAP, respectively. Data are shown as means ± SD (n = 3). (B) In situ hybridization in sectioned caryopses collected at 2, 4, 5, 9 and 11 DAP using antisense (upper panel) and sense probes (lower panel), showing that NF-YB1 is strongly expressed in aleurone
Ai-Ning Bai et al.
3 npg
www.cell-research.com | Cell Research
Since nfyb1-1 and nfyb1-2 showed indistinguishable phenotype, nfyb1-1 was thus used in subsequent experiments. The mature nfyb1-1 caryopsis showed 18% reduction in dry weight (Supplementary information, Figure S2E). Scanning electron microscopy examinations revealed that endosperms in nfyb1-1 carried small and loosely packed starch granules, which differed markedly from the large and tightly packed starch granules in the wildtype (WT; Figure 1E). The average length of nfyb1-1 starch granules along the long axes was 4.4 ± 0.6 μm, as compared with 7.8 ± 1.0 μm in the WT (Supplementary information, Figure S2F). Gas chromatography triple quadrupole mass spectrometry (GC-QQQ-MS/ MS) analyses showed that contents of sucrose, fructose and glucose in nfyb1-1 caryopses collected at 6, 9 and 11 DAP were significantly reduced as compared to those in the WT (Figure 1F). These data suggest that the chalky endosperm phenotype in nfyb1-1 might be caused by compromised sugar delivery. We then examined expression patterns of genes involved in sugar loading in nfyb1-1. All five Sucrose Transporters (SUTs, 1 to 5) in the rice genome, CIN2 and Monosaccharide Transporter 4 (MST4) are known to be expressed at different stages of rice caryopses [9, 4, 10]. Real-time PCR performed in caryopses collected at 5 DAP showed that levels of SUT1, SUT3, SUT4 and MST4 expression were re
duced in nfyb1-1, while no evident reduction was observed for SUT2 (Figure 1G), suggesting that SUT1, SUT3, SUT4 and MST4 may be regulated by NF-YB1. To address if NF-YB1 can bind to regulatory elements of these sugar transporter genes, yeast one-hybrid experiment was performed using NF-YB1 fused with GAL4 transcriptional activation domain as prey, and 5′ upstream sequences of SUT1, SUT3, SUT4, MST4 or SUT2 fused to LacZ as baits. After co-transformation of the prey with individual baits into yeast, we observed that NF-YB1 is able to activate LacZ expression when SUT1, SUT3, SUT4 or MST4 5′ sequences were used, while no activation was detected for SUT2 (Figure 1H). To further address if NF-YB1 is able to activate expression of these sugar transporters in plants, luciferase (LUC) assay was performed in vitro using protoplasts isolated from etiolated rice seedlings by co-transformation of p35S::NF-YB1::tNOS with either pSUT1::LUC, pSUT3::LUC, pSUT4::LUC, pMST4::LUC or pSUT2::LUC. As showed in Figure 1I, significantly elevated LUC activities were detected when pSUT1::LUC, pSUT3::LUC and pSUT4::LUC were used, while no significant elevation was observed for pMST4::LUC and pSUT2::LUC, indicating MST4 and SUT2 might not be direct targets of NF-YB1. Several putative CCAAT boxes were identified in 5′ up
(arrowheads), but not in maternal tissues, or in starchy endosperm. dv, dorsal vascular bundle; np, nucellar projection. Bar = 100 μm. (C) nfyb1-1 and nfyb1-2 knockout mutants generated by CRISPR-Cas9. Upper panel, a gene model of NF-YB1 to show positions of single-nucleotide insertions in nfyb1-1 and nfyb1-2. Lower panel, mutation sites in nfyb1-1 and nfyb1-2, as compared to WT sequences. Sequence in bold, target sites; underlined, protospacer-adjacent motif sequences (PAMs). Arrowheads indicate inserted single nucleotides. (D) Mature grains of nfyb1-1 and nfyb1-2, showing the chalky endosperm phenotype as compared to the semi-transparent endosperm in WT. Upper panel, side views of intact caryopses; lower panel, surface views of cracked caryopses. en, endosperm; em, embryo. Bars = 1 mm. (E) Scanning electron microscopy images of cracked mature WT and nfyb1-1 caryopses at different magnifications, showing smaller and loosely packed starch grains in nfyb1-1, as compared to large and tightly packed ones in the WT. Scale bars: 500 μm (top), 25 μm (middle), 5 μm (bottom). (F) Sucrose, fructose, and glucose contents (μg in mg fresh weight) in developing caryopses collected at 6, 9 and 11 DAP, showing significantly reduced accumulation of all these sugars in nfyb1-1, as compared to that in the WT caryopses at the same stage. Data shown as means ± SD (n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01, based on Student’s t-test). (G) Expression levels of SUT1, SUT3, SUT4 and MST4 were reduced in nfyb1-1 caryopses collected at 5 DAP, as compared to those in WT. Expression levels of these genes in the WT were normalized to 1. No significant reduction was observed for SUT2. Data shown as means ± SD (n = 3). (H) Yeast one-hybrid assay to show bindings of NF-YB1 to SUT1, SUT3, SUT4 and MST4 regulatory elements.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

NF-YB1-ควบคุมค่าของซูโครสผู้ใน aleurone อำนวยความสะดวกในการโหลดข้าวเอนโดสเปิร์มเซลล์วิจัยล่วงหน้าออนไลน์ประกาศ 25 2015 กันยายน น้ำตาล doi:10.1038/cr.2015.116เรียนบรรณาธิการEndosperms ธัญพืชที่ประกอบเป็นชั้น aleurone ภายนอกและมีเอนโดสเปิร์มฟูมภายใน ให้กว่า 70% อาหารสำหรับมนุษย์ [ส่วน www.fao.org] เย็บเล่ม ข้าวเอนโดสเปิร์มพัฒนาเกิดขึ้นใน caryopsis ของเม็ด ระหว่างข้าวบรรจุขั้น ซูโครสผลิตในใบไม้ photosynthetic จะขนให้แป้งผ่านเปลือกชั้นใน [1, 2] จึงมีการเสนอว่า ซูโครส มาถึงใน caryopsis ผ่านเปลือกชั้นในอยู่กลุ่มสคิว dorsal บางส่วน hydrolyzed โดยผนังเซลล์ invertases (CINs) เป็นน้ำตาลกลูโคสและฟรักโทส [3, 4] เนื่องจากเอนโดสเปิร์ม แยกต่างหากจากเนื้อเยื่อแม่ symplastically มันจะสันนิษฐานว่า น้ำตาลเหล่านี้ถูกส่งเอนโดสเปิร์มอย่างผ่านทางเดิน apoplastic โดยผู้น้ำตาลแห่ง aleurone [5, 6] อย่างไรก็ตาม บทบาทแน่นอนของ aleurone ในการควบคุมการขนส่งน้ำตาลยังคงไม่ทราบ ในการศึกษานี้ microarray วิเคราะห์ได้จัดทำในข้าว (Oryza ซา L., 11 จงหัว) เพื่อระบุปัจจัย transcription (TFs) differentially แสดงระหว่างเอนโดสเปิร์มฟูม aleurone ใน caryopses รวบรวมที่ 11-14 วันหลังจาก pollination (DAP), ขั้นเมื่อเมล็ดข้าวที่บรรจุอยู่ จาก TFs 949 ที่ได้แสดง differentially, 505 ถูกกำหนดขึ้นในการ aleurone ทำ PCR แบบเรียลไทม์ตรวจสอบรูปแบบนิพจน์ของพวกเขาต่อไป Os02g0725900 เข้ารหัส B1 Y ปัจจัยนิวเคลียร์ (NF-YB1) ที่แสดงให้แสดงใน caryopses จาก 4 กับ 21 DAP (c4 ให้ c21), คล้ายกับผลประกาศเมื่อเร็ว ๆ นี้ [7], ในขณะที่นิพจน์ไม่ถูกตรวจพบในผักเรื้อรังเนื้อเยื่อตรวจสอบ (รูปที่ 1A) ภายใน caryopses นิพจน์ NF YB1 อุดมสมบูรณ์พบ testa aleurone ผสมตัวอย่าง (+ t), แต่ไม่ได้อยู่ ในเอนโดสเปิร์มฟูม (se รูปที่ 1A) NF YB1 เป็นสมาชิกครอบครัว NF-Y TFs ที่อาศัยใน eukaryotic ชีวิตทั้งหมด NF-Ys มักแบบ trimers กับ NF หนึ่ง-ยา NF-YB หนึ่ง และหนึ่ง NF-YC และผูกกับ CCAAT ที่ประกอบด้วยกำกับดูแลองค์ประกอบ [8] 10 NF-ยาสไอส์ YBs NF 11 และ YCs NF 7 อยู่ในกลุ่มข้าว ซึ่งอาจผลิตมากกว่า 700 heterotrimeric คอมเพล็กซ์ [8] ใน situ hybridization แสดงให้เห็นว่า ในระหว่างการพัฒนา caryopsis นิพจน์ของ NF YB1 แรกพบที่ periphery of coenocytic endosperms at 4 DAP, and confined to dorsal aleurone (adjacent to the primary vascular bundle and nucellar projection) at 5 DAP, and then expanded to the whole aleurone at 7, 9 and 11 DAP (stronger at the dorsal side). No expression was observed in maternal tissues such as the dorsal vascular bundle and the nucellar projection (Figure 1B and Supplementary information, Figure S1A). The expression correlated with the rapid increase of fresh caryopsis weight during this period (Supplementary information, Figure S1B). GUS staining in transgenic plants carrying 3 018 base pairs (bp) of NF-YB1 5′ upstream sequence fused to β-Glucuronidase (GUS) confirmed the expression pattern, and revealed no GUS expression in any other tissues examined (Supplementary information, Figure S1C). These results together suggest NF-YB1 is specifically expressed in aleurone. Two CRISPR-Cas9 constructs expressing guide RNAs targeting different regions of the second exon of NF-YB1 were made and used to transform into rice (Zhonghua 11). Sequencing of PCR-amplified NF-YB1 genomic DNA from transgenic plants allowed us to identify two knockout mutants: nfyb1-1 with an adenine insertion and nfyb12 with a thymine insertion into the second exon (Figure 1C and Supplementary information, Figure S2A), predicted to produce truncated polypeptides with only 16 and 34 amino acids (AA) identical to NF-YB1 in nfyb1-1 and nfyb12, respectively (Supplementary information, Figure S2B). Although no visible phenotype was observed during vegetative growth, grains produced from homozygous nfyb1-1 and nfyb1-2 plants showed a chalky endosperm phenotype, suggesting a defect in grain filling (Figure 1D). Additionally, an RNA interference (RNAi) construct with a 350-bp fragment targeting the second exon of NF-YB1, expressed under the control of maize Ubiquitin 1 promoter, was made and transformed into rice (Zhonghua 11). Caryopses excised from 3 independent transgenic lines showed reduced NF-YB1 expression (Supplementary information, Figure S2C) and a similar chalky endosperm phenotype as nfyb1-1 and nfyb12 (Supplementary information, Figure S2D). These data together suggest that NF-YB1 plays an important role in rice grain filling. ข้อที่ 2 ของผู้ซูโครสใน aleuronenpgวิจัยเซลล์ | www.nature.com/crรูปที่ 1 NF-YB1-ควบคุมค่าของซูโครส 3 ผู้ช่วยกรอกข้าวเมล็ดข้าว (A) วิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ที่แสดงว่า NF YB1 แสดงใน caryopses ที่ 4, 7, 11, 14 และ 21 DAP และ caryopses รวบรวมที่ 11 DAP, NFYB1 สูงแสดง aleurone ผสมและเนื้อเยื่อ testa l ใบไม้ r ราก p, panicles o รังไข่ c2 กับ c31 เก็บที่ 2-31 DAP; caryopses se และ + t เอนโดสเปิร์มฟูม และผสม aleurone และ testa ตัวอย่างเก็บรวบรวมที่ 11 หลักสูตร DAP ตามลำดับ ข้อมูลจะแสดงเป็นหมายถึง ± SD (n = 3) (ข) situ ใน hybridization ในส่วน ๆ caryopses รวบรวมที่ 2, 4, 5, 9 และ 11 DAP ใช้ antisense (แผงด้านบน) และคลิปปากตะเข้รู้สึก (แผงล่าง) แสดงว่า NF YB1 ขอแสดง aleurone ไอนิงไบ et al3 npgwww.cell-research.com | วิจัยเซลล์ตั้งแต่ nfyb1-1 และ nfyb1-2 แสดง phenotype จำแนกไม่ได้ nfyb1-1 จึงใช้ในการทดลองต่อไป Caryopsis nfyb1 1 ผู้ใหญ่พบ 18% ลดน้ำหนักแห้ง (รายละเอียดเพิ่มเติม รูป S2E) การสแกนตรวจสอบ microscopy อิเล็กตรอนเปิดเผยว่า endosperms ใน nfyb1 1 ดำเนินการขนาดเล็ก และรวบรวมไว้ซึ่งแป้งเม็ด ซึ่งแตกต่างอย่างเด่นชัดจากเม็ดแป้งขนาดใหญ่ และแน่นเต็มไปใน wildtype (WT รูปที่ 1E) ความยาวเฉลี่ยของเม็ดแป้ง nfyb1 1 ตามแกนยาว μm ± 0.6 4.4 เมื่อเทียบกับ 7.8 ± 1.0 μm ใน WT (ข้อมูลเพิ่มเติม รูป S2F) ได้ Chromatography ก๊าซ quadrupole สามโตรเมทรี (GC-QQQ-MS / MS) วิเคราะห์พบว่า เนื้อหาของซูโครส ฟรักโทส และกลูโคสในการเก็บรวบรวมไว้ที่ 6, 9 และ 11 DAP caryopses nfyb1-1 ได้ลดลงมากเมื่อเทียบกับใน WT (รูป 1F) ข้อมูลเหล่านี้แนะนำว่า phenotype chalky เอนโดสเปิร์มใน nfyb1 1 อาจเกิดจากการจัดส่งน้ำตาลถูกโจมตี เราจากนั้นตรวจสอบนิพจน์รูปแบบของยีนที่เกี่ยวข้องกับน้ำตาลที่โหลดใน nfyb1-1 ทั้งหมดห้าซูโครสผู้ (SUTs, 1-5) ในกลุ่มข้าว CIN2 และ Monosaccharide ขนส่ง 4 (MST4) ทราบว่าการแสดงในระยะต่าง ๆ ของข้าว caryopses [9, 4, 10] ทำ PCR แบบเรียลไทม์ใน caryopses ทาง DAP 5 พบว่า ระดับของนิพจน์ SUT1, SUT3, SUT4 และ MST4 ได้อีกครั้งduced nfyb1-1 ในขณะที่ไม่ลดเห็นได้ชัดเป็นสังเกตสำหรับ SUT2 (รูป 1 G), แนะนำที่ SUT1, SUT3, SUT4 และ MST4 อาจจะกำหนดใน NF-YB1 เพื่อถ้า NF YB1 สามารถผูกกับกำกับดูแลองค์ประกอบของยีนเหล่านี้ขนส่งน้ำตาล ยีสต์ผสมหนึ่งทดลองทำใช้ NF YB1 fused GAL4 transcriptional เรียกใช้โดเมนเป็นกลุ่มเป้าหมาย และลำดับขั้นต้นน้ำ 5′ SUT1, SUT3, SUT4, MST4 หรือ SUT2 fused เพื่อ LacZ เป็น baits หลังจากการเปลี่ยนแปลงร่วมของเหยื่อกับเหยื่อแต่ละรายเป็นยีสต์ เราสังเกตว่า NF YB1 สามารถเรียกใช้นิพจน์ LacZ เมื่อ SUT1, SUT3, SUT4 หรือ MST4 5′ ลำดับใช้ ในขณะที่เปิดใช้งานไม่พบสำหรับ SUT2 (รูปที่ 1 H) กล่าวเพิ่มเติม ว่า NF YB1 ต้องเปิดใช้งานของผู้นี้น้ำตาลในพืช วิเคราะห์ luciferase (ลุค) ที่ดำเนินการในเครื่องที่ใช้แยกต่างหากจากข้าว etiolated กล้าไม้ โดยการเปลี่ยนแปลงร่วมของ p35S::NF-YB1::tNOS pSUT1::LUC, pSUT3::LUC, pSUT4::LUC, pMST4::LUC หรือ pSUT2::LUC โป เป็นแสดงในรูป 1I กิจกรรมลุคอย่างมีนัยสำคัญสูงตรวจพบเมื่อ pSUT1::LUC, pSUT3::LUC และ pSUT4::LUC ใช้ ในขณะที่มีสังเกตระดับไม่สำคัญสำหรับ pMST4::LUC และ pSUT2::LUC, MST4 และ SUT2 ในการบ่งชี้อาจเป็นเป้าหมายโดยตรงของ NF-YB1 กล่อง CCAAT putative หลายระบุใน 5′ ค่า(arrowheads), but not in maternal tissues, or in starchy endosperm. dv, dorsal vascular bundle; np, nucellar projection. Bar = 100 μm. (C) nfyb1-1 and nfyb1-2 knockout mutants generated by CRISPR-Cas9. Upper panel, a gene model of NF-YB1 to show positions of single-nucleotide insertions in nfyb1-1 and nfyb1-2. Lower panel, mutation sites in nfyb1-1 and nfyb1-2, as compared to WT sequences. Sequence in bold, target sites; underlined, protospacer-adjacent motif sequences (PAMs). Arrowheads indicate inserted single nucleotides. (D) Mature grains of nfyb1-1 and nfyb1-2, showing the chalky endosperm phenotype as compared to the semi-transparent endosperm in WT. Upper panel, side views of intact caryopses; lower panel, surface views of cracked caryopses. en, endosperm; em, embryo. Bars = 1 mm. (E) Scanning electron microscopy images of cracked mature WT and nfyb1-1 caryopses at different magnifications, showing smaller and loosely packed starch grains in nfyb1-1, as compared to large and tightly packed ones in the WT. Scale bars: 500 μm (top), 25 μm (middle), 5 μm (bottom). (F) Sucrose, fructose, and glucose contents (μg in mg fresh weight) in developing caryopses collected at 6, 9 and 11 DAP, showing significantly reduced accumulation of all these sugars in nfyb1-1, as compared to that in the WT caryopses at the same stage. Data shown as means ± SD (n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01, based on Student’s t-test). (G) Expression levels of SUT1, SUT3, SUT4 and MST4 were reduced in nfyb1-1 caryopses collected at 5 DAP, as compared to those in WT. Expression levels of these genes in the WT were normalized to 1. No significant reduction was observed for SUT2. Data shown as means ± SD (n = 3). (H) Yeast one-hybrid assay to show bindings of NF-YB1 to SUT1, SUT3, SUT4 and MST4 regulatory elements.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแสดงออกของ NF-YB1 ควบคุมการขนส่งน้ำตาลซูโครสใน aleurone อำนวยความสะดวกในการโหลดน้ำตาล endosperm ข้าววิจัยเซลล์ล่วงหน้าสิ่งพิมพ์ออนไลน์ 25 กันยายน 2015; ดอย: 10.1038 / cr.2015.116
เรียนบรรณาธิการ
endosperms ธัญพืชซึ่งประกอบด้วยชั้นนอก aleurone และ endosperm แป้งภายในให้มากกว่า 70% สำหรับอาหารหลักของมนุษย์ [www.fao.org] ข้าว endosperm การพัฒนาที่เกิดขึ้นใน caryopsis ข้าวที่ ในระหว่างขั้นตอนการบรรจุข้าว, น้ำตาลซูโครสที่ผลิตในใบการสังเคราะห์แสงจะถูกส่งไปธัญพืชผ่านใยเปลือกไม้ [1, 2] มันได้รับการเสนอซูโครสที่เมื่อเดินทางมาถึงใน caryopsis ผ่านใยเปลือกไม้ที่ตั้งอยู่ที่กำหลอดเลือดหลังถูกไฮโดรไลซ์บางส่วนจากผนังเซลล์ invertases (CINs) เป็นน้ำตาลกลูโคสฟรุกโตสและ [3, 4] ตั้งแต่ endosperm จะถูกแยกออกจากเนื้อเยื่อ symplastically มารดามันจะสันนิษฐานว่าน้ำตาลเหล่านี้จะถูกส่งไปยัง endosperm แข็งขันผ่านทางเดิน apoplastic โดยขนส่งน้ำตาลอยู่ใน aleurone [5, 6] แต่บทบาทที่แน่นอนของ aleurone ในการควบคุมการขนส่งน้ำตาลยังไม่ทราบ ในการศึกษานี้วิเคราะห์ microarray ถูกดำเนินการในข้าว (Oryza sativa L. , Zhonghua 11) ระบุปัจจัยถอดความ (TFS) แสดงความแตกต่างกันระหว่าง endosperm แป้งและ aleurone ใน caryopses เก็บที่ 11-14 วันหลังจากการผสมเกสร (DAP) ขั้นตอนเมื่อ บรรจุเมล็ดมีการใช้งาน ออกจาก 949 TFS ที่ถูกแสดงออกแตกต่างกัน, 505 ถูกขึ้นควบคุมใน aleurone PCR แบบ Real-time ได้ดำเนินการในการตรวจสอบรูปแบบการแสดงออกของพวกเขาต่อไป Os02g0725900 เข้ารหัสนิวเคลียร์ปัจจัย Y B1 (NF-YB1) ได้รับการแสดงที่จะแสดงใน caryopses 4-21 DAP (c4 จะ c21) คล้ายกับผลการตีพิมพ์เมื่อเร็ว ๆ นี้ [7] ในขณะที่การแสดงออกไม่ถูกตรวจพบในเนื้อเยื่อพืชตรวจสอบ (รูปที่ 1A) ภายใน caryopses มากมายแสดงออก NF-YB1 ถูกตรวจพบในตัวอย่างผสม aleurone-Testa (A + t) แต่ไม่ได้อยู่ใน endosperm แป้ง (SE รูปที่ 1A) NF-YB1 เป็นของ NF-Y TFS ครอบครัวที่ได้รับการอนุรักษ์ในสิ่งมีชีวิต eukaryotic ทั้งหมด NF-อีสแบบปกติ Trimers กับ NF-YA หนึ่ง NF-YB และ NF-YC และผูกกับ CCAAT ที่มีองค์ประกอบของการกำกับดูแล [8] สิบ NF-Yas เอ็ด NF-YBS เจ็ด NF-YCS ที่มีอยู่ในจีโนมข้าวซึ่งอาจจะผลิตกว่า 700 คอมเพล็กซ์ heterotrimeric [8] ในแหล่งกำเนิดพันธุ์พบว่าในระหว่างการพัฒนา caryopsis การแสดงออกของ NF-YB1
พบครั้งแรกที่รอบนอกของendosperms coenocytic ที่ 4 DAP และถูกคุมขังใน aleurone หลัง (อยู่ติดกับกำหลอดเลือดหลักและประมาณการเกิดจากเนื้อเยื่อ) 5 DAP แล้ว ขยายไปทั้ง aleurone ที่ 7, 9 และ 11 DAP (แข็งแกร่งด้านหลัง) การแสดงออกไม่พบว่าในเนื้อเยื่อของมารดาเช่นกำหลอดเลือดหลังและประมาณการเกิดจากเนื้อเยื่อ (รูปที่ 1B และข้อมูลเสริมรูป S1A) การแสดงออกความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของน้ำหนัก caryopsis สดในช่วงเวลานี้ (ข้อมูลเสริมรูป S1B) การย้อมสี GUS ในพืชดัดแปรพันธุกรรมแบก 3 018 คู่เบส (bp) ของ NF-YB1 5 'ลำดับต้นน้ำผสมเพื่อเบต้า Glucuronidase (กัส) ได้รับการยืนยันรูปแบบการแสดงออกและเปิดเผยไม่แสดงออก GUS ในเนื้อเยื่ออื่น ๆ ตรวจสอบ (ข้อมูลเสริมรูป S1C ) ผลลัพธ์เหล่านี้เข้าด้วยกันแนะนำ NF-YB1 จะแสดงเฉพาะใน aleurone สอง CRISPR-Cas9 สร้างการแสดง RNAs คู่มือกำหนดเป้าหมายภูมิภาคต่างๆของเอกซ์ซอนที่สองของ NF-YB1 ถูกสร้างขึ้นและใช้ในการแปลงร่างเป็นข้าว (Zhonghua 11) ลำดับของ PCR-ขยาย NF-YB1 ดีเอ็นเอจากพืชดัดแปรพันธุกรรมให้เราสามารถระบุสองกลายพันธุ์ที่น่าพิศวง: nfyb1-1 ที่มีการแทรก adenine และ nfyb12 กับมีนแทรกเข้าไปในเอกซ์ซอนที่สอง (รูปที่ 1C และข้อมูลเสริมรูป S2A) ที่คาดการณ์ไว้ ในการผลิตที่ถูกตัดทอน polypeptides มีเพียง 16 และ 34 กรดอะมิโน (AA) เหมือนกับ NF-YB1 ใน nfyb1-1 และ nfyb12 ตามลำดับ (ข้อมูลเสริมรูป S2B) แม้ว่าจะไม่สามารถมองเห็นได้ฟีโนไทป์เป็นที่สังเกตในระหว่างการเจริญเติบโตของพืช, ธัญพืชที่ผลิตจากพืช homozygous nfyb1-1 nfyb1-2 และแสดงให้เห็นว่าฟีโนไทป์ endosperm จั๊วะบอกข้อบกพร่องในการบรรจุเม็ด (รูปที่ 1 วัน) นอกจากนี้การแทรกแซงอาร์เอ็นเอ (RNAi) สร้างด้วยชิ้นส่วน 350 bp กำหนดเป้าหมายเอกซ์ซอนที่สองของ NF-YB1 แสดงภายใต้การควบคุมของ Ubiquitin ข้าวโพด 1 โปรโมเตอร์ที่ถูกสร้างขึ้นมาและกลายเป็นข้าว (Zhonghua 11) Caryopses ตัดจาก 3 สายพันธุ์ที่เป็นอิสระแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกลดลง NF-YB1 (ข้อมูลเสริมรูป S2C) และฟีโนไทป์ endosperm จั๊วะที่คล้ายกันเป็น nfyb1-1 และ nfyb12 (ข้อมูลเสริมรูป S2D) ข้อมูลเหล่านี้ร่วมกันแสดงให้เห็นว่า NF-YB1 มีบทบาทสำคัญในการบรรจุข้าว.
2 ข้อบังคับของการขนส่งน้ำตาลซูโครสใน aleuronenpg
วิจัยเซลล์ | www.nature.com/cr
รูปที่ 1 NF-YB1 ควบคุมการแสดงออกของสามขนส่งน้ำตาลซูโครสอำนวยความสะดวกในการบรรจุข้าวในข้าว (A) แบบ Real-time PCR การวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่า NF-YB1 จะแสดงใน caryopses ที่ 4, 7, 11, 14 และ 21 DAP; และ caryopses เก็บที่ 11 DAP, NFYB1 จะแสดงอย่างสูงใน aleurone ผสมและเนื้อเยื่อ Testa ลิตรใบ; อาราก; พี, ช่อดอก; o รังไข่; c2 จะ C31, caryopses เก็บที่ 2-31 DAP; SE และ + T, endosperm แป้งและ aleurone ผสมและตัวอย่าง Testa เก็บที่ 11 DAP ตามลำดับ ข้อมูลจะถูกแสดงให้เห็นว่าหมายถึง± SD (n = 3) (ข) ในแหล่งกำเนิดพันธุ์ใน caryopses แบ่งเก็บที่ 2, 4, 5, 9 และ 11 DAP ใช้ antisense (แผงบน) และยานสำรวจความรู้สึก (แผงล่าง) แสดงให้เห็นว่า NF-YB1 จะแสดงอย่างยิ่งใน aleurone
Ai-หนิงตากใบและ al.
3 NPG
www.cell-research.com | วิจัยเซลล์ตั้งแต่ nfyb1-1 nfyb1-2 และแสดงให้เห็นว่าฟีโนไทป์แยกไม่ออก, nfyb1-1 จึงถูกนำมาใช้ในการทดลองที่ตามมา
caryopsis nfyb1-1 ผู้ใหญ่แสดงให้เห็นว่าการลดลง 18% ในน้ำหนักแห้ง (ข้อมูลเสริมรูป S2E) สแกนสอบกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเปิดเผยว่าใน nfyb1-1 endosperms ดำเนินการขนาดเล็กและขนาดบรรจุหลวมเม็ดแป้งซึ่งโดดเด่นแตกต่างจากขนาดใหญ่และแน่นเม็ดแป้งใน wildtype (น้ำหนัก; รูป 1E) ความยาวเฉลี่ยของเม็ดแป้ง nfyb1-1 ตามแนวแกนยาวเป็น 4.4 ± 0.6 ไมโครเมตรเมื่อเทียบกับ 7.8 ± 1.0 ไมครอนใน WT (ข้อมูลเสริมรูป S2F) แก๊ส chromatography สาม quadrupole มวลสาร (GC-MS-QQQ / MS) การวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าเนื้อหาของซูโครสฟรักโทสและกลูโคสใน caryopses nfyb1-1 เก็บที่ 6, 9 และ 11 DAP ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับผู้ที่อยู่ใน WT (รูปที่ 1F) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าฟีโนไทป์ endosperm จั๊วะใน nfyb1-1 อาจเกิดจากการส่งมอบน้ำตาลที่ถูกบุกรุก จากนั้นเราจะตรวจสอบรูปแบบการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการโหลดน้ำตาลใน nfyb1-1 ทั้งห้า Transporters ซูโครส (SUTs, 1-5) ในจีโนมข้าว CIN2 และโมโนแซ็กคาไรด์ Transporter 4 (MST4) เป็นที่รู้จักกันจะแสดงในแต่ละขั้นตอนของ caryopses ข้าว [9, 4, 10] PCR แบบ Real-time ดำเนินการใน caryopses เก็บที่ 5 DAP แสดงให้เห็นว่าระดับของ SUT1, SUT3, SUT4 และการแสดงออก MST4
อีกครั้งโฉมในnfyb1-1 ในขณะที่ไม่มีการลดลงเห็นได้ชัดเป็นข้อสังเกตสำหรับ SUT2 (1G รูป) บอก SUT1 ที่ SUT3, SUT4 MST4 และอาจจะถูกควบคุมโดย NF-YB1 ที่อยู่ถ้า NF-YB1 สามารถผูกกับองค์ประกอบกฎระเบียบเหล่านี้ยีนขนส่งน้ำตาลยีสต์ทดลองหนึ่งไฮบริดได้รับการดำเนินการโดยใช้ NF-YB1 ผสมกับโดเมนยืนยันการใช้งานการถอดรหัส GAL4 เป็นเหยื่อและ 5 'ลำดับต้นน้ำของ SUT1, SUT3, SUT4, MST4 หรือ SUT2 ผสมเพื่อ lacZ เป็นเหยื่อ หลังจากร่วมการเปลี่ยนแปลงของเหยื่อที่มีเหยื่อแต่ละคนลงในยีสต์ที่เราตั้งข้อสังเกตว่า NF-YB1 สามารถที่จะเปิดใช้งานการแสดงออก lacZ เมื่อ SUT1, SUT3, SUT4 หรือ MST4 5 'ลำดับถูกนำมาใช้ในขณะที่การเปิดใช้งานไม่ได้รับการตรวจพบ SUT2 (รูป 1H) . เพื่อเพิ่มเติมอยู่ถ้า NF-YB1 คือสามารถเปิดใช้งานการแสดงออกของเหล่าขนส่งน้ำตาลในพืช luciferase (LUC) ได้ดำเนินการทดสอบในหลอดทดลองโดยใช้โปรโตพลาที่แยกได้จากต้นกล้าข้าว etiolated โดยผู้ร่วมการเปลี่ยนแปลงของ p35S :: NF-YB1 :: TNOs กับ ทั้ง pSUT1 :: LUC, pSUT3 :: LUC, pSUT4 :: LUC, pMST4 :: LUC หรือ pSUT2 :: LUC ในฐานะที่เป็นแสดงให้เห็นในรูปที่ 1I อย่างมีนัยสำคัญยกระดับกิจกรรม LUC ถูกตรวจพบเมื่อ pSUT1 :: LUC, pSUT3 :: LUC และ pSUT4 :: LUC ถูกนำมาใช้ในขณะที่ไม่มีการยกระดับอย่างมีนัยสำคัญเป็นข้อสังเกตสำหรับ pMST4 :: LUC และ pSUT2 :: LUC แสดงให้เห็น MST4 และ SUT2 อาจจะไม่เป็นเป้าหมายโดยตรงของ NF-YB1 หลายกล่อง CCAAT สมมุติที่ถูกระบุใน 5 'ขึ้น
(หัวลูกศร) แต่ไม่ได้อยู่ในเนื้อเยื่อของมารดาหรือใน endosperm แป้ง DV, กำหลอดเลือดหลัง; เอ็นพีประมาณการเกิดจากเนื้อเยื่อ บาร์ = 100 ไมโครเมตร (C) การกลายพันธุ์ที่น่าพิศวงและ nfyb1-1 nfyb1-2 สร้างขึ้นโดย CRISPR-Cas9 แผงบนรูปแบบของยีนของ NF-YB1 เพื่อแสดงตำแหน่งที่มีการแทรกเดียวเบื่อหน่ายใน nfyb1-1 และ nfyb1-2 แผงล่างเว็บไซต์การกลายพันธุ์ใน nfyb1-1 และ nfyb1-2 เมื่อเทียบกับลำดับ WT ลำดับตัวหนาเว็บไซต์เป้าหมาย ที่ขีดเส้นใต้ลำดับบรรทัดฐาน protospacer ติดกัน (PAMS) หัวลูกศรระบุแทรกนิวคลีโอซิงเกิ้ล (D) ธัญพืชผู้ใหญ่ของ nfyb1-1 และ nfyb1-2 แสดงฟีโนไทป์ endosperm จั๊วะเมื่อเทียบกับ endosperm กึ่งโปร่งใสใน WT แผงบนมุมมองด้านข้างของ caryopses เหมือนเดิม; แผงล่างมุมมองที่พื้นผิวของ caryopses แตก en, endosperm; em ตัวอ่อน บาร์ = 1 มิลลิเมตร (E) ภาพกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสแกน WT ผู้ใหญ่แตกและ caryopses nfyb1-1 ที่กำลังขยายที่แตกต่างกันแสดงให้เห็นขนาดเล็กและบรรจุหลวมธัญพืชแป้งใน nfyb1-1 เมื่อเทียบกับคนที่มีขนาดใหญ่และแน่นใน WT บาร์ขนาด 500 ไมครอน (บน), 25 ไมครอน (กลาง) 5 ไมครอน (ล่าง) (F) ซูโครสฟรักโทสและกลูโคสเนื้อหา (ไมโครกรัมมิลลิกรัมน้ำหนักสด) ในการพัฒนาที่เก็บรวบรวม caryopses 6, 9 และ 11 DAP แสดงการสะสมลดลงอย่างมากของน้ำตาลเหล่านี้ทั้งหมดใน nfyb1-1 เมื่อเทียบกับว่าใน WT caryopses ในขั้นตอนเดียว ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าหมายถึง± SD (n = 3 * p <0.05, ** P <0.01 ขึ้นอยู่กับนักศึกษา t-test) (G) ระดับการแสดงออกของ SUT1, SUT3, SUT4 MST4 และลดลงใน caryopses nfyb1-1 เก็บที่ 5 DAP เมื่อเทียบกับผู้ที่อยู่ใน WT ระดับการแสดงออกของยีนเหล่านี้ใน WT ถูกปกติ 1 ไม่มีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญเป็นข้อสังเกตสำหรับ SUT2 ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าหมายถึง± SD (n = 3) (H) ยีสต์ทดสอบหนึ่งไฮบริดที่จะแสดงการผูกของ NF-YB1 เพื่อ SUT1, SUT3, SUT4 MST4 และองค์ประกอบการกำกับดูแล

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

nf-yb1-regulated การแสดงออกของน้ำตาลซูโครสในลิวโรนตัวช่วยโหลดน้ำตาลข้าวการประเมินผลการวิจัยเซลล์ล่วงหน้าออนไลน์ตีพิมพ์ 25 กันยายน 2015 ; ดอย : 10.1038 / cr.2015.116

ถึงบรรณาธิการ endosperms ธัญพืช ซึ่งประกอบด้วยชั้นชั้นนอกและชั้นในลิวโรน endosperm แป้งให้มากกว่า 70% อาหารหลัก www.fao มนุษย์ [ . . . ]การประเมินผลการพัฒนาข้าวเกิดขึ้นในแครีอ็อปซิสของเมล็ดข้าว ระหว่างเมล็ดข้าวเต็มเวที น้ำตาลทรายที่ผลิตในใบสังเคราะห์แสงเป็นขนส่งธัญพืชผ่านมฤคทายวัน [ 1 , 2 ] ก็มีการเสนอว่า ซูโครส เมื่อมาถึงในแครีอ็อปซิสผ่านมฤคทายวันตั้งอยู่ที่มัดท่อลำเลียงด้านข้าง เป็นบางส่วน ไฮโดรไลซ์ด้วยผนังเซลล์ trans-4 - [ 2 - ( cins ) ให้เป็นกลูโคสและฟรักโทส [ 3 , 4 ]ตั้งแต่แยกจากเนื้อเยื่อ symplastically endosperm คือมารดา ว่ากันว่า น้ำตาลเหล่านี้จะถูกส่งไปยังหน่วยคำอย่างผ่านทาง apoplastic โดยใช้น้ำตาล ผู้ตั้งอยู่ในลิวโรน [ 5 , 6 ] อย่างไรก็ตาม แน่นอนบทบาทของลิวโรนในการควบคุมการขนส่งน้ำตาลยังคงไม่ทราบแน่ชัด ในการศึกษานี้ ได้วิเคราะห์ข้อมูล microarray แสดงในข้าว ( Oryza sativa L .จง ว 11 ) เพื่อระบุปัจจัยการถอดความ ( TFS ) แสดงออกแตกต่างกันระหว่าง endosperm และแป้งใน caryopses ลิวโรนรวบรวมที่ 11 ถึง 14 วันหลังการผสมเกสร ( DAP ) ขั้นตอน เมื่อบรรจุเม็ดอยู่ จาก 949 TFS ที่แสดงออกแตกต่างกัน 505 ถูกกระตุ้นในลิวโรน . เวลาจริงการตรวจสอบดีเอ็นเอ รูปแบบการแสดงออกของตนเองต่อไปos02g0725900 นิวเคลียร์ปัจจัย y B1 การเข้ารหัส ( nf-yb1 ) ได้แสดงให้แสดงออกใน caryopses จาก 4 21 DAP ( C4 จะ c21 ) คล้ายกับผลที่เผยแพร่เมื่อเร็ว ๆนี้ [ 7 ] , ในขณะที่ไม่พบการแสดงออกในเนื้อเยื่อพืชการตรวจสอบ ( รูปที่ 1A ) ภายใน caryopses การแสดงออก nf-yb1 มากมายถูกตรวจพบในเทสทาลิวโรนผสมตัวอย่าง ( T ) แต่ไม่ใช่แป้งเอนโดสเปิร์ม ( เซ ; รูปที่ 1A )nf-yb1 เป็นของ nf-y ครอบครัว TFS ที่อนุรักษ์สิ่งมีชีวิตยูคาริโอติกทั้งหมด NF เยซองมักจะฟอร์ม trimers กับ nf-ya หนึ่ง nf-yb และหนึ่ง nf-yc และผูก ccaat ประกอบด้วยองค์ประกอบ [ 8 ] กฎระเบียบ สิบยาส NF , สิบเอ็ด NF แล้วเจ็ด ycs NF อยู่ในจีโนมข้าว ซึ่งอาจผลิตกว่า 700 heterotrimeric เชิงซ้อน [ 8 ] ใน situ hybridization พบว่าในระหว่างการพัฒนาแครีอ็อปซิส การแสดงออกของ nf-yb1 พบครั้งแรกที่
รอบนอกของโต๊ะประชุม endosperms 4 DAP และคับหลังลิวโรน ( ติดกับหลักมัดท่อและประมาณการ nucellar ) ที่ 5 DAP และจากนั้นขยายไปยังลิวโรนทั้งหมดที่ 7 , 9 และ 11 DAP ( แข็งแกร่งที่ด้านหลัง )ไม่พบการแสดงออกในเนื้อเยื่อของมารดา เช่น หลังมัดท่อและ nucellar ฉาย ( 1B รูปและข้อมูล เพิ่มเติมรูป s1a ) การแสดงออกมีความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของน้ำหนักแครีอ็อปซิสสดในช่วงเวลานี้ ( ข้อมูลเพิ่มเติมรูป s1b )กัสจากพันธุกรรมพืชแบก 3 018 คู่เบส ( BP ) ของ nf-yb1 5 ดูแลต้นน้ำลำดับผสมกับบีตาที่มีอวัยวะ ( กัส ) ยืนยันรูปแบบการแสดงออก และไม่เปิดเผย กัส การแสดงออกในเนื้อเยื่ออื่น ๆตรวจสอบ ( ข้อมูลเพิ่มเติมรูป s1c ) ผลลัพธ์เหล่านี้ด้วยกันแนะนำ nf-yb1 โดยเฉพาะการแสดงออกในลิวโรน .