State-of-the-art RNA based analyses

State-of-the-art RNA based analyses still rely mainly on fresh or cryopreserved samples, ensuring a much better preservation of biomolecules than fixation with formalin. In agarose gels or electropherograms intact total RNA extracted from cryopreserved tissue displays two distinct bands or peaks from the structural RNA of the eukaryotic 18 s and 28 s ribosome subunits (rRNA). The abundance, defined size and ratio of these two bands/peaks allows their use as surrogate markers of RNA fragmentation by calculating the ratio of the rRNA bands (28S:18S) or using the shape of the electropherogram to derive parameters, such as the RIN value (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). While these assays are well established for RNA from fresh or cryopreserved tissues, it is also known that the two distinct rRNA peaks are compromised in RNA extracted from tissues fixed in formalin or other denaturing fixatives [22]. It is furthermore unclear how well the fragment size distribution of the ribosomal RNA predicts the behavior of the messenger RNA (mRNA) subsequently used as source material for gene expression studies. Because rRNA is a structural component of the ribosome it could be extensively cross-linked to the amino acids of the ribosomal proteins leading to more extensive degradation of rRNA. In addition, the structural integrity does not necessarily correlate with chemical modifications and performance of RNA in enzymatic reactions. Several groups have already reported on the impact of formalin fixation on qRT-PCR [23]–[25]. Building on these previous reports we have now performed a comprehensive and comparative study of the impact of different pre-analytical steps on RNA fragmentation and performance in different analytical reactions. The goal was to identify the most critical pre-analytical steps that should also become the target for more accurate quality control for instance by using different assays presented in our study. Based on the assumption that the crosslinking of biomolecules is a major contributor to RNA degradation, we explored the detrimental effects of the routinely used crosslinking fixative formalin on RNA molecules in comparison with a non-crosslinking, alcohol-based fixative, by taking the Tissue Tek Xpress Molecluar fixative (TTXMF) as example and cryopreserved samples as reference for molecular analyses.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ศิลปะของ RNA คะแนนวิเคราะห์ยังคงพึ่งพาส่วนใหญ่สด หรือ cryopreserved ตัวอย่าง มั่นใจมีมากดีกว่าเก็บรักษาชื่อโมเลกุลชีวภาพกว่าตรึงด้วย formalin ใน agarose เจลหรือ electropherograms เหมือนเดิมรวม RNA จากเนื้อเยื่อ cryopreserved แสดงสองวงแตกยอดจาก RNA โครงสร้าง 18 eukaryotic s และ 28 s ไรโบโซมโปรแกรม (rRNA) อุดมสมบูรณ์ กำหนดขนาด และอัตราส่วนของวงดนตรี/ยอดสองเหล่านี้ช่วยให้การใช้เป็นตัวแทนเครื่องหมายของการกระจายตัวของอาร์เอ็นเอ โดยการคำนวณอัตราส่วนของวงดนตรี rRNA (28S:18S) หรือใช้รูปทรงของ electropherogram ที่ได้พารามิเตอร์ เช่นค่าริ้น (Agilent เทคโนโลยี ซานตาคลารา CA, USA) ในขณะที่เหล่า assays ดีก่อตั้งสำหรับ RNA จากเนื้อเยื่อสด หรือ cryopreserved มันเป็นที่รู้จักกันว่า ยอดเขาสองระดับ rRNA จะถูกบุกรุกในอาร์เอ็นเอที่สกัดจากเนื้อเยื่อถาวรใน formalin หรือ fixatives denaturing อื่น ๆ [22] ได้นอกจากนี้ความชัดเจนวิธีที่ดีการกระจายขนาดส่วนของ ribosomal RNA การคาดการณ์การทำงานของ messenger RNA (mRNA) ต่อมาใช้เป็นแหล่งข้อมูลสำหรับศึกษาการแสดงออกของยีน เนื่องจาก rRNA เป็นส่วนประกอบโครงสร้างของไรโบโซมอาจ cross-linked อย่างกว้างขวางกรดอะมิโนของโปรตีน ribosomal นำไปสลายมากของ rRNA นอกจากนี้ ความสมบูรณ์ของโครงสร้างไม่จำเป็นต้องสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงทางเคมีและประสิทธิภาพของอาร์เอ็นเอในปฏิกิริยาของเอนไซม์ หลายกลุ่มได้รายงานผลกระทบจาก formalin ตรึงบน qRT PCR [23] – [25] สร้างรายงานเหล่านี้ก่อนหน้าเราตอนนี้ได้ทำการศึกษาที่ครอบคลุม และเปรียบเทียบผลกระทบของการวิเคราะห์ล่วงหน้าใน RNA กระจายตัวและประสิทธิภาพในปฏิกิริยาการวิเคราะห์ที่แตกต่างกัน เป้าหมายคือการ ระบุขั้นตอนวิเคราะห์ล่วงหน้าสำคัญที่สุดที่ควรเป็นเป้าหมายสำหรับการควบคุมคุณภาพที่ถูกต้องมากขึ้นเช่น โดยใช้ assays แตกต่างกันในการศึกษาของเรา เราตามสมมติฐานว่า crosslinking ของชื่อโมเลกุลชีวภาพเป็นผู้สนับสนุนหลักในการย่อยสลาย RNA สำรวจผลอันตรายของการ formalin ตรึง crosslinking เป็นประจำใช้บนเอ็นเอเปรียบเทียบกับตรึงไม่ crosslinking แอลกอฮอล์ตาม โดยการตรึงเนื้อเยื่อ Tek Xpress Molecluar (TTXMF) เป็นตัวอย่างและตัวอย่าง cryopreserved เป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับการวิเคราะห์โมเลกุล

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

state-of-the-Art วิเคราะห์ RNA ตามยังคงอาศัยหลักในการเก็บตัวอย่างสดหรือแช่แข็งจึงมั่นใจได้ว่าการเก็บรักษาที่ดีมากของสารชีวโมเลกุลกว่าตรึงด้วยฟอร์มาล​​ิน ในเจล agarose หรือ electropherograms เหมือนเดิม RNA รวมที่สกัดจากเนื้อเยื่อแสดงแช่แข็งที่แตกต่างกันสองวงหรือยอดจาก RNA โครงสร้างของยูคาริโอ 18 และ 28 ของหน่วยย่อยของไรโบโซม (rRNA) ความอุดมสมบูรณ์ขนาดที่กำหนดไว้และอัตราส่วนของทั้งสองวงดนตรี / ยอดช่วยให้การใช้ของพวกเขาเป็นเครื่องหมายตัวแทนของการกระจายตัว RNA โดยการคำนวณอัตราส่วนของวงดนตรีที่ rRNA นี้ (28S: 18S) หรือใช้รูปทรงของ electropherogram ที่จะได้รับมาพารามิเตอร์เช่น RIN ค่า (Agilent Technologies, ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ในขณะที่การตรวจเหล่านี้จะดีขึ้นสำหรับอาร์เอ็นเอจากเนื้อเยื่อสดหรือแช่แข็งก็ยังเป็นที่รู้จักกันว่าทั้งสองยอด rRNA ที่แตกต่างกันมีการบุกรุกใน RNA สกัดจากเนื้อเยื่อแก้ไขในฟอร์มาล​​ินหรือ fixatives denaturing อื่น ๆ [22] นอกจากนี้มันเป็นวิธีที่ดีที่ไม่มีความชัดเจนการกระจายขนาดชิ้นส่วนของ RNA โซมอลคาดการณ์พฤติกรรมของสาร rna ที่ (mRNA) ต่อมาใช้เป็นแหล่งข้อมูลสำหรับการศึกษาการแสดงออกของยีน เพราะ rRNA เป็นส่วนประกอบของโครงสร้างของไรโบโซมมันอาจจะเป็นอย่างกว้างขวางข้ามเชื่อมโยงกับกรดอะมิโนโปรตีนโซมอลที่นำไปสู่​​การย่อยสลายอย่างกว้างขวางมากขึ้นของ rRNA นอกจากนี้ความสมบูรณ์ของโครงสร้างไม่จำเป็นต้องมีความสัมพันธ์กับการปรับเปลี่ยนทางเคมีและประสิทธิภาพการทำงานของอาร์เอ็นเอปฏิกิริยาของเอนไซม์ หลายกลุ่มได้รายงานเกี่ยวกับผลกระทบของฟอร์มาล​​ินตรึง qRT-PCR [23] - [25] อาคารในรายงานก่อนหน้านี้เหล่านี้เราได้ดำเนินการในขณะนี้การศึกษาที่ครอบคลุมและเปรียบเทียบผลกระทบของขั้นตอนก่อนการวิเคราะห์ที่แตกต่างกันในการกระจายตัวของอาร์เอ็นเอและประสิทธิภาพในการวิเคราะห์ปฏิกิริยาที่แตกต่างกัน เป้าหมายคือการระบุขั้นตอนก่อนการวิเคราะห์ที่สำคัญที่สุดที่ควรเป็นเป้าหมายสำหรับการควบคุมคุณภาพถูกต้องมากขึ้นเช่นการตรวจโดยการใช้ที่แตกต่างกันนำเสนอในการศึกษาของเรา อยู่บนสมมติฐานที่เชื่อมขวางของสารชีวโมเลกุลเป็นผู้สนับสนุนหลักในการย่อยสลาย RNA เราสำรวจผลกระทบที่เป็นอันตรายของการใช้เป็นประจำเชื่อมขวางฟอร์มาล​​ินตรึงบนโมเลกุล RNA ในการเปรียบเทียบกับที่ไม่ได้เชื่อมขวางตรึงแอลกอฮอล์โดยการใช้เนื้อเยื่อเต็ก Xpress Molecluar ตรึง (TTXMF) เป็นตัวอย่างและตัวอย่างแช่แข็งเป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับการวิเคราะห์โมเลกุล

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รัฐของศิลปะอาร์เอ็นเอจากการวิเคราะห์ยังอาศัยส่วนใหญ่เป็นตัวอย่างสดหรือตรวจสอบคุณภาพ มั่นใจขึ้นมาก รักษาชีวโมเลกุลกว่าตรึงด้วยฟอร์มาลิน ในโรสเจลหรือ electropherograms เหมือนเดิมทั้งหมด ซึ่งสกัดจากเนื้อเยื่อที่แตกต่างกันตรวจสอบคุณภาพแสดงสองวงหรือยอดเขาจาก RNA โครงสร้างของความแตกต่างระหว่าง 18 และ 28 ของไรโบโซมหน่วยย่อย ( rRNA ) ความอุดมสมบูรณ์ , กําหนดขนาดและอัตราส่วนของทั้งสองวง / ยอดให้ใช้เป็นเครื่องหมายของอาร์เอ็นเอของตัวแทนโดยการคำนวณหาอัตราส่วนของ rRNA วง ( 28s : 18S ) หรือใช้รูปทรงของเล็กโทรฟีโรแกรมเพื่อให้ได้ค่าพารามิเตอร์ เช่น ค่า ริน ( Agilent Technologies , ซานตาคลารา แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) ในขณะที่วิธีการเหล่านี้จะสร้าง RNA จากเนื้อสดหรือตรวจสอบคุณภาพ มันเป็นที่รู้จักกันว่าสองแตกต่าง rRNA ยอดจะถูกบุกรุกในอาร์เอ็นเอที่สกัดจากเนื้อเยื่อถาวรในฟอร์มาลิน หรืออื่น ๆ fixatives ี่ [ 22 ] มันยังไม่ชัดเจนอีกว่าส่วนการกระจายขนาดของอาร์เอ็นเอไรโบโซมคาดการณ์พฤติกรรมของเอ็มอาร์เอ็นเอ ( mRNA ) ต่อมาใช้เป็นแหล่งวัตถุดิบสำหรับการแสดงออกของยีนในการศึกษา เพราะแบคทีเรียเป็นส่วนโครงสร้างของไรโบโซมสามารถอย่างกว้างขวางเชื่อมโยงไปยังกรดอะมิโนของโปรตีน Protein นำไปสู่การสลายตัวที่กว้างขวางมากขึ้นของ rRNA . นอกจากนี้ โครงสร้างไม่จําเป็นต้องมีความสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงทางเคมีและประสิทธิภาพของ RNA ในปฏิกิริยาของเอนไซม์ . หลายกลุ่มได้รายงานเกี่ยวกับผลกระทบของฟอร์มาลินที่มีต่อข้าพเจ้า PCR [ 23 ] - [ 25 ] การสร้างรายงานก่อนหน้านี้เหล่านี้ตอนนี้เราได้ดำเนินการครอบคลุมและเปรียบเทียบผลกระทบของขั้นตอนในการวิเคราะห์แตกต่างกันก่อนอาร์เอ็นเอและประสิทธิภาพในการวิเคราะห์ปฏิกิริยาแตกต่างกัน เป้าหมายคือการระบุที่สำคัญที่สุดก่อนวิเคราะห์ขั้นตอนที่ควรเป็นเป้าหมายสำหรับการควบคุมคุณภาพถูกต้องมากขึ้นสำหรับอินสแตนซ์ โดยการใช้ที่แตกต่างกันสามารถนำเสนอในการศึกษาของเรา ตามสมมติฐานที่เชื่อมขวางของสารชีวโมเลกุลเป็นผู้สนับสนุนหลักในการย่อยสลายนี้เราสำรวจผลอันตรายของตรวจใช้ฟอร์มาลินในฟิกเซทีฟการเชื่อมขวางโมเลกุล RNA ในการเปรียบเทียบกับที่ไม่ทำปฏิกิริยา แอลกอฮอล์ฟิกเซทีฟตาม โดยเอาเนื้อเยื่อเต็ก Xpress molecluar ฟิกเซทีฟ ( ttxmf ) ตัวอย่างและตรวจสอบคุณภาพตัวอย่างอ้างอิงสำหรับการวิเคราะห์โมเลกุล .