values of Rwork and Rfree of 21.72%

values of Rwork and Rfree of 21.72% and 26.64%, respectively (Table 1). No interpretable electron density could be found for the remaining N-terminal residues, which are most likely disordered
Table 1.
Refinement statistics
Expression and Purification of BDV-M.

Expression of the full-length BDV-M gene and purification of the BDV-M-maltose binding protein fusion protein was performed as described (16). Maltose binding protein affinity chromatography was carried out by using an ÄKTA FPLC System (Amersham Biosciences). Further purification and separation of the fusion tag after factor Xa cleavage was carried out by using size exclusion chromatography via a HiLoad 26/60 Superdex 75 column (Amersham Biosciences). Amicon Ultra Centrifugal Filter Units (Millipore) were used for final concentration of the purified BDV-M.
Monolayer Experiments.

Brain polar lipid extract (porcine) was purchased from Avanti Polar Lipids and used without further purification. Surface pressure measurements were performed by using a homebuilt film balance with a circular Teflon trough (surface area of 7 cm2 and subphase volume of 11 mL). The surface pressure was measured with the Wilhelmy plate method (Riegler & Kirstein). The subphase was an ultrapure aqueous buffer solution (50 mM Hepes, 25 mM NaCl, pH 7.6). The lipid mixture was dissolved in chloroform and spread at the air/water interace with a microsyringe to give initial surface pressures between 12 and 32 mN/m. Surface films were equilibrated for at least 30 min, after which the protein was injected into the subphase and the surface pressure change was recorded. The final trough concentration of the BDV-M tetramers in each experiment was 100 nM. Experiments were performed at 20 ± 0.5 °C in a closed container to keep the air humidity constant, with continuous stirring of the subphase with a magnetic stirring bar.
Isolation of Nucleic Acid.

The copurified nucleic acids were separated from protein as follows: 100 μL of protein solution were diluted with 100 μL of proteinase K buffer (Merck) and digested by 20 μL of proteinase K (Merck) at 50 °C for 30–45 min. Phenol/chloroform (220 μL; 1:1) were added to 220 μL of the proteinase K reaction mixture to dissociate nucleic acids and protein fragments. After vortexing and centrifugation for 30 min at 19,000 × g, the upper aqueous phase was extracted a second time with 1 vol chloroform. The nucleic acid isolate was then purified by ethanol precipitation. One microliter of glycogen (20 mg/mL; Roche), one-third 10 M ammonium acetate, and 10 vol absolute ethanol were added and centrifuged for 20 min at 19,000 × g. The pellet was washed with 50 μL of 70% ethanol by centrifugation at 19,000 × g. The precipitate was dissolved in 20 μL of diethylpyrocarbonate (DEPC) in H2O and stored at −20°C.
Radioactive Labeling and RNase Digestion.

The enzyme PAP was used to radiolabel the 3′ end of ssRNA fragments. A 50-μL reaction contained 25 μL of 2× PAP buffer (New England Biolabs), 0.5 μL of RNasin (Promega), 1 μL of 25 mM DTT (Roth), 1 μL of 50 mM MnCl2 (Merck), 1 μL of DEPC H2O, 20 μL of nucleic acid isolate, 1 μL of α32P-cordecypin triphosphate (Amersham Bioscience), and 0.5 μL of PAP (New England Biolabs). PNK was used for the 5′ labeling. Five microliters of 10× PNK buffer (New England Biolabs), 0.5 μL of RNasin (Promega), 0.5 μL of 100 mM CDP (Sigma), 5 μL of 500 nM ATP (Sigma), 17.5 μL of DEPC H2O, 20 μL of nucleic acid isolate, 1 μL of γ[32]ATP (Amersham Bioscience), and 0.5 μL of PNK (New England Biolabs) were added. Both reactions were incubated for 1 h at 37 °C.
An RNase digestion was also carried out to differentiate between RNA and DNA. Sixteen microliters of RNase buffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0), 3 μL of radiolabeled nucleic acid, and 1 μL of RNase T1 (25 units/μL; Roth) were incubated for 30 min at 30 °C.
Urea-PAGE of Nucleic Acids.

The RNase digestion reaction was stopped by adding 30 μL of 5× formamide buffer (10 mL of formamide, 10 mg of xylencyanol, 10 mg of bromophenol blue, 200 μL of 0.5 M EDTA). 0.5 μL of samples of PAP- and PNK-labeling reaction were mixed with 9.5 μL of 5× formamide buffer. All samples were boiled for 5 min at 95 °C. Separation of 10-μL prepared samples was carried out in a 20% acrylamide/50% urea gel at 40-W power with an electrophoresis buffer containing 90 mM Tris, 90 mM boric acid, and 1 mM EDTA.
Previous SectionNext Section
Acknowledgments
We thank Galina Kachalova and Hans Bartunik of the Max-Planck-Gesellschaft for providing beam-time and valuable experimental assistance at beamline BW 6 of Deutsches Elektronen Synchrotron Hamburg, Elmar Wahle (Institut für Biochemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg) for useful advice concerning the nucleotide labeling assays, Alfred Blume (Institut für Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg) for discussions concerning the monolayer experiments, and Christiane Herden (Institut für Veterinär-Pathologie, Justus-Liebig-Universität Gießen) for helpful discussions on the manuscript. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft Graduiertenkollegs 541 “Proteinfunktion auf atomarer Ebene” (W.G. and M.T.S.) and 1026 “Conformational transitions in macromolecular interactions” (M.T.S.).
Previous SectionNext Section
Footnotes
• 4To whom correspondence should be addressed. E-mail: [e-mail]
• Author contributions: W.G. and M.T.S. designed research; P.N., D.L., S.M., P.D., A.K., I.K., and M.T.S. performed research; S.M., A.K., and I.K. contributed new reagents/analytic tools; P.N., A.K., W.G., and M.T.S. analyzed data; and P.N., D.L., W.G., and M.T.S. wrote the paper.
• 1On leave from: Wydział Chemii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Gagarina 7, 87-100 Torun, Poland.
• 2Present address: Laboratoire de Biologie Chimique, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires, 8, Allée Gaspard Monge, BP 70028, F-67083 Strasbourg Cedex, Strasbourg, France.
• 3Present address: Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel, Institut für Biochemie und Physiologie der Ernährung, Hermann-Weigmann-Strasse 1, D-24103 Kiel, Germany.
• The authors declare no conflict of interest.
• This article is a PNAS Direct Submission.
• Data deposition: The atomic coordinates have been deposited in the Protein Data Bank, www.pdb.org (PDB ID code3F1J).
• This article contains supporting information online at www.pnas.org/cgi/content/full/0808101106/DCSupplemental.
Previous Section

References
1. ↵
1. de la Torre JC
(2006) Reverse-genetic approaches to the study of Borna disease virus. Nat Rev Microbiol 4:777–783.

CrossRefMedlineWeb of ScienceGoogle Scholar
Abstract
Infection of neonates with Borna disease virus (BDV) induces severe meningoencephalitis and neurological disorder in wild-type but not in β2-microglobulin-deficient mice of strain MRL (H-2k). Temporaryin vivo depletion of CD8+ T cells delayed BDV-induced disease for several weeks. Depletion of CD4+ T cells had a similar beneficial effect, indicating that the BDV-induced neurological disorder in mice is a CD4+ T cell-dependent immunopathological process that is mediated by CD8+ T cells. Lymphocytes prepared from brains of diseased mice were mainly from the CD8+ T cell subset. They showed up-regulation of activation markers and exerted strong MHC I-restricted cytotoxic activity against target cells expressing the BDV nucleoprotein p40. Infection of B10.BR (H-2k) or congenic C57BL/10 (H-2b) mice resulted in symptomless, lifelong persistence of BDV in the brain. Superinfection with a recombinant vaccinia virus expressing BDV p40 but not with other vaccinia viruses induced severe neurological disease and encephalitis in persistently infected B10.BR mice but not in persistently infected C57BL/10 mice, indicating that thedisease-inducing T cell response is restricted to the nucleoprotein of BDV in H-2k mice. Our results demonstrate that the cellular arm of the immune system may ignore the presence of a replicating virus in the central nervous system until proper antigenic stimulation at a peripheral site triggers the antiviral response.
Borna disease virus (BDV) is the causative agent of a nonpurulent meningoencephalitis observed predominantly in horses and sheep (1, 2). It is an enveloped virus with a single-stranded RNA genome of negative polarity (3, 4), and it represents the prototype member of a new virus family designatedBornaviridae in the order Mononegavirales (5, 6). BDV has an extraordinarily broad host range in warm-blooded animals, and it can replicate in the central nervous system (CNS) of a large number of experimentally infected animal species (1). BDV infections of humans with psychiatric disorders were reported (7–10). However, the etiological role of BDV in human mental disease remains to be elucidated.
In naturally infected hosts and in experimentally infected adult rats, neurological disease and behavioral abnormalities seem to result mainly from immunopathological processes (11–13). Strong perivascular and parenchymal infiltrations of CD4+ and CD8+ T cells were observed, and their appearance in the brain correlated with onset of disease symptoms (11, 13–16). Initially, the role of CD4+ T cells for induction ofBorna disease was emphasized (17, 18). However, recent studies in the rat model system indicated that immunopathology is, in fact, mediated by CD8+ T cells that require help from the CD4+ T cell subset (15, 16,19, 20). Lymphocytes from brains of infected rats showed cytotoxic activity in vitro mainly against target cells expressing the viral nucleoprotein (21).
We recently established a mouse model for BDV-induced neurological disease (22). In this experimental system, animals of the MRL strain are infected intracerebrally with BDV. Under these conditions the virusreplicates readily in brain neurons, where it reaches maximal titers by 3–4 weeks postinfection. After 4–6 weeks, most i

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ค่าของ Rwork และ Rfree 21.72% และ 26.64% ตามลำดับ (ตารางที่ 1) ความหนาแน่นอิเล็กตรอน interpretable ไม่พบสำหรับตก N-เทอร์มินัลที่เหลือ ซึ่งคล้าย disorderedตารางที่ 1สถิติรีไฟน์เมนท์นิพจน์และฟอก BDV-M ของยีน BDV-M จัดและทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนอาหารโปรตีนรวม BDV-M-maltose ที่ดำเนินการอธิบาย (16) โปรตีน maltose ผูกความสัมพันธ์ chromatography ถูกดำเนิน โดยใช้ระบบการ FPLC ÄKTA (เวลาออก Amersham) การฟอกและแยกแท็กฟิวชั่นหลังจากคูณปริซาถูกดำเนินโดย chromatography แยกขนาดผ่านคอลัมน์ Superdex 75 HiLoad 26/60 (เวลาออก Amersham) Amicon Ultra แรงเหวี่ยงตัวกรองหน่วย (มาก) ถูกใช้ในความเข้มข้นสุดท้ายของบริสุทธิ์ BDV MMonolayer ทดลอง แยกขั้วไขมันสมอง (ช่วง) ซื้อจากโครงการเรียนโรสโพลาร์ และใช้โดยไม่ต้องฟอกเพิ่มเติม วัดความดันที่ผิวถูกทำ โดยใช้ homebuilt ฟิล์มดุลกับแบบรางเทฟลอนแบบวงกลม (พื้นที่ผิวของปริมาตร 7 cm2 และ subphase ของ 11 mL) ดันพื้นผิวถูกวัด ด้วยวิธีจาน Wilhelmy (Riegler และ Kirstein) Subphase ที่มีในบัฟเฟอร์ ultrapure อควีโซลูชัน (50 mM Hepes, NaCl, 25 มม.ค่า pH 7.6) ส่วนผสมไขมันที่ละลายในคลอโรฟอร์ม และแพร่กระจายที่ interace อากาศ/น้ำด้วย microsyringe ให้ดันผิวเริ่มต้นระหว่าง 12 และ 32 mN/ม. ผิวฟิล์มถูก equilibrated สำหรับอย่างน้อย 30 นาที หลังจากที่โปรตีนถูกฉีดเข้าไปใน subphase การ และบันทึกการเปลี่ยนแปลงความดันที่ผิว เข้มข้นสุดท้ายราง tetramers BDV-M ในแต่ละการทดลองถูก 100 nM มีดำเนินการทดลองที่ 20 ± 0.5 ° C ในภาชนะปิดเพื่อรักษาความชื้นของอากาศคง มีการกวนอย่างต่อเนื่องของ subphase กับบาร์ stirring แม่เหล็กแยกของกรดนิวคลีอิก กรดนิวคลีอิก copurified ถูกแยกออกจากโปรตีนดังนี้: ผสมกับ μL 100 proteinase K บัฟเฟอร์ (เมอร์ค) และเจ่า โดย μL 20 ของ proteinase K (เมอร์ค) ที่ 50 ° C สำหรับ 30-45 นาทีวาง/คลอโรฟอร์ม (220 μL; 1:1) ได้เพิ่ม μL 220 ของผสมปฏิกิริยา proteinase K เพื่อ dissociate กรดนิวคลีอิกและโปรตีนบางส่วนของ μL 100 ของโปรตีน หลังจาก vortexing และ centrifugation ใน 30 นาทีที่ 19000 ซื้อ g เฟสอควีบนถูกแยกเป็นครั้งที่สอง ด้วยคลอโรฟอร์ม vol 1 แยกกรดนิวคลีอิกถูกแล้วบริสุทธิ์ โดยฝนเอทานอล หนึ่งไมโครลิตรของไกลโคเจน (20 mg/mL Roche), หนึ่งในสาม 10 M แอมโมเนีย acetate, 10 vol แอบโซลูทเอทานอลได้เพิ่ม และ centrifuged สำหรับ 20 นาทีที่ 19000 ซื้อ g เม็ดถูกล้าง ด้วย μL 50 ของเอทานอล 70% โดย centrifugation ที่ 19000 × g Precipitate ถูกละลายใน 20 μL ของ diethylpyrocarbonate (DEPC) ใน H2O และเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียสติดฉลากกัมมันตรังสีและ RNase ย่อยอาหาร เอนไซม์ PAP ที่ใช้ radiolabel ท้าย 3′ บางส่วนของ ssRNA ปฏิกิริยา 50-μL อยู่ μL 25 × 2 บบัฟเฟอร์ (นิวอิงแลนด์ Biolabs) μL 0.5 μL 1 ของ DEPC H2O, μL 20 ของกรดนิวคลีอิก μL 1 มม. 50 MnCl2 (เมอร์ค) RNasin (Promega), μL 1 25 มม. DTT (รอด) แยก μL 1 ของ α32P cordecypin โนซีนไตรฟอสเฟต (Amersham ซื้อ), และ μL 0.5 ของ PAP (นิวอิงแลนด์ Biolabs) PNK ถูกใช้สำหรับการติดฉลาก 5′ Microliters 5 10 × PNK บัฟเฟอร์ (นิวอิงแลนด์ Biolabs), μL 0.5 ของ RNasin (Promega), μL 0.5 มม. 100 CDP (ซิกมา), μL 5 ของ ATP 500 nM (ซิกมา), μL 17.5 ของ DEPC H2O, μL 20 ของกรดนิวคลีอิกแยก เพิ่ม μL 1 ของγ [32] ATP (Amersham ซื้อ), และ μL 0.5 ของ PNK (นิวอิงแลนด์ Biolabs) ปฏิกิริยาทั้งสองได้ incubated สำหรับ h 1 ที่ 37 องศาเซลเซียสการย่อยอาหาร RNase ยังดำเนินการเพื่อแบ่งแยกระหว่างดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ Microliters สิบหกของ RNase บัฟเฟอร์ (20 mM ตรี NaCl, 100 มม.ค่า pH 8.0), μL 3 ของกรดนิวคลีอิก radiolabeled และ μL 1 ของ RNase T1 (25 หน่วย/μL รอด) ถูก incubated ใน 30 นาทีที่ 30 องศาเซลเซียสยูเรียหน้าของกรดนิวคลีอิก ปฏิกิริยาย่อยอาหาร RNase ถูกหยุด โดยการเพิ่ม μL 30 5 × formamide บัฟเฟอร์ (10 mL ของ formamide, xylencyanol, 10 มก. bromophenol สีฟ้า μL 200 ของ 0.5 M EDTA 10 มก.) 0.5 μL ตัวอย่างของปฏิกิริยาบ - และ PNK-ติดฉลากถูกผสมกับ μL 9.5 5 × formamide บัฟเฟอร์ ตัวอย่างทั้งหมดถูกต้มใน 5 นาทีที่ 95 องศาเซลเซียส แยก 10-μL เตรียมตัวอย่างถูกดำเนินการใน 20% acrylamide/50% เจยูเรียที่ไฟฟ้า 40 W กับบัฟเฟอร์การ electrophoresis ประกอบด้วยทริสเรทติ้ง 90 มม. 90 มม.กรด boric และ 1 mM EDTAส่วน SectionNext ก่อนหน้านี้ตอบเราขอบคุณ Galina Kachalova และฮันส์ Bartunik ของสูงสุดของพลังค์-Gesellschaft ให้เหลือทดลองแสงเวลา และมีคุณค่าที่ beamline BW 6 ของดอยท์เซสเทีย Elektronen Synchrotron ฮัมบูร์ก Elmar Wahle (สถาบัน für Biochemie มาร์ตินลูเธอร์ Universität Halle Wittenberg) สำหรับคำแนะนำที่เป็นประโยชน์เกี่ยวกับนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลาก assays อัลเฟรดบลูเม (สถาบัน für Chemie มาร์ตินลูเธอร์ Universität Halle Wittenberg) สำหรับการสนทนาเกี่ยวกับการทดลอง monolayer และ Christiane Herden (สถาบัน für Veterinär-Pathologie, Gießen Justus Liebig Universität) สำหรับการสนทนาประโยชน์ในต้นฉบับ งานนี้ได้รับการสนับสนุน โดย Deutsche Forschungsgemeinschaft Graduiertenkollegs 541 "Proteinfunktion เอาฟ์ atomarer Ebene" (W.G. และ M.T.S.) และ 1026 "Conformational เปลี่ยนใน macromolecular โต้" (M.T.S.)ส่วน SectionNext ก่อนหน้านี้เชิงอรรถ4To •ใครควรได้รับการติดต่อ อีเมล์: [e-mail]•ผู้เขียนผลงาน: W.G. และ M.T.S. ออกแบบการวิจัย โรงแรมวินชี อิน S.M. เหมือน A.K., I.K. และ M.T.S. ทำวิจัย S.M., A.K. และ I.K. ส่วนเครื่องมือ reagents/คู่ ใหม่ โรงแรมวินชี A.K., W.G. และ M.T.S. วิเคราะห์ข้อมูล และโรงแรมวินชี อิน W.G. และ M.T.S. เขียนกระดาษ• 1On ออกจาก: Wydział Chemii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Gagarina 7, 87-100 Torun โปแลนด์• 2Present ที่อยู่: Laboratoire de Biologie Chimique สถาบันวิทยาศาสตร์เด et d'Ingénierie Supramoléculaires, 8 วิ Gaspard Monge, BP 70028, F-67083 สตราสบูร์ก Cedex สตราสบูร์ก ฝรั่งเศส• 3Present ที่อยู่: แดน Ernährung für Bundesforschungsanstalt Lebensmittel สถาบัน für Biochemie แดน Physiologie der Ernährung มันน์-Weigmann-พร้อม 1, D-24103 Kiel เยอรมนี•ผู้เขียนประกาศที่ไม่มีประโยชน์•บทความนี้เป็นการส่ง โดยตรง PNAS•ข้อมูลสะสม: พิกัดอะตอมได้รับฝากไว้ในโปรตีนข้อมูลธนาคาร www.pdb.org (PDB ID code3F1J)•บทความนี้ประกอบด้วยการสนับสนุนข้อมูลแบบออนไลน์ที่ www.pnas.org/ cgi/เนื้อหา/เต็ม/0808101106/DCSupplementalส่วนก่อนหน้านี้ การอ้างอิง1. ↵ 1. เดอลาทอร์เรคาเจซี (2006) วิธีการกลับทางพันธุกรรมของไวรัสโรค Borna 4:777 ณัฐ Microbiol เรฟ-783 CrossRefMedlineWeb ScienceGoogle นักวิชาการบทคัดย่อติดเชื้อของ neonates กับ Borna โรคไวรัส (BDV) แท้จริง meningoencephalitis รุนแรงและโรคระบบประสาท ชนิดป่า แต่ไม่ใช่ ใน β2-microglobulin-ไม่หนูของต้องใช้ MRL (H - 2k) การลดลงของ vivo Temporaryin เซลล์ CD8 + T ช้า BDV เกิดจากโรคหลายสัปดาห์ การลดลงของเซลล์ CD4 + T มีความคล้ายผลประโยชน์ บ่งชี้ว่า การเกิด BDV ระบบประสาทโรคในหนู CD4 + T เซลล์ขึ้นอยู่กับ immunopathological กระบวนการที่ mediated โดยเซลล์ CD8 + T Lymphocytes ที่เตรียมจากสมองของหนูที่ป่วยส่วนใหญ่มาจากกลุ่มย่อยเซลล์ CD8 + T ได้ พวกเขาพบว่าควบคุมการขึ้นเครื่องหมายเปิดใช้งานและนั่นเองแรงเอ็มเอชซีฉันจำกัด cytotoxic กิจกรรมกับเซลล์เป้าหมายแสดง BDV nucleoprotein p40 ติดเชื้อ B10.BR (H - 2k) หรือหนู C57BL/10 (H-2b) congenic ให้ติดตา symptomless ปรับเปลี่ยนรูปแบบของ BDV ในสมอง Superinfection ไวรัส recombinant vaccinia แสดง BDV p40 แต่กับ vaccinia ไวรัสที่เกิดจากโรคระบบประสาทอย่างรุนแรงและโรคไข้สมองอักเสบ ในหนู B10.BR สามารถติดไวรัส แต่ไม่สามารถติดไวรัส C57BL/10 หนูอื่น ๆ ไม่ระบุว่า thedisease inducing T เซลล์ตอบไม่จำกัด nucleoprotein ของ BDV ในหนู H - 2k ผลของเราแสดงให้เห็นว่า แขนเซลของระบบภูมิคุ้มกันอาจละเว้นของไวรัสในระบบประสาทส่วนกลางทำซ้ำจนกว่ากระตุ้น antigenic เหมาะสมที่ต่อพ่วงก่อให้เกิดการตอบสนองต่อยาต้านไวรัสBorna โรคไวรัส (BDV) เป็นตัวแทนสาเหตุการของ meningoencephalitis nonpurulent ที่พบส่วนใหญ่ในม้าและแกะ (1, 2) มันเป็นไวรัสเป็น enveloped กับกลุ่มอาร์เอ็นเอเดียวควั่นของขั้วลบ (3, 4), และไอคอนสมาชิกต้นแบบของ designatedBornaviridae ตระกูลไวรัสใหม่ในใบสั่ง Mononegavirales (5, 6) BDV มีการโฮสต์ประเด็นกว้างในสัตว์เลือดอุ่น และมันสามารถจำลองในระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) ของจำนวนชนิดสัตว์ติดเชื้อ experimentally (1) ติดเชื้อ BDV ของมนุษย์กับโรคทางจิตเวชมีรายงาน (7-10) อย่างไรก็ตาม BDV บทบาท etiological ในโรคจิตมนุษย์ยังคงเป็น elucidatedในโฮสต์ที่ติดเชื้อตามธรรมชาติ และ ในผู้ใหญ่หนู experimentally ติดเชื้อ โรคระบบประสาทและความผิดปกติของพฤติกรรมดูเหมือน ผลส่วนใหญ่มาจากกระบวนการ immunopathological (11-13) สังเกต perivascular แข็งแรงและ infiltrations parenchymal ของเซลล์ CD4 + และ CD8 + T และลักษณะที่ปรากฏในสมอง correlated กับเริ่มมีอาการของโรคอาการ (11, 13-16) เริ่มต้น ที่เน้นบทบาทของเซลล์ CD4 + T เหนี่ยวนำ ofBorna โรค (17, 18) อย่างไรก็ตาม การศึกษาล่าสุดในระบบจำลองราษฎร์ระบุว่า immunopathology, mediated ในความเป็นจริง โดยเซลล์ CD8 + T ที่ต้องการความช่วยเหลือจากกลุ่มย่อยเซลล์ CD4 + T (15, 16,19, 20) Lymphocytes จากสมองของหนูที่ติดเชื้อพบว่า cytotoxic กิจกรรมการเพาะเลี้ยงส่วนใหญ่กับเซลล์เป้าหมายแสดง nucleoprotein ไวรัส (21)เราเพิ่งก่อตั้งแบบเมาส์ BDV เกิดจากระบบประสาทโรค (22) ในระบบนี้ทดลอง สัตว์สายพันธุ์ MRL ติด intracerebrally กับ BDV เหล่านี้ภายใต้เงื่อนไข virusreplicates พร้อมในสมอง neurons ที่มันถึงสูงสุด titers โดย postinfection 3 – 4 สัปดาห์ หลังจาก 4-6 สัปดาห์ i ส่วนใหญ่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ค่านิยมของ Rwork และ Rfree ของ 21.72% และ 26.64% ตามลำดับ (ตารางที่ 1) ไม่มีความหนาแน่นของอิเล็กตรอน interpretable อาจจะพบได้ที่เหลือตกค้าง N-terminal, ซึ่งเป็นส่วนใหญ่มีแนวโน้มที่เป็นระเบียบ
ตารางที่ 1.
การปรับแต่งสถิติ
การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ BDV-M. การแสดงออกของเต็มความยาวยีน BDV-M และการทำให้บริสุทธิ์ของ BDV-M -maltose โปรตีนโปรตีนที่มีผลผูกพันที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ (16) มอลโตสโปรตีนผูกพันโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดได้รับการดำเนินการโดยใช้ Akta fplc ระบบ (Amersham Biosciences) ทำให้บริสุทธิ์และการแยกของแท็กฟิวชั่นหลังจากที่แตกแยกปัจจัย Xa ได้ดำเนินการโดยใช้โคยกเว้นขนาดผ่าน HiLoad 26/60 Superdex 75 คอลัมน์ (Amersham Biosciences) อัลตร้า Amicon หน่วยกรองแรงเหวี่ยง (ค) ถูกนำมาใช้สำหรับความเข้มข้นสุดท้ายของบริสุทธิ์ BDV-M. monolayer ทดลอง. สมองสารสกัดจากไขมันขั้วโลก (หมู) ซื้อมาจาก Avanti ขั้วโลกลิปิดและใช้โดยไม่บริสุทธิ์ต่อไป พื้นผิวการวัดความดันได้ดำเนินการโดยใช้ความสมดุลภาพยนตร์ homebuilt กับรางเทฟลอนกลม (พื้นที่ผิวของ 7 cm2 และปริมาณ subphase 11 มิลลิลิตร) ความดันพื้นผิวที่ได้รับการวัดด้วยวิธีจาน Wilhelmy (Riegler & Kirstein) subphase เป็นสารละลายบัฟเฟอร์น้ำบริสุทธิ์พิเศษ (50 มิลลิ HEPES, 25 มมโซเดียมคลอไรด์มีค่า pH 7.6) ส่วนผสมของไขมันที่ถูกละลายในคลอโรฟอร์มและการแพร่กระจายในอากาศ / interace น้ำที่มีไมโครเพื่อให้แรงกดดันพื้นผิวเริ่มต้นระหว่างวันที่ 12 และ 32 mN / ตารางเมตร ภาพยนตร์พื้นผิวถูก equilibrated เป็นเวลาอย่างน้อย 30 นาทีหลังจากที่โปรตีนถูกฉีดเข้าไปใน subphase และพื้นผิวการเปลี่ยนแปลงความดันที่ถูกบันทึกไว้ ความเข้มข้นรางสุดท้ายของ tetramers BDV-M ในแต่ละการทดลอง 100 นาโนเมตร การทดลองดำเนินการใน 20 ± 0.5 ° C ในภาชนะปิดเพื่อให้ความชื้นในอากาศอย่างต่อเนื่องกับกวนอย่างต่อเนื่องของ subphase มีบาร์กวนแม่เหล็ก. การแยกกรดนิวคลีอิก. กรดนิวคลีอิก copurified ถูกแยกออกจากโปรตีนดังต่อไปนี้: 100 ไมโครลิตร ของการแก้ปัญหาโปรตีนถูกเจือจางด้วย 100 ไมโครลิตรของโปรบัฟเฟอร์ K (เมอร์) และย่อย 20 ไมโครลิตรของโปร K (เมอร์) ที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30-45 นาที ฟีนอล / คลอโรฟอร์ม (220 ไมโครลิตร; 1: 1) มีการเพิ่มถึง 220 ไมโครลิตรของโปร K ผสมปฏิกิริยาที่จะแยกตัวออกกรดนิวคลีอิกและเศษโปรตีน หลังจาก vortexing และการหมุนเหวี่ยงเวลา 30 นาทีที่ 19,000 ×กรัมเฟสน้ำบนถูกสกัดเป็นครั้งที่สองที่มี 1 ฉบับคลอโรฟอร์ม กรดนิวคลีอิกแยกบริสุทธิ์แล้วโดยการตกตะกอนเอทานอล หนึ่งไมโครลิตรของไกลโคเจน (20 mg / ml; โรช) หนึ่งในสาม 10 M อะซิเตตแอมโมเนียมและเอทานอล 10 ฉบับที่แน่นอนมีการเพิ่มและปั่น 20 นาทีที่ 19,000 ×กรัม เม็ดถูกล้างด้วย 50 ไมโครลิตรของเอทานอล 70% โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 19,000 ×กรัม ตะกอนถูกกลืนหายไปใน 20 ไมโครลิตรของ diethylpyrocarbonate (DEPC) ใน H2O และเก็บไว้ที่ -20 ° C. กัมมันตรังสีติดฉลากและการย่อยอาหาร RNase. PAP เอนไซม์ถูกใช้ในการ radiolabel ปลาย 3 'ของชิ้นส่วน ssRNA 50 ไมโครลิตรปฏิกิริยาที่มีอยู่ 25 ไมโครลิตรของ 2 ×บัฟเฟอร์ PAP (นิวอิงแลนด์ Biolabs) 0.5 ไมโครลิตรของ RNasin (Promega) 1 ไมโครลิตร 25 มม DTT (Roth), 1 ไมโครลิตร 50 มม MnCl2 (เมอร์) 1 ไมโครลิตรของ DEPC H2O 20 ไมโครลิตรของกรดนิวคลีอิกแยก 1 ไมโครลิตรของα32P-cordecypin triphosphate (Amersham Bioscience) และ 0.5 ไมโครลิตรของ PAP (นิวอิงแลนด์ Biolabs) PNK ถูกนำมาใช้สำหรับการติดฉลาก 5 ' ห้า microliters 10 ×บัฟเฟอร์ PNK (นิวอิงแลนด์ Biolabs) 0.5 ไมโครลิตรของ RNasin (Promega) 0.5 ไมโครลิตร 100 มิลลิ CDP (ซิกม่า) 5 ไมโครลิตร 500 นาโนเมตรเอทีพี (ซิกม่า), 17.5 ไมโครลิตรของ DEPC H2O 20 ไมโครลิตรของ แยกกรดนิวคลีอิก 1 ไมโครลิตรของγ [32] เอทีพี (Amersham Bioscience) และ 0.5 ไมโครลิตรของ PNK (นิวอิงแลนด์ Biolabs) ถูกเพิ่ม ปฏิกิริยาทั้งสองถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C. การย่อยอาหาร RNase ก็ยังดำเนินการถึงความแตกต่างระหว่างอาร์เอ็นเอและดีเอ็นเอ สิบหก microliters ของบัฟเฟอร์ RNase (20 mM Tris 100 มิลลิโซเดียมคลอไรด์มีค่า pH 8.0) 3 ไมโครลิตรของกรดนิวคลีอิก radiolabeled และ 1 ไมโครลิตรของ RNase T1 (25 หน่วย / ไมโครลิตร; Roth) ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 30 ° C. ยูเรีย -PAGE ของนิวคลีอิกกรด. ปฏิกิริยาการย่อยอาหาร RNase ก็หยุดโดยการเพิ่ม 30 ไมโครลิตรจาก 5 ×บัฟเฟอร์ไมด์ (10 มิลลิลิตรไมด์ 10 มิลลิกรัมของ xylencyanol 10 มิลลิกรัมของ Bromophenol สีฟ้า 200 ไมโครลิตร 0.5 M EDTA) 0.5 ไมโครลิตรของกลุ่มตัวอย่างของ PAP- และปฏิกิริยา PNK ติดฉลากถูกผสมกับ 9.5 ไมโครลิตรจาก 5 ×บัฟเฟอร์ Formamide ตัวอย่างทั้งหมดถูกต้มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 95 ° C แยก 10 ไมโครลิตรจัดทำตัวอย่างได้รับการดำเนินการในริลาไมด์ 20% / 50% เจลยูเรียที่กำลังไฟ 40 W กับบัฟเฟอร์อิเล็กมี 90 มิลลิ Tris กรดบอริก 90 มิลลิเมตรและ 1 มิลลิ EDTA. ก่อนหน้ามาตรามาตรากิตติกรรมประกาศเราขอขอบคุณ Galina Kachalova และฮันส์ Bartunik ของ Max-Planck-Gesellschaft สำหรับการให้ลำแสงเวลาและความช่วยเหลือการทดลองที่มีคุณค่าที่ระบบลำเลียงแสง BW 6 ของเยอรมัน Elektronen ซินโครฮัมบูร์ก, Elmar Wahle (Institut für Biochemie, มาร์ตินลูเธอร์--Universität Halle-Wittenberg) สำหรับคำแนะนำที่มีประโยชน์ เกี่ยวกับการตรวจการติดฉลากเบื่อหน่าย, อัลเฟรด Blume (Institut für Chemie, มาร์ตินลูเธอร์--Universität Halle-Wittenberg) สำหรับการอภิปรายเกี่ยวกับการทดลอง monolayer และ Christiane Herden (Institut fürสัตวแพทย์-Pathologie, Justus-Liebig-UniversitätGießen) สำหรับการอภิปรายที่เป็นประโยชน์ใน ที่เขียนด้วยลายมือ งานนี้ได้รับการสนับสนุนจากสหพันธ์สาธารณรัฐ Graduiertenkollegs 541 "Proteinfunktion บน atomarer Ebene" (WG และเอ็มทีเอ) และ 1026 "การเปลี่ยนในโครงสร้างโมเลกุลปฏิสัมพันธ์" (MTS). ก่อนหน้ามาตรามาตราเชิงอรรถ4To •ผู้ที่ควรได้รับการแก้ไข E-mail: [e-mail] •ผลงานผู้เขียน: WG และเอ็มทีเอได้รับการออกแบบการวิจัย PN, DL, SM, PD, AK, IK และเอ็มทีเอดำเนินการวิจัย เอสเอ็ม, AK, และ IK สนับสนุนน้ำยาใหม่ / เครื่องมือวิเคราะห์; PN, AK, WG และเอ็มทีเอวิเคราะห์ข้อมูล และ PN, DL, WG และเอ็มทีเอเขียนกระดาษ. • 1 โดยการลาจาก: Wydział chemii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Gagarina 7, 87-100 Torun, โปแลนด์. •อยู่ 2Present: Laboratoire เดอ Biologie Chimique, สถาบันวิทยาศาสตร์และ D ' วิศวกรรมSupramoléculaires, 8, Allée Gaspard Monge, BP 70028 F-67083 Strasbourg Cedex, สบูร์ก, ฝรั่งเศส. •อยู่ 3Present: Bundesforschungsanstalt สำหรับErnährungคาดไม่ถึงสุขภาพ, Institut für Biochemie คาดไม่ถึง Physiologie der Ernährungเฮอร์มันน์-Weigmann-Strasse 1, D-24103 . คีลประเทศเยอรมนี•เขียนได้ประกาศความขัดแย้งไม่มี. •บทความนี้เป็นส่งตรง PNAS. •การสะสมข้อมูลพิกัดอะตอมได้รับฝากไว้ในธนาคารโปรตีนข้อมูล www.pdb.org (PDB ID code3F1J). • บทความนี้มีข้อมูลที่สนับสนุนออนไลน์ที่ www.pnas.org/cgi/content/full/0808101106/DCSupplemental. ส่วนก่อนหน้านี้อ้างอิง1 ↵ 1 เดอลา Torre JC (2006) วิธีการย้อนกลับทางพันธุกรรมเพื่อการศึกษาของไวรัสโรค Borna แน็ตเร Microbiol. 4: 777-783 CrossRefMedlineWeb ของ ScienceGoogle กูบทคัดย่อการติดเชื้อของทารกแรกเกิดด้วยโรคไวรัส Borna (BDV) ก่อให้เกิดสมองอักเสบรุนแรงและความผิดปกติของระบบประสาทในป่าชนิด แต่ไม่ได้อยู่ในหนูβ2-microglobulin ขาดของสายพันธุ์ MRL (H-2k ) การสูญเสียร่างกาย Temporaryin ของเซลล์ CD8 + T ล่าช้าโรค BDV-induced เป็นเวลาหลายสัปดาห์ พร่องของเซลล์ CD4 + T มีผลประโยชน์ที่คล้ายกันแสดงให้เห็นว่าความผิดปกติทางระบบประสาท BDV-induced ในหนูเป็น CD4 + T เซลล์ขึ้นอยู่กับกระบวนการ immunopathological ที่เป็นสื่อกลางโดยเซลล์ CD8 + T เซลล์เม็ดเลือดขาวที่ทำจากสมองของหนูที่เป็นโรคได้ส่วนใหญ่มาจาก CD8 + T เซลล์ย่อย พวกเขาปรากฏตัวขึ้นระเบียบของเครื่องหมายยืนยันการใช้งานและการกระทำกิจกรรมพิษที่แข็งแกร่ง MHC I-จำกัด กับเซลล์เป้าหมายแสดง BDV นิวคลีโอ p40 การติดเชื้อของ B10.BR (H-2k) หรือ congenic C57BL / 10 (H-2b) หนูมีผลในการ symptomless คงทนตลอดชีวิตของ BDV ในสมอง Superinfection กับไวรัสวัคซีนไข้ทรพิษแสดง BDV p40 แต่ไม่ได้มีไวรัสวัคซีนอื่น ๆ ที่เหนี่ยวนำให้เกิดโรคทางระบบประสาทอย่างรุนแรงและโรคไข้สมองอักเสบในหนูที่ติดเชื้อเสมอ B10.BR แต่ไม่ได้อยู่ในการติดเชื้อเสมอ C57BL / 10 หนูแสดงให้เห็นว่า thedisease ชักนำตอบสนองของเซลล์ T ถูก จำกัด ให้ นิวคลีโอของ BDV ในหนู H-2k ผลของเราแสดงให้เห็นว่าแขนเซลล์ของระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายอาจจะไม่สนใจการปรากฏตัวของไวรัสจำลองในระบบประสาทส่วนกลางจนกระตุ้นแอนติเจนที่เหมาะสมที่เว็บไซต์ต่อพ่วงก่อให้เกิดการตอบสนองต่อไวรัส. โรคไวรัส Borna (BDV) เป็นสาเหตุของ nonpurulent สมองอักเสบอย่างเด่นที่พบในม้าและแกะ (1, 2) มันเป็นไวรัส enveloped กับจีโนมอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวสายของขั้วลบ (3, 4) และมันหมายถึงสมาชิกต้นแบบของไวรัสตัวใหม่ครอบครัว designatedBornaviridae เพื่อ Mononegavirales (5, 6) BDV มีช่วงที่เป็นเจ้าภาพในวงกว้างเป็นพิเศษในสัตว์เลือดอุ่นและมันสามารถทำซ้ำในระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) ของจำนวนมากของการติดเชื้อทดลองสายพันธุ์สัตว์ (1) การติดเชื้อ BDV ของมนุษย์มีความผิดปกติทางจิตเวชได้รับรายงาน (7-10) อย่างไรก็ตามบทบาทของ etiological BDV ในโรคทางจิตของมนุษย์ยังคงที่จะอธิบาย. ในครอบครัวที่ติดเชื้อตามธรรมชาติและการติดเชื้อในหนูทดลองผู้ใหญ่โรคทางระบบประสาทและความผิดปกติพฤติกรรมดูเหมือนจะส่งผลให้ส่วนใหญ่มาจากกระบวนการ immunopathological (11-13) perivascular ที่แข็งแกร่งและการบุกรุก parenchymal ของ CD4 + และเซลล์ CD8 + T ถูกตั้งข้อสังเกตและการปรากฏตัวของพวกเขาในสมองมีความสัมพันธ์กับการโจมตีของอาการของโรค (11, 13-16) ในขั้นต้นบทบาทของเซลล์ CD4 + T สำหรับการเหนี่ยวนำโรค ofBorna เน้น (17, 18) อย่างไรก็ตามการศึกษาล่าสุดในระบบแบบหนูแสดงให้เห็นว่า immunopathology คือในความเป็นจริงผู้ไกล่เกลี่ยโดยเซลล์ CD8 + T ที่ต้องการความช่วยเหลือจาก CD4 + T เซลล์ย่อย (15, 16,19, 20) เซลล์เม็ดเลือดขาวจากสมองของหนูที่ติดเชื้อมีฤทธิ์เป็นพิษต่อเซลล์ในหลอดทดลองส่วนใหญ่กับเซลล์เป้าหมายแสดงนิวคลีโอไวรัส (21). เราเพิ่งจัดตั้งรูปแบบเมาส์สำหรับโรคทางระบบประสาท BDV-induced (22) ในระบบการทดลองนี้สัตว์ของสายพันธุ์ที่มีการติดเชื้อ MRL intracerebrally กับ BDV ภายใต้เงื่อนไขเหล่า virusreplicates พร้อมในเซลล์ประสาทสมองที่จะถึง titers สูงสุดโดย 3-4 สัปดาห์ postinfection หลังจาก 4-6 สัปดาห์ผมมากที่สุด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ค่าของตัวเลข และ rfree rwork % และเป็นประวัติการณ์ตามลำดับ ( ตารางที่ 1 ) ไม่ interpretable ความหนาแน่นของอิเล็กตรอน จะพบกรดอะมิโนที่เหลือตกค้างซึ่งมักจะสับสน

การปรับแต่งตาราง 1 . การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ bdv-m. สถิติ

การแสดงออกของยีนและการ bdv-m แบบเต็มตัวของ bdv-m-maltose โปรตีนของโปรตีนได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ ( 16 ) น้ำตาลโปรตีนขี้รังแคโดยใช้เป็นระบบที่ IKEA ได้รับ fplc Biosciences )เพิ่มเติมการแยกของฟิวชั่นแท็กหลังจากความแตกแยก Xa ปัจจัยโดยใช้ขนาดยกเว้นโครมผ่าน hiload 26 / 60 superdex 75 คอลัมน์ ( ที่ Biosciences ) amicon Ultra แรงเหวี่ยงกรองหน่วย ( มิลลิ ) ใช้ที่ความเข้มข้นสุดท้ายทำให้ bdv-m.

อย่างการทดลองขั้วโลกสมองไขมันสกัด ( สุกร ) ซื้อมาจาก AVANTI ขั้วโลกไขมันและใช้โดยไม่ต้องบำบัดต่อไป การวัดความดันได้โดยใช้ homebuilt ภาพยนตร์สมดุลกับราง Teflon วงกลม ( พื้นที่ผิวและปริมาตร 7 cm2 subphase 11 ml ) พื้นผิวความดันวัดกับ wilhelmy วิธีเพลท ( riegler &เคอร์สไตน์ )การ subphase เป็นบริสุทธิ์มากสารละลายบัฟเฟอร์ ( 50 มิลฮีเปส , 25 mM NaCl , pH 7.6 ) ส่วนผสมของไขมันละลายในคลอโรฟอร์ม และแพร่กระจายไปในอากาศ น้ำ interace กับ microsyringe ให้เริ่มต้นพื้นผิวความดันระหว่าง 12 และ 32 MN / m . ผิวฟิล์มจะถูก equilibrated เป็นเวลาอย่างน้อย 30 นาทีหลังจากที่โปรตีนถูกฉีดเข้าไปใน subphase และพื้นผิวความดันที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ ท้ายรางความเข้มข้นของ tetramers bdv-m ในแต่ละการทดลอง 100 นาโนเมตร ทดลองที่ 20 ± 0.5 ° C ในภาชนะบรรจุที่ปิดสนิทเพื่อรักษาความชื้นของอากาศคงที่ , กวนอย่างต่อเนื่องของ subphase กับแม่เหล็กกวนบาร์ .

แยกกรดนิวคลีอิกการ copurified แยกจากโปรตีนกรดนิวคลีอิกดังนี้ 100 μ L ของสารละลายโปรตีนลด 100 μ l โปรเคบัฟเฟอร์ ( Merck ) และย่อยโปรตีน 20 μ l K ( Merck ) ที่ 50 องศา C นาน 30 - 45 นาที ฟีนอล / คลอโรฟอร์ม ( 220 μล. 1 : 1 ) ได้เพิ่ม 220 μ L ของโปรตีน k ปฏิกิริยาผสมกับเศษแยกกรดนิวคลีอิกและโปรตีนและหลังจาก vortexing ปั่น 30 นาทีที่ 19 , 000 กรัม× เฟสน้ำชั้นบนแยกเป็นครั้งที่ 1 Vol คลอโรฟอร์ม กรดนิวคลีอิกแยกได้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอนเอทานอล หนึ่งไมโครลิตรไกลโคเจน ( 20 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ; โรช ) 3 10 M แอมโมเนียมอะซิเตท และ 10 เล่มที่สมบูรณ์เอทานอลเพิ่มระดับ 20 นาทีที่ 10 ×กรัมเม็ดล้างμ 50 ลิตรเอทานอล 70% โดยการเหวี่ยงแยกที่ 10 ×กรัม ที่ถูกละลายใน 20 μ l diethylpyrocarbonate ( depc ) ใน H2O และเก็บรักษาที่ − 20 ° C .
( การติดฉลากและเลสย่อย

เอนไซม์หัวนมใช้ radiolabel 3 นั้นปลายของลำต้น ssrna . 50 - μ L ปฏิกิริยาที่มีอยู่ 25 μ L 2 × PAP บัฟเฟอร์ ( อังกฤษ biolabs ) 05 μ l rnasin ( promega ) 1 μชั้น 25 - 20 ( โรท ) 1 μ L 50 มม. mncl2 ( Merck ) 1 μ l depc H2O , 20 μ L ของกรดนิวคลีอิกแยก 1 μ l α 32p cordecypin ไตรฟอสเฟต ( ชาม วิทยาศาสตร์ชีวภาพ ) และ 0.5 μล. หัวนม ( อังกฤษ biolabs ) ปิ่นเกล้าถูกใช้สำหรับ 5 ได้รับการติดฉลาก ห้าตัวเลขของบัฟเฟอร์ ปิ่นเกล้า 10 × ( อังกฤษ biolabs ) 0.5 ลิตร ( μ rnasin promega ) , 0.5 μ L 100 มม. CDP ( Sigma )5 μลิตร 500 nm เอทีพี ( Sigma ) โดยμ l depc H2O , 20 μ L ของกรดนิวคลีอิกแยก 1 μ l γ [ 32 ] เอทีพี ( ชาม วิทยาศาสตร์ชีวภาพ และμ 0.5 ลิตร ปิ่นเกล้า ( อังกฤษ biolabs ) มีการเพิ่ม ทั้งปฏิกิริยาบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศา
เป็นเลสย่อย ดำเนินการเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างอาร์เอ็นเอ และดีเอ็นเอ 16 ตัวเลขของเลสบัฟเฟอร์ ( 20 มิลลิเมตร โดย 100 mM NaCl , pH 8.0 )3 μ l radiolabeled กรดนิวคลีอิก และ 1 μลเลส T1 ( 25 หน่วย / μล. Roth ) บ่ม 30 นาทีที่ 30 องศา C .
หน้ายูเรียของกรดนิวคลีอิก .

เลสย่อยปฏิกิริยาถูกหยุดโดยการเพิ่ม 30 μชั้น 5 เฟอร์ฟอร์มาไมด์× ( 10 มล. Formamide , 10 มิลลิกรัม xylencyanol 10 มิลลิกรัมของโบรโมฟีนอลบลู , 200 μล. 0.5 M EDTA ) μ 0.5 ลิตรตัวอย่างของ PAP - ปิ่นเกล้าติดฉลากและปฏิกิริยาผสม 95 μชั้น 5 เฟอร์ฟอร์มาไมด์× . ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกต้มนาน 5 นาทีที่ 95 องศา แยก 10 - μผมเตรียมศึกษาออก 20% อะคริลาไมด์ / 50 % ยูเรียเจล ที่ 40-w พลังกับเอนไซม์จากบัฟเฟอร์ที่มี 90 มม. 90 มม. boric acid และ 1 mM EDTA sectionnext


ก่อนหน้านี้กิตติกรรมประกาศมาตราขอขอบคุณ กาลิน่า kachalova และฮันส์ bartunik ของมักซ์พลังค์เพื่อให้เวลาผู้ให้บริการคานและมีคุณค่าทดลองความช่วยเหลือที่บีมไลน์ BW 6 ของเยอรมัน elektronen พลิกลิ้น ฮัมบูร์ก มาร์ wahle ( Institut f ü r บิโอเคมี , มาร์ติน ลูเธอร์ มหาวิทยาลัยและ T ฮอลล์ วิท ) เพื่อประโยชน์ในการติดฉลากแนะนำเบส ) , อัลเฟรด บลูม ( Institut f ü r เคมี ,มาร์ติน ลูเทอร์ มหาวิทยาลัยโคลัมเบีย ) และ T ฮอลล์อภิปรายเกี่ยวกับอย่างการทดลองและข้อกำหนด Herden ( Institut F ü r veterin และ r-pathologie จั , หนังสือมหาวิทยาลัยและ T จีจี้ß en ) สำหรับการสนทนาที่เป็นประโยชน์เกี่ยวกับต้นฉบับ งานวิจัยนี้ได้รับการสนับสนุนจากเครือข่าย forschungsgemeinschaft graduiertenkollegs 541 " proteinfunktion เกี่ยวกับ atomarer ebene " ( w.g. และ m.t.s.) และก่อนหน้านี้ " ในการเปลี่ยนในปฏิสัมพันธ์ macromolecular " ( m.t.s. )

-
เชิงอรรถก่อนหน้านี้ sectionnext ส่วนปลาหางไหม้ ซึ่งจดหมายควรจะ addressed อีเมล : สตับส์ @ biochemtech . Uni Halle . de
- ผู้เขียนเขียน : w.g. m.t.s. ออกแบบและวิจัย p.n. หรอก s.m. เอ. เค , ตำรวจ , , , i.k. และ m.t.s. ดำเนินการวิจัย s.m. เอ. เค และ i.k. ส่วนใหม่ , สารเคมี / เครื่องมือวิเคราะห์ ;p.n. เอ. เค w.g. , , , และ m.t.s. วิเคราะห์ข้อมูล และ p.n. หรอก w.g. , และ m.t.s. เขียนกระดาษ .
- 1on ออกจาก : wydzia ł chemii uniwersytet มิโกะ , łสู้ kopernika gagarina , 7 , 87-100 โทรุน , โปแลนด์ .
- 2present ที่อยู่ : ขอขอบคุณที่จดสิทธิบัตรเดียวเดอ ชีววิทยา chimique Institut de et é d'ing , วิทยาศาสตร์ nierie supramol é culaires , 8 , é e โมงเจ้ากาสปาร์ดฺ BP 70028 f-67083 เซแด๊กซ์ , สตราสบูร์ก ,
Strasbourg , ฝรั่งเศส .บริการ 3present ที่อยู่ : bundesforschungsanstalt F ü r เอิร์น และ hrung และ lebensmittel Institut F ü r , บิโอเคมี และ physiologie เดอ เอิร์น และ hrung แฮร์มันน์ weigmann strasse 1 , d-24103 คีล , เยอรมนี .
- ผู้เขียนประกาศไม่ขัดผลประโยชน์ .
- บทความนี้เป็นสารโพลีนิวเคลียร์ โดยส่ง สะสมข้อมูล
- : พิกัดของอะตอม ได้รับเงินที่ฝากในธนาคารข้อมูลโปรตีน www.pdb.org ( PDB , ID
code3f1j )- บทความนี้ประกอบด้วยข้อมูลสนับสนุนออนไลน์ที่ www.pnas . org / cgi / เนื้อหา / เต็ม / 0808101106 / dcsupplemental .



ก่อนหน้านี้ส่วนอ้างอิง 1 ↵
1 de la Torre JC
( 2006 ) กลับทางพันธุกรรมแนวการศึกษาโรคไวรัสบอร์นา . ที่ 4:777 บาทหลวง ธนิดา เหรียญทอง B Sc ( 783 .



sciencegoogle crossrefmedlineweb ของนักวิชาการที่เป็นนามธรรมการติดเชื้อในทารกแรกเกิดด้วยโรคไวรัสบอร์นา ( bdv ) ก่อให้เกิดเยื่อหุ้มสมองกับสมองอักเสบรุนแรงและความผิดปกติในระบบประสาทของหนู แต่ไม่ใช่ใน 2-microglobulin-deficient บีตาของ MRI สายพันธุ์ ( h-2k ) temporaryin vivo การพร่องของ CD8 T เซลล์ล่าช้า bdv ชักนำโรคเป็นเวลาหลายสัปดาห์ ค่า CD4 ทีเซลล์มีคล้ายกันประโยชน์ผลแสดงว่า bdv เกิดผิดปกติทางสมองในหนูเป็นเซลล์ที CD4 immunopathological ขึ้นอยู่กับกระบวนการที่เป็นคนกลาง โดย CD8 T เซลล์ ถูกเตรียมจากสมองของหนูที่ป่วยส่วนใหญ่มาจาก CD8 T เซลล์ย่อย .พวกเขามีกฎระเบียบของการเปิดใช้งานเครื่องหมาย และพยายามเข้มแข็ง MHC i-restricted พิษต่อเซลล์มะเร็งกับเซลล์เป้าหมายแสดง bdv นิ วคลีโอโปรตีนพี . การติดเชื้อของ b10.br ( h-2k ) หรือ congenic c57bl / 10 ( h-2b ) หนู ( symptomless , คงอยู่ตลอดชีวิตของ bdv ในสมองซุปเปอร์ นเฟ็กชั่นกับไวรัสคอม vaccinia แสดง bdv ดำแต่ไม่ใช่กับไวรัสและโรคทางระบบประสาทอื่น ๆ vaccinia รุนแรงและอักเสบในผู้ติดเชื้อ b10.br แต่หนูไม่ได้เสมอที่ติดเชื้อ c57bl / 10 หนู ระบุว่า โรคกระตุ้นการตอบสนองของเซลล์ T ถูก จำกัด ไปยังนิ วคลีโอโปรตีนของ bdv ในหนู h-2k .ผลของเราแสดงให้เห็นว่าแขนเซลล์ของระบบภูมิคุ้มกันอาจละเว้นการแสดงตนของคำตอบไวรัสในระบบประสาทส่วนกลางจนเหมาะสมแอนติเจนกระตุ้นที่เว็บไซต์ทริกเกอร์การตอบสนองต่อฤทธิ์ต้านไวรัสโรคบอร์นา .
( bdv ) เป็นตัวแทนของโรงเรียนเป็น nonpurulent เยื่อหุ้มสมองกับสมองอักเสบ พบส่วนใหญ่ในม้าและแกะ ( 1 , 2 )มันเป็นไวรัสที่มีเปลือกเดี่ยว stranded RNA genome ของขั้ว ลบ ( 3 , 4 ) , และมันเป็นสมาชิกของครอบครัวต้นแบบ designatedbornaviridae ไวรัสใหม่ในการสั่งซื้อ mononegavirales ( 5 , 6 ) มีช่วงกว้างเป็นพิเศษ bdv โฮสต์ในอบอุ่น blooded สัตว์และมันสามารถทำซ้ำในระบบประสาทส่วนกลาง ( CNS ) ของตัวเลขขนาดใหญ่ของสัตว์ที่ติดเชื้อชนิดนี้ ( 1 ) bdv การติดเชื้อจากมนุษย์กับโรคทางจิตเวชมีรายงาน ( 7 – 10 ) อย่างไรก็ตาม บทบาทของมนุษย์ในทราบ bdv โรคทางจิตยังคงต้องทำการ .
ในธรรมชาติและในผู้ใหญ่ติดเชื้อติดเชื้อโฮสต์โดยหนูโรคทางระบบประสาท และความผิดปกติของพฤติกรรมที่ดูเหมือนจะเป็นผลส่วนใหญ่มาจากกระบวนการ immunopathological ( 11 – 13 ) แข็งแรงและ perivascular parenchymal CD4 CD8 T เซลล์และบุกรุกที่พบ , และลักษณะที่ปรากฏของพวกเขาในสมองมีความสัมพันธ์กับการโจมตีของอาการโรค ( 11 , 13 และ 16 ) ในบทบาทของ CD4 ทีเซลล์โรค ofborna เหนี่ยวเน้น ( 17 , 18 ) อย่างไรก็ตามการศึกษาในหนู พบว่า แบบจำลองระบบ immunopathology เป็น , ในความเป็นจริง , CD8 T ) โดยเซลล์ที่ต้องการความช่วยเหลือจาก CD4 ทีเซลล์ย่อย ( 15 , 16,19 , 20 ) ลิมโฟซัยต์จากสมองของหนูที่ติดเชื้อพบพิษต่อเซลล์มะเร็งในหลอดทดลอง ส่วนใหญ่กับเซลล์เป้าหมายแสดงนิ วคลีโอโปรตีนของไวรัส ( 21 ) .
เราเพิ่งสร้างแบบจำลองเมาส์สำหรับ bdv ชักนำโรคทางระบบประสาท ( 22 )ในการทดสอบระบบนี้ สัตว์ที่สามารถติดเชื้อกับความเครียด intracerebrally bdv . ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ virusreplicates พร้อมในเซลล์ประสาทสมองที่มันถึงสูงสุดโดย 3 – 4 สัปดาห์ postinfection . หลังจาก 4 - 6 สัปดาห์ ส่วนใหญ่ผม