Trypsin DigestionThe in-solution tr

Trypsin Digestion

The in-solution trypsin digestion of rErAII was performed using an adapted protocol (Klammer and Maccoss, 2006). Desalted and dried samples of rErAII containing 35 µg of protein (1 nmol) were resuspended in 50 µL of 0.1% (w/v) RapiGest SF acid labile surfactant (Waters Corp.) diluted in 50 mM ammonium bicarbonate, pH 7.8. The samples were heated to 99 ºC for 2 min, and DTT was added for a final concentration of 5 mM. After incubation at 60 ºC for 30 min, iodoacetamide was added to a final concentration of 15 mM and the samples were incubated for 30 min at room temperature while protected from light. Trypsin was added at a ratio of 1:100 enzyme/protein along with CaCl2 at a final concentration of 1 mM, and the solution was incubated for 1 h at 37 ºC. For surfactant degradation, HCl was added at a final concentration of 100 mM. The samples were centrifuged at 20,800 x g at 4 ºC for 10 min, and the supernatants were transferred to clean tubes.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทริปซินย่อยการย่อยอาหารทริปซินในโซลูชันของ rErAII ดำเนินการโดยใช้โพรโทคอลการปรับตัว (Klammer และ Maccoss, 2006) Desalted และแห้งตัวอย่าง rErAII ที่ประกอบด้วย 35 µg ของโปรตีน (นาโนโมล 1) ได้ resuspended ใน 50 µL 0.1% (w/v) RapiGest SF กรด labile ชุด (น้ำ Corp.) เจือจางใน 50 มม.แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต pH 7.8 ตัวอย่างถูกทำให้ร้อนถึง 99 ºC สำหรับ 2 นาที และ DTT ถูกเพิ่มสำหรับความเข้มข้นสุดท้ายของ 5 mM หลังจากบ่มที่ 30 นาที 60 ºC, iodoacetamide เพิ่มเพื่อความเข้มข้นสุดท้าย 15 มม. และตัวอย่างได้รับการกก 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องในขณะที่ป้องกันแสง เพิ่มทริปซินในอัตราส่วน 1: 100 เอนไซม์/โปรตีนพร้อมกับ CaCl2 ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1 มม. และโซลูชัน incubated สำหรับ 1 ชั่วโมงที่ 37 ºC การสลายตัวของสารทำความสะอาด HCl ถูกที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 mM ตัวอย่างได้จากที่ 20,800 x g ที่ 4 องศาเซลเซียส 10 นาที และ supernatants ถูกโอนย้ายไปทำความสะอาดท่อ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

trypsin ย่อย

ที่อยู่ในการแก้ปัญหาการย่อยอาหารของ trypsin rErAII ได้ดำเนินการโดยใช้โปรโตคอลดัดแปลง (Klammer และ Maccoss 2006) ตัวอย่าง desalted และแห้งของ rErAII มี 35 ไมโครกรัมของโปรตีน (1 นาโนโมล) ถูก resuspended ใน 50 ไมโครลิตร 0.1% (w / v) กรด RapiGest SF labile ลดแรงตึงผิว (วอเตอร์คอร์ป) เจือจางในขนาด 50 มมแอมโมเนียมไบคาร์บอเนตค่า pH 7.8 กลุ่มตัวอย่างที่ถูกความร้อนถึง 99 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและ DTT ถูกเพิ่มเข้ามาสำหรับความเข้มข้นสุดท้าย 5 มิลลิ หลังจากการบ่มที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที, iodoacetamide ถูกบันทึกอยู่ในความเข้มข้นสุดท้ายของ 15 มมและกลุ่มตัวอย่างถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องในขณะที่ได้รับการคุ้มครองจากแสง trypsin ถูกเพิ่มเข้ามาในอัตราส่วน 1: 100 เอนไซม์ / โปรตีนพร้อมกับ CaCl2 ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 1 มิลลิและวิธีการแก้ปัญหาที่ถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส สำหรับการย่อยสลายลดแรงตึงผิว, HCl ถูกเพิ่มเข้ามาในความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 มิลลิเมตร ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 20,800 XG ที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีและ supernatants ถูกย้ายไปทำความสะอาดท่อ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การย่อยอาหารเอนไซม์ในสารละลายเอนไซม์ย่อย reraii ได้ดําเนินการโดยใช้การดัดแปลงโปรโตคอล ( klammer และ maccoss , 2006 ) desalted และตัวอย่างของ reraii จำนวน 35 µกรัมของโปรตีนอบแห้ง ( 1 ? ) resuspended 50 µ L 0.1% ( w / v ) rapigest SF กรดที่ใช้ ( น้ำ Corp . ) เจือจางในไบคาร์บอเนตแอมโมเนียม 50 mm pH 7.8 . จำนวน 99 ºอุ่นนาน 2 นาที และส่วนเพิ่มสำหรับความเข้มข้นสุดท้าย 5 มิล หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ 60 º C นาน 30 นาที iodoacetamide กำลังเพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย 15 มิลลิเมตร และทำการบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีในขณะที่ป้องกันแสง รูปเพิ่มในอัตราส่วน 1 : 100 เอนไซม์หรือโปรตีนพร้อมกับผลิตที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1 มิลลิเมตร และสารละลายที่บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ºสำหรับการย่อยสลายสาร HCL , เพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 มม. จำนวนระดับที่ 20 , 800 x g 4 º C นาน 10 นาที และ supernatants ถูกทำความสะอาดท่อ