The genomes of plants and animals e

The genomes of plants and animals encode hundreds of non-coding ~22nt RNAs termed "microRNAs" (miRNAs). These RNAs guide the sequence-specific inhibition of translation and destabilization of mRNA targets through short (6-7 nucleotide) stretches of complementarity between the 5' end of the miRNA (seed region) and the 3' untranslated region (UTR) of the targeted mRNA. Computational estimates based on prediction of conserved seed matches in 3'UTRs suggest that over half of genes in mammalian genomes are miRNA-regulated. Many miRNAs are also ubiquitously expressed in a variety of embryonic and adult tissues. Given these observations, we have sought to address the challenge of determining which cellular and biological processes that miRNAs might regulate in different cell types and tissues. First, we have developed methods to isolate candidate miRNA-targeted mRNAs by immunoprecipitation of Ago2 in the miRNA effector complex (miRNP). In one purification method, the Ago2-bound mRNAs are identified by microarray. The second purification method adds crosslinking, RNase digestion, and cloning and deep-sequencing (CLIP-seq) to improve the specificity. These experiments were performed in mouse embryonic stem cells (mESCs) and a miRNA-deficient derivative cell line, lacking miRNA-processing enzyme, Dicer, to enrich for targets of miR-290~295, a miRNA cluster highly-expressed in mESCs. By these methods, we have identified a set of candidate mRNAs that bear a motif in their 3'UTRs that matches the seed of miR-290~295 and exhibit a miRNA-dependent gene expression signature. Gene ontology analysis of these candidate mRNAs shows they are involved in regulating the cell cycle, apoptosis, and the TGF-[beta] pathway. We further show that mESCs lacking miR-290~295 are unable to differentiate into endoderm, a TGF-[beta] regulated process. We present additional evidence that RNAs crosslinked to Ago2 are significantly enriched in a G-rich motif in a miRNA-independent manner, as it is present in Ago2-CLIP libraries from Dicer wild-type and Dicer null mESCs. This G-rich motif exhibits higher conservation than the general 3'UTR background and appears to modulate the activity of miR-290~295 binding sites from the 3'UTRs of two genes. This G-rich motif may confer additional specificity to the AgomiRNP and increase its affinity for miRNA-targeted mRNAs. We have also investigated the function of a family of miRNA clusters in mouse embryonic development by targeted deletion of miR-17~92, and its paralogs, miR-106b~25 and miR-106a~363. miR-106b~25 and miR-106a~363 null mice are viable and fertile, however, miR- 17~92-null mice die short after birth with lung hypoplasia and ventral septal defect. miR-17~92 null embryos also lack mature B cells, due to a block in the pro- to pre-B cell transition. Pre-B cells from the fetal livers of miR-17~92 null embryos have higher rate of apoptosis compared to wild-type embryos and upregulation of pro-apoptotic gene, Bim, a miR-17~92 target. Our findings demonstrate roles for two different clusters of miRNAs in regulating cellular processes of cell cycle, cell death, and cell signaling, that are important for differentiation of several different tissue types. Biochemical target identification and targeted deletion of miRNA clusters in the mouse are both useful tools for uncovering miRNA functions.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Genomes ของพืชและสัตว์เข้ารหัสของรหัสไม่ ~ 22nt RNAs เรียกว่า "microRNAs" (miRNAs) RNAs เหล่านี้คู่มือยับยั้งเฉพาะลำดับแปลและ destabilization ของ mRNA เป้าหมายผ่านสั้น (6-7 นิวคลีโอไทด์) ยาวเหยียด complementarity ระหว่างปลาย 5' ของ miRNA (เมล็ดภูมิภาค) และ 3 untranslated ภูมิภาค (UTR) ของ mRNA เป้าหมาย ประเมินคำนวณตามพยากรณ์ตรงกันนำเมล็ดใน 3' UTRs แนะนำกว่า ครึ่งหนึ่งของยีนใน mammalian genomes ที่ควบคุม miRNA MiRNAs มากจะยัง ubiquitously แสดงในความหลากหลายของเนื้อเยื่อตัวอ่อน และผู้ใหญ่ ให้สังเกตเหล่านี้ เราได้พยายามที่จะอยู่ที่ความท้าทายในการกำหนดซึ่งโทรศัพท์มือถือ และชีวภาพกระบวนการ miRNAs ที่อาจควบคุมชนิดต่าง ๆ เซลล์และเนื้อเยื่อ ครั้งแรก เราได้พัฒนาวิธีการแยกผู้เป้าหมาย miRNA mRNAs โดย immunoprecipitation Ago2 ในที่ miRNA effector ซับซ้อน (miRNP) ในหนึ่งวิธีฟอก mRNAs Ago2 ผูกจะถูกระบุ โดย microarray วิธีการฟอกสองเพิ่ม crosslinking, RNase ย่อย อาหาร และโคลน และลึกลำดับ (ปะลำดับ) เพื่อปรับปรุงการ specificity ดำเนินการทดลองเหล่านี้ในเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนเมาส์ (mESCs) และเซลล์พัฒนา miRNA ไม่สาย ขาดเอนไซม์ miRNA ประมวลผล Dicer แก่สำหรับเป้าหมายของมีร์-290 ~ 295 คลัสเตอร์ miRNA สูงแสดงใน mESCs โดยวิธีนี้ เราได้ระบุชุดของผู้สมัคร mRNAs ที่หมีแปลนในการ UTRs 3 ที่ตรงกับเมล็ดของมีร์-290 ~ 295 และแสดงลายเซ็นนิพจน์ miRNA ขึ้นอยู่กับยีน การวิเคราะห์ยีนภววิทยาของ mRNAs เหล่านี้ผู้แสดงจะเกี่ยวข้องกับการควบคุมวงจรเซลล์ apoptosis และ TGF- [เบต้า] ทางเดิน เพิ่มเติมแสดง mESCs ที่ขาดมีร์-290 ~ 295 ไม่สามารถแยกความแตกต่างเป็นเอนโดเดิร์ม TGF- [เบต้า] ควบคุมกระบวนการ เรานำเสนอหลักฐานเพิ่มเติมว่า crosslinked RNAs เพื่อ Ago2 มีมากอุดมไปในแปลน G รวยอย่างอิสระ miRNA เท่าที่มีอยู่ในไลบรารี Ago2 คลิป Dicer ป่าชนิดและ mESCs เป็น null Dicer แปลน G-ริชนี้จัดแสดงอนุรักษ์สูงกว่าทั่วไป 3' UTR ประกอบ และปรากฏการ modulate กิจกรรมของมีร์-290 ~ 295 ผูกอเมริกาจาก 3' UTRs ของยีนที่สอง แปลน G-ริชนี้อาจประสาท specificity เพิ่มเติมไป AgomiRNP และเพิ่มความสัมพันธ์ของสำหรับเป้าหมาย miRNA mRNAs เราได้ตรวจสอบการทำงานของครอบครัวของคลัสเตอร์ miRNA ในเมาส์ตัวอ่อนพัฒนา โดยการลบเป้าหมายของมีร์-17 ~ 92 และ paralogs มีร์ 106b ~ 25 และมีร์-106a ~ 363 มีร์ 106b ~ 25 และมีร์-106a ~ หนู 363 เป็น null จะได้อุดม สมบูรณ์ อย่างไรก็ตาม มีร์-17 ~ 92 ค่า null หนูตายสั้น ๆ หลังคลอดมี hypoplasia และ ventral บกพร่องของผนังกั้นปอด มีร์-17 ~ โคลน 92 เป็น null นอกจากนี้ยังขาดเซลล์ B ผู้ใหญ่ จากบล็อกในการเปลี่ยนแปลงเซลล์โปร - ไปก่อน-B เซลล์ B ก่อนจาก livers ครรภ์ของมีร์-17 ~ โคลน 92 เป็น null มีอัตราสูงเมื่อเทียบกับป่าชนิดโคลนและ upregulation ของยีนโป apoptotic, Bim มีร์-17 apoptosis ~ เป้าหมาย 92 ผลการวิจัยของเราแสดงให้เห็นถึงบทบาทในคลัสเตอร์ที่แตกต่างกันสองของ miRNAs ในการควบคุมวงจรเซลล์ เซลล์ตาย และเซลล์สัญญาณ โทรศัพท์มือถือกระบวนที่มีความสำคัญต่อการสร้างความแตกต่างของเนื้อเยื่อแตกต่างกันหลายชนิด ระบุเป้าหมายเชิงชีวเคมีและการลบเป้าหมายของคลัสเตอร์ miRNA ในเมาส์ได้ทั้งประโยชน์เครื่องมือสำหรับฟังก์ชัน miRNA uncovering

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

จีโนมของพืชและสัตว์เข้ารหัสหลายร้อยที่ไม่ได้เข้ารหัส ~ RNAs 22nt เรียกว่า "microRNAs" (miRNAs) RNAs เหล่านี้เป็นแนวทางในการยับยั้งลำดับที่เฉพาะเจาะจงของการแปลและการ destabilization ของเป้าหมาย mRNA ผ่านสั้น (6-7 เบื่อหน่าย) แนว complementarity ระหว่างปลาย miRNA (ภูมิภาคเมล็ด) และ 3 '5 ภูมิภาค untranslated (UTR) ของเป้าหมาย mRNA ประมาณการการคำนวณขึ้นอยู่กับการคาดการณ์ของการจับคู่เมล็ดพันธุ์ในป่าสงวน 3'UTRs ชี้ให้เห็นว่ากว่าครึ่งหนึ่งของยีนในจีโนมเลี้ยงลูกด้วยนมมี miRNA ควบคุม miRNAs หลายคนยังแสดงความ ubiquitously ในความหลากหลายของเนื้อเยื่อตัวอ่อนและตัวเต็มวัย ได้รับข้อสังเกตเหล่านี้เราได้พยายามที่จะรับมือกับความท้าทายของการกำหนดซึ่ง cellular และกระบวนการทางชีวภาพที่ miRNAs อาจควบคุมในเซลล์ชนิดที่แตกต่างกันและเนื้อเยื่อ ครั้งแรกที่เราได้มีการพัฒนาวิธีการที่จะแยก mRNAs miRNA กำหนดเป้​​าหมายผู้สมัครโดยการตกตะกอนภูมิคุ้มกันของ Ago2 ใน Effector ซับซ้อน miRNA (miRNP) ในวิธีการทำให้บริสุทธิ์หนึ่ง mRNAs Ago2 จำกัด จะมีการระบุโดย microarray วิธีการทำให้บริสุทธิ์ที่สองเพิ่มการเชื่อมขวาง RNase ย่อยอาหารและการโคลนและลึกลำดับ (คลิป seq) เพื่อปรับปรุงความจำเพาะ การทดลองนี้ได้ดำเนินการในเมาส์เซลล์ตัวอ่อนก้าน (mESCs) และเซลล์ miRNA ขาดอนุพันธ์ขาดเอนไซม์ miRNA ประมวลผล Dicer, เพื่อเพิ่มสำหรับเป้าหมายของ miR-290 ~ 295, กลุ่ม miRNA สูงแสดงใน mESCs โดยวิธีการเหล่านี้เราได้ระบุชุดของ mRNAs สมัครที่แบกเด่นใน 3'UTRs ของพวกเขาที่ตรงกับเมล็ดพันธุ์แห่ง miR-290 ~ 295 และแสดงลายเซ็นการแสดงออกของยีน miRNA ขึ้นอยู่กับ การวิเคราะห์ยีนอภิปรัชญาเหล่านี้แสดงให้เห็น mRNAs ผู้สมัครที่พวกเขามีส่วนร่วมในการควบคุมวงจรมือถือ, การตายและ TGF- [เบต้า] ทางเดิน เรายังแสดงให้เห็นว่าขาด mESCs miR-290 ~ 295 ไม่สามารถที่จะแยกความแตกต่างใน endoderm, TGF- [เบต้า] การควบคุมกระบวนการ เรานำเสนอหลักฐานเพิ่มเติมที่ RNAs เชื่อมขวางเพื่อ Ago2 อุดมอย่างมีนัยสำคัญในบรรทัดฐาน G-อุดมไปด้วยในลักษณะ miRNA อิสระตามที่มันมีอยู่ในห้องสมุด Ago2 คลิปจาก Dicer ชนิดป่าและ Dicer mESCs null นี้ G-อุดมไปด้วยการจัดแสดงมาตรฐานการอนุรักษ์สูงกว่าพื้นหลัง 3'UTR ทั่วไปและดูเหมือนจะปรับกิจกรรมของ miR-290 ~ 295 มีผลผูกพันจากเว็บไซต์ 3'UTRs ของสองยีน มาตรฐาน G-อุดมไปด้วยซึ่งอาจมอบความจำเพาะเพิ่มเติมเพื่อ AgomiRNP และเพิ่มความสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดสำหรับ mRNAs miRNA เป้าหมาย นอกจากนี้เรายังตรวจสอบการทำงานของครอบครัวของกลุ่ม miRNA ในการพัฒนาเมาส์ตัวอ่อนโดยการลบเป้าหมายของ miR-17 ~ 92 และ paralogs ของ miR-106b ~ 25 และ miR-106a ~ 363 miR-106b ~ 25 และ miR-106a ~ 363 หนู null จะทำงานได้และอุดมสมบูรณ์ แต่ miR- หนู 17 ~ 92 โมฆะตายสั้นหลังคลอดที่มี hypoplasia ปอดและข้อบกพร่องผนังหน้าท้อง miR-17 ~ 92 ตัวอ่อน null ยังขาดขเซลล์ผู้ใหญ่เนื่องจากบล็อกในโปรไปก่อน-B การเปลี่ยนแปลงของเซลล์ เซลล์ Pre-B จากตับของทารกในครรภ์ของ miR-17 ~ 92 ตัวอ่อน null มีอัตราที่สูงขึ้นเมื่อเทียบกับเซลล์ตัวอ่อนชนิดป่าและ upregulation ของยีนโปร apoptotic, บิ๋ม, miR-17 ~ 92 เป้าหมาย ค้นพบของเราแสดงให้เห็นถึงบทบาทของสองกลุ่มแตกต่างกันของ miRNAs ในการควบคุมกระบวนการเซลล์ของว​​งจรมือถือ, การตายของเซลล์และการส่งสัญญาณมือถือที่มีความสำคัญสำหรับความแตกต่างของหลายประเภทเนื้อเยื่อที่แตกต่างกัน การระบุเป้าหมายทางชีวเคมีและการลบเป้าหมายของกลุ่ม miRNA ในเมาส์เป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับทั้งสองฟังก์ชั่นการเปิดเผย miRNA

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในจีโนมของพืชและสัตว์ที่เข้ารหัสหลายร้อยไม่นะครับ ~ 22nt RNAs เรียกว่า " micrornas " ( mirnas ) RNAs เหล่านี้คู่มือลำดับเฉพาะการยับยั้งแปลและ destabilization ของ mRNA เป้าหมายผ่านสั้น ( 6-7 นิวคลีโอไทด์ ) เหยียดของข้อมูลระหว่างปลาย 5 ' ของ mirna ( ภูมิภาคเมล็ด ) และ 3 เขตแปล ( UTR ) ของ mRNA เป้าหมาย .การคำนวณประมาณการตามคำทำนายของการอนุรักษ์พันธุ์ที่ตรงกับใน 3'utrs แนะนำว่า กว่าครึ่งหนึ่งของยีนในจีโนมเป็นสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม mirna ควบคุม หลาย mirnas ยังมี ubiquitously แสดงออกในหลากหลายของผู้ใหญ่และเนื้อเยื่อ ให้สังเกตเหล่านี้เราขอที่อยู่ที่ท้าทายของการกําหนดซึ่งเซลล์และกระบวนการทางชีวภาพที่ mirnas อาจควบคุมในรูปแบบต่างเซลล์และเนื้อเยื่อ ครั้งแรกที่เราได้พัฒนาวิธีการแยกผู้สมัคร mirna เป้าหมายรหัสโดย immunoprecipitation ของ ago2 ใน mirna โต้งซับซ้อน ( mirnp ) หนึ่งในวิธีการบำบัดน้ำเสีย , ago2 ผูกรหัสจะถูกระบุโดย microarray .วิธีที่สองเพิ่มเลสทำปฏิกิริยาฟอก , การย่อยอาหารและการโคลนยีนและลำดับลึก ( คลิป seq ) เพื่อปรับปรุง specificity การทดลองเหล่านี้แสดงในเมาส์ตัวอ่อนเซลล์ต้นกำเนิด ( mescs ) และอนุพันธ์ mirna ขาดเซลล์เส้นขาดการประมวลผลเอนไซม์ mirna ไดเซอร์ เพื่อเพิ่ม สำหรับเป้าหมายของ mir-290 ~ 295 , mirna กลุ่มสูงแสดงออกใน mescs . โดยวิธีการเหล่านี้เราได้ระบุชุดของผู้สมัครรหัสหมีแม่ลายใน 3'utrs ที่ตรงกับเมล็ดพันธุ์ mir-290 ~ แล้วแสดง mirna ขึ้นอยู่กับการแสดงออกของยีนลายมือชื่อ การวิเคราะห์ยีนอภิปรัชญาของรหัสผู้สมัครเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าพวกเขามีส่วนร่วมในการควบคุมวัฏจักรเซลล์ apoptosis และ tgf - [ beta ] เส้นทางเราเพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่า mescs ขาด mir-290 ~ ผมไม่สามารถแยกเป็นเอนโดเดิร์ม , tgf - [ beta ] การควบคุมกระบวนการ เราเสนอเพิ่มเติมหลักฐานที่เชื่อมโยงกับ ago2 RNAs เป็นอย่างอุดมใน g-rich แรงจูงใจใน mirna อิสระ ลักษณะ เป็น ปัจจุบัน ห้องสมุดคลิป ago2 จากพระจริยวัตรของพระจริยวัตร และการ mescs .นี้ g-rich โมทีฟ นิทรรศการการอนุรักษ์สูงกว่าพื้นหลัง 3'utr ทั่วไปและปรากฏการกิจกรรมของ mir-290 ~ 295 เต็มเปี่ยมจาก 3'utrs สองยีน นี้ g-rich แม่ลายอาจมอบเฉพาะเจาะจงเพิ่มเติมเพื่อ agomirnp และเพิ่มความสัมพันธ์ของ mirna เป้าหมายรหัสนอกจากนี้เรายังได้ศึกษาการทำงานของครอบครัว mirna กลุ่มในการพัฒนาตัวอ่อนเมาส์โดยเป้าหมายลบ mir-17 ~ 92 และ paralogs mir-106b mir-106a ~ ~ 25 , 363 . mir-106b ~ 25 และ mir-106a ~ คุณ null หนูจะวางอนาคต และอุดมสมบูรณ์ แต่เมียร์ - 17 ~ 92 null หนูตายสั้นหลังคลอดด้วย hypoplasia ปอด และพบความบกพร่อง mir-17 ~ 92 ไม่มีค่าตัวยังขาดผู้ใหญ่ขเซลล์เนื่องจากบล็อกใน Pro - pre-b เปลี่ยนเซลล์ pre-b เซลล์ตับของทารกในครรภ์ของ mir-17 ~ 92 เปอร์เซ็นต์ มีอัตราว่าง ( เมื่อเทียบกับยาในกลุ่มที่มียีนของตัวอ่อน และระหว่าง Pro , BIM , mir-17 ~ 92 เป้าหมาย ผลของเราแสดงให้เห็นถึงบทบาทที่แตกต่างกันสองกลุ่มของ mirnas ในการควบคุมกระบวนการของวัฏจักรเซลล์ การตายของเซลล์ เซลล์ และเซลล์สัญญาณที่สําคัญ คือ ความแตกต่างของประเภทของเนื้อเยื่อที่แตกต่างกันหลาย การระบุเป้าหมายทางชีวเคมี และเป้าหมายของกลุ่มในการ mirna เมาส์เป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการเปิดเผยการทำงาน mirna .