Whole-spore ELISA for detection of

Whole-spore ELISA for detection of spore-specific serum antibodies. A wholespore
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique was developed
and optimized in our laboratory and was based on a number of whole-cell ELISA
methods in which bacteria were used to coat plates at 4°C overnight (7, 20, 27)
or at room temperature for 45 min (21). Spores were suspended in 0.03 M
NaPO4 buffer (pH 7.4) containing 4% (wt/vol) paraformaldehyde at a concentration
of approximately 106 spores/ml. Plates (MaxiSorp; Nunc) were coated
with 50 l of a spore suspension per well and left at room temperature for 2 h
(the optimum incubation time). After three washes with phosphate-buffered
saline (PBS), the plates were blocked with 1% bovine serum albumin (BSA) in
PBS for 1 h at 37°C. Serum samples were subsequently applied by using a twofold
dilution series starting with a 1/40 dilution in ELISA diluent buffer (0.1 M
Tris-HCl [pH 7.4], 3% [wt/vol] NaCl, 0.5% [wt/vol] BSA, 10% [vol/vol] sheep
serum [Sigma], 0.1% [vol/vol] Triton X-100, 0.05% [vol/vol] Tween 20). Every
plate had replicate wells that contained a preimmune serum that was diluted
1/40. The plates were incubated for 2 h at 37°C before addition of anti-mouse
IgG–horseradish peroxidase conjugates (Sigma) used at a dilution of 1:2,000 in
PBS containing 1% BSA and 0.05% Tween 20. The plates were incubated for an
additional 1 h at 37°C, washed three times in PBS containing 0.05% Tween 20,
and then developed with the substrate 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (Sigma).
Reactions were stopped with 2 M H2SO4. Dilution curves were drawn for each
sample, and end point titers were calculated by determining the dilution that
produced the same optical density as the 1/40 dilution of a pooled preimmune
serum. Statistical comparisons between groups were performed by using the
Mann-Whitney U test. A P value of 0.05 was considered nonsignificant.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทั้งสปอร์ ELISA สำหรับตรวจแอนตี้เซรั่มเฉพาะสปอร์ Wholespore การเทคนิคเชื่อมโยงเอนไซม์ immunosorbent assay (ELISA) ได้รับการพัฒนาเพิ่มประสิทธิภาพในห้องปฏิบัติการของเรา และขึ้นอยู่กับจำนวนเซลล์ทั้งหมด ELISAวิธีการที่ใช้แบคทีเรียในการตราแผ่นที่ 4° C ค้างคืน (7, 20, 27)หรือ ที่อุณหภูมิห้องใน 45 นาที (21) เพาะเฟิร์นถูกหยุดชั่วคราวใน 0.03 MNaPO4 บัฟเฟอร์ (pH 7.4) มี 4% (wt/vol) paraformaldehyde ที่เข้มข้นของเพาะเฟิร์นประมาณ 106 / มลแผ่น (MaxiSorp Nunc) ถูกเคลือบมี 50 ลิตรระงับสปอร์ต่อดี และซ้ายที่อุณหภูมิห้องใน 2 h(คณะทันตแพทยศาสตร์สูงสุดเวลา) หลังจากสามต่อผิวหน้ากับ buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS), แผ่นที่ถูกบล็อก ด้วย 1% วัว serum albumin (บีเอสเอ) ในPBS สำหรับ h 1 ที่ 37 องศาเซลเซียส ตัวอย่างซีรั่มมาใช้โดยเป็นสองเท่าชุดเจือจางที่เริ่มเจือจาง 1/40 ในบัฟเฟอร์ diluent ELISA (0.1 Mตรี-HCl [pH 7.4], 3% [wt/vol] NaCl, 0.5% [wt/vol] บีเอสเอ แกะ 10% [vol/vol]เซรั่ม [ซิก], 0.1% [vol/vol] ไตรตั้น X 100, 0.05% [vol/vol] Tween 20) ทุกจานมีบ่อ replicate ที่ประกอบด้วยซีรั่ม preimmune ที่ถูกทำให้เจือจาง1/40 แผ่นถูก incubated สำหรับ h 2 ที่ 37° C ก่อนเพิ่มป้องกันเมาส์IgG – horseradish peroxidase conjugates (ซิกมา) ใช้ในการเจือจางของ 1:2,000 ในPBS ประกอบด้วยบีเอสเอ 1% และ 0.05% Tween 20 แผ่นที่ incubated สำหรับการh 1 เพิ่มเติมที่ 37° C ล้างสามครั้งใน PBS ประกอบด้วย 0.05% Tween 20แล้ว พัฒนาขึ้น ด้วยพื้นผิว 3,3, 5.5 - tetramethylbenzidine (ซิกมา)มีหยุดปฏิกิริยา 2 กำมะถัน M มีวาดโค้งเจือจางสำหรับแต่ละตัวอย่าง และจุดสิ้นสุด titers คำนวณได้ด้วยการเจือจางที่ผลิตความหนาแน่นออปติคอเดียวกันเป็นเจือจาง 1/40 ของ preimmune รวมซีรั่ม เปรียบเทียบทางสถิติระหว่างกลุ่มโดยดำเนินการการทดสอบมานน์วิทนีย์ยู ค่า P 0.05 ถือเป็น nonsignificant

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธี ELISA ทั้งสปอร์ในการตรวจหาแอนติบอดีในซีรั่มของสปอร์ที่เฉพาะเจาะจง wholespore
เอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน (ELISA)
เทคนิคที่ได้รับการพัฒนาและเพิ่มประสิทธิภาพในห้องปฏิบัติการของเราและก็ขึ้นอยู่กับจำนวนของทั้งเซลล์ELISA
วิธีการในการที่เชื้อแบคทีเรียที่ถูกนำมาใช้แผ่นเสื้อที่ 4 ° C ในชั่วข้ามคืน (7, 20, 27)
หรือที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 45 นาที (21) สปอร์ที่ถูกระงับใน 0.03 M
บัฟเฟอร์ NaPO4 (pH 7.4) ที่มี 4% (น้ำหนัก / ปริมาตร) paraformaldehyde
ที่ความเข้มข้นประมาณ106 สปอร์ / มล. แผ่น (MaxiSorp; Nunc) เคลือบ
50 ลิตรของสปอร์แขวนลอยต่อดีและทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง?
(เวลาบ่มที่เหมาะสม) หลังจากสามล้างด้วยฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (พีบีเอส) แผ่นที่ถูกปิดกั้นด้วย 1% ซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA)
ในพีบีเอสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
ตัวอย่างซีรั่มถูกนำไปใช้ในภายหลังโดยใช้สองชุดลดสัดส่วนเริ่มต้นด้วยการลดสัดส่วน 1/40 ในบัฟเฟอร์เจือจาง ELISA (0.1 M Tris-HCl [พีเอช 7.4], 3% [น้ำหนัก / ปริมาตร] โซเดียมคลอไรด์, 0.5% [น้ำหนัก / ปริมาตร] บีเอสเอ 10% [ปริมาตร / ปริมาตร] แกะเซรั่ม[ซิก] 0.1% [ปริมาตร / ปริมาตร] Triton X-100, 0.05% [ปริมาตร / ปริมาตร] Tween 20) ทุกจานมีหลุมทำซ้ำที่มีซีรั่ม preimmune ที่ถูกเจือจาง 1/40 แผ่นถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสนอกจากนี้ก่อนที่จะต่อต้านเมาส์IgG-มะรุม conjugates peroxidase (ซิกม่า) ที่ใช้ในการเจือจาง 1: 2,000 พีบีเอสบีเอสเอที่มี 1% และ 0.05% 20. Tween แผ่นถูกบ่มเป็นเวลาอีก 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสล้างสามครั้งในพีบีเอสที่มี Tween 0.05% ที่ 20 และได้รับการพัฒนาแล้วกับพื้นผิว 3,3 หรือไม่, 5,5? -tetramethylbenzidine (ซิกม่า). ปฏิกิริยาหยุด 2 M H2SO4 เส้นโค้ง Dilution ถูกดึงสำหรับแต่ละตัวอย่างและจุดสิ้นสุดtiters ถูกคำนวณโดยการกำหนดว่าการลดสัดส่วนการผลิตความหนาแน่นของแสงเช่นเดียวกับการลดสัดส่วน1/40 ของ preimmune พูเซรั่ม การเปรียบเทียบทางสถิติระหว่างกลุ่มที่ได้ดำเนินการโดยใช้Mann-Whitney U ทดสอบ ค่าของ AP? 0.05 ได้รับการพิจารณานัยสำคัญ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ทั้งสปอร์สปอร์เฉพาะซีรั่มตรวจหาแอนติบอดี เป็น wholespore
enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) เทคนิคการพัฒนา
และเพิ่มประสิทธิภาพในห้องปฏิบัติการของเรา และขึ้นอยู่กับจำนวนของทั้งเซลล์ (
วิธีที่แบคทีเรียใช้เคลือบจานที่ 4 ° C ในชั่วข้ามคืน ( 6 , 20 , 27 )
หรือที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 45 นาที ( 21 ) สปอร์ถูกระงับใน 0.03 M
napo4 บัฟเฟอร์ pH 74 ) ประกอบด้วย 4 % ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) พาราฟอร์มาลดิไฮด์ความเข้มข้น
ประมาณ 106 สปอร์ / มิลลิลิตร แผ่น ( maxisorp ; ขณะนี้ ) เคลือบ
กับ 50  l สปอร์ช่วงล่างต่อแล้วทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง
( เวลาบ่มที่เหมาะสม ) หลังจากที่สามตัวกับฟอสเฟตบัฟเฟอร์
น้ำเกลือ ( PBS ) , จานที่ถูกบล็อกด้วย 1% อัลบูมินและเซรั่ม ( BSA )
PBS เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศาตัวอย่างซีรั่ม จัดการประยุกต์ โดยใช้ชุดเริ่มต้นด้วย 7
( 1 / 40 ) ในสัดส่วนเจือจางความเข้มข้น 0.1 M HCl หรือบัฟเฟอร์ (
[ pH 7.4 % ] 3 [ WT / Vol ] NaCl 0.5% โดยน้ำหนัก / VOL [ ] BSA , 10% [ Vol / Vol ] แกะ
เซรุ่ม [ ซิกม่า ] , 0.1% [ Vol / Vol ] Triton X-100 , 0.05 % [ Vol / Vol ] Tween 20 ) ทุกแผ่นมีซ้ำ
บ่อที่อยู่ preimmune เซรั่มที่เจือจาง
1 / 40จานถูกบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ก่อนที่จะเพิ่มป้องกันเมาส์
IgG และเปอร์ออกซิเดสสารประกอบมะรุม ( Sigma ) ใช้ที่เจือจาง 1:2000 ใน
PBS ที่มี BSA 1% และ 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 จานถูกบ่มสำหรับ
เพิ่มเติม 1 H ที่ 37 ° C ซักสามครั้งใน PBS ที่มี 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20
และพัฒนากับพื้นผิวสำหรับ  5 , 5 ,  - tetramethylbenzidine
( Sigma )ปฏิกิริยาที่ถูกหยุดด้วย 2 M กรดซัลฟิวริก . การวาดเส้นโค้งแต่ละ
ตัวอย่าง และจุดสุดท้ายโดยคำนวณด้วยการเจือจางที่
ผลิตซิกแซ็กเหมือน 1 / 40 การเจือจางของพู preimmune
เซรั่ม การเปรียบเทียบสถิติระหว่างกลุ่มที่ได้ใช้
Mann Whitney U Test เป็นค่า P ของ  0.05 เป็นครั้งสุดท้าย