PCR template preparation procedure

PCR template preparation procedure was simplified by subjecting
the nanoparticle/cell complexes directly to lysis without prior
removal of the magnetic nanoparticles. For binding of DNA to the
same nanoparticles, isopropanol (or ethanol) were added to help
form DNA/nanoparticle complexes [14,23]. As both the enrichment
of urine cells and the adsorption of genomic DNA can be
realized with the same nanoparticles, many residual impurities
and enzyme inhibitors present in the urine or cell lysate can be
readily removed. Further, the adsorbed DNA can be easily eluted
using TE buffer. Electrophoretic analysis demonstrates that the DNA
extracted from both fresh and frozen urine samples contained a
continuous “smear” of various sized fragments ranging from about
100 bp to more than 23 kb (lanes 1 and 2, Fig. 3). DNA extracted by
the phenol–chloroform method displayed similar electrophoretic
patterns of DNA fragments, but with lower yields (lane 3, Fig. 3)
while DNA extracted from whole blood appears as a single distinct
band on the agarose gel (lane 4, Fig. 3).
To investigate the sensitivity of the DNA preparation method, a
214-bp DNA sequence in exon 4B of the K-ras gene for extracted
genomic DNA was amplified, with three different sample volumes
(50, 100 and 200 l) tested by PCR. As shown in Fig. 4, DNA bands
of expected size (∼214 bp) were observed in both urine (lanes
1–4) and blood samples (lane 5). Successful PCR amplification was
detected from as small as 50 l of sample (lane 1), while at least
200 l urine was needed to generate enough PCR templates in
a similar report [25]. This high extraction performance can be
ascribed to the carboxylated surfaces of the nanoparticles, which
bind mammalian cells with a high affinity [14,24,25,35,36], especially
when used with the binding buffer employed in the present
study. The higher surface area:volume ratio and good dispersal
properties inherent to the nanoparticles employed in this study
conferred an advantage over commonly used micro-sized particles,
as evidenced by their superior binding capabilities with mammalian
cells. As expected, the intensities of PCR bands became
stronger with increased sample volume (from 50 to 200 l); for
consistency, a volume of 200 l is recommended for DNA extraction.
The quality of extracted urine DNA was assessed by PCR amplification
of four fragments of different sizes derived from different
genes (Table 1). Specifically, PCR was performed on K-ras, GAPDH,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขั้นตอนการเตรียมต้นแบบ PCR ถูกประยุกต์ ด้วยแล้วก็กดชัตเตอร์
คอมเพล็กซ์ nanoparticle/เซลล์ ตรงการ lysis โดยก่อน
เอาเก็บกักแม่เหล็ก สำหรับการรวมของดีเอ็นเอเพื่อ
เพิ่มเพื่อช่วยเก็บกักเดียว isopropanol (หรือเอทานอล)
แบบดีเอ็น เอ/nanoparticle คอมเพล็กซ์ [14,23] เป็นทั้งโดดเด่น
ของปัสสาวะ ของ genomic DNA และเซลล์สามารถ
รู้ตัวเก็บกักกัน สิ่งสกปรกเหลือหลาย
และเอนไซม์ inhibitors ที่นำเสนอในการปัสสาวะ หรือเซลล์ lysate สามารถ
พร้อมเอา เพิ่มเติม ดีเอ็นเอ adsorbed สามารถได้อย่างง่ายดาย eluted
ใช้บัฟเฟอร์ TE ด้วยการวิเคราะห์แสดงให้เห็นที่ DNA
สกัดจากตัวอย่างปัสสาวะสด และแช่แข็งทั้งสองอยู่
อย่างต่อเนื่อง "เลอะเปื้อน" ต่าง ๆ ของขนาดการกระจายตัวตั้งแต่ประมาณ
100 bp ไปมากกว่า 23 kb (ถนนหนทาง 1 และ 2, Fig. 3) สกัดดีเอ็นเอโดย
phenol–chloroform วิธีการแสดงคล้ายด้วย
รูปแบบ ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ แต่ มีอัตราผลตอบแทนต่ำกว่า (เลน 3, Fig. 3)
ขณะดีเอ็นเอที่สกัดจากเลือดทั้งหมดปรากฏเป็นเดียวหมด
วงบน agarose เจล (เลน 4, Fig. 3) .
เพื่อตรวจสอบความไวของวิธีการเตรียมดีเอ็นเอ การ
214-bp DNA ลำดับใน exon 4B ของยีน K-ras สำหรับสกัด
genomic DNA ถูกขยาย กับปริมาณตัวอย่างที่แตกต่างกันสาม
(50, 100 และ 200 l) ทดสอบ โดย PCR ตามที่แสดงใน Fig. 4 ดีเอ็นเอวง
ขนาดที่คาดไว้ (∼214 bp) สุภัคปัสสาวะทั้งสอง (ถนนหนทาง
1–4) และเลือด (เลน 5) ตัวอย่าง ประสบความสำเร็จขยาย PCR ถูก
พบจากขนาด 50 l ของตัวอย่าง (เลน 1), ในขณะที่น้อย
200 l ปัสสาวะต้องสร้างแม่แบบ PCR พอ
รายงานคล้าย [25] ประสิทธิภาพการสกัดสูงนี้สามารถ
ascribed เพื่อผิว carboxylated ของเก็บกัก ซึ่ง
ผูกยุ่ง [14,24,25,35,36], mammalian เซลล์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง
เมื่อใช้บัฟเฟอร์รวมลูกจ้างในปัจจุบัน
เรียนได้ อัตราส่วนพื้นที่ผิว: ปริมาณสูงและ dispersal ดี
คุณสมบัติโดยธรรมชาติการเก็บกักการจ้างงานในการศึกษานี้
ปรึกษาเปรียบมากกว่าอนุภาคในการขนาดไมโครใช้ทั่วไป,
เป็นหลักฐาน โดยความสามารถเหนือกว่าผูกกับ mammalian
เซลล์ ตามที่คาดไว้ การปลดปล่อยก๊าซของ PCR วงเป็น
แข็งแรงที่ มีปริมาณตัวอย่างเพิ่มขึ้น (จาก 50 ถึง 200 l); สำหรับ
ความสอดคล้อง แนะนำสำหรับการสกัดดีเอ็นเอปริมาตรของ 200 l.
มีประเมินคุณภาพของปัสสาวะแยกดีเอ็นเอ โดยขยาย PCR
ของชิ้นส่วนสี่ของขนาดแตกต่างกันมาจากที่อื่น
ยีน (ตารางที่ 1) โดยเฉพาะ ทำ PCR ตาม K-รา GAPDH

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขั้นตอนการเตรียม PCR เป็นแม่แบบง่ายโดยหนอนบ่อนไส้
คอมเพล็กซ์อนุภาคนาโน / เซลล์โดยตรงกับการสลายโดยไม่ต้องก่อน
การกำจัดอนุภาคนาโนแม่เหล็ก สำหรับผลผูกพันของดีเอ็นเอ
นาโนเดียวกัน isopropanol (หรือเอทานอล) ที่เพิ่มขึ้นจะช่วยให้
รูปแบบที่สลับซับซ้อนดีเอ็นเอ / อนุภาคนาโน [14,23] เป็นทั้งการตกแต่ง
ของเซลล์ปัสสาวะและการดูดซับของดีเอ็นเอที่สามารถ
ตระหนักกับอนุภาคนาโนเดียวกันสิ่งสกปรกที่ตกค้างจำนวนมาก
และสารยับยั้งเอนไซม์ที่มีอยู่ในปัสสาวะหรือเซลล์ lysate สามารถ
ลบออกได้อย่างง่ายดาย นอกจากนี้ดีเอ็นเอดูดซับสามารถชะได้อย่างง่ายดาย
โดยใช้บัฟเฟอร์ TE Electrophoretic วิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าดีเอ็นเอ
ที่สกัดจากตัวอย่างปัสสาวะทั้งสดและแช่แข็งที่มี
"เมีย" อย่างต่อเนื่องของชิ้นส่วนที่มีขนาดต่างๆตั้งแต่ประมาณ
100 bp กว่า 23 กิโลไบต์ (ช่องที่ 1 และ 2 รูปที่ 3.) ดีเอ็นเอที่สกัดได้โดย
วิธีการฟีนอล-คลอโรฟอร์มแสดง electrophoretic คล้าย
รูปแบบของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ แต่ด้วยอัตราผลตอบแทนที่ต่ำกว่า (ช่อง 3, รูปที่ 3.)
ในขณะที่ดีเอ็นเอที่สกัดจากเลือดจะปรากฏเป็นที่แตกต่างเดียว
กับวงเจล agarose (ช่อง 4, รูปที่ 3)
เพื่อศึกษาความไวของวิธีการเตรียมดีเอ็นเอ
ลำดับดีเอ็นเอ 214-bp ในเอกซ์ซอน 4B ของยีน K-ras เพื่อสกัด
ดีเอ็นเอถูกขยายด้วยสามเล่มที่แตกต่างกันของกลุ่มตัวอย่าง
(50, 100 และ 200 ลิตร) ผ่านการทดสอบ โดยวิธี PCR ดังแสดงในรูปที่ 4 แถบดีเอ็นเอ
ที่มีขนาดที่คาดหวัง (~ 214 bp) พบในปัสสาวะทั้งสอง (ช่อง
1-4) และตัวอย่างเลือด (ช่อง 5) ที่ประสบความสำเร็จขยาย PCR ถูก
ตรวจพบจากขนาดเล็กเป็น 50? ลิตรตัวอย่าง (ช่องที่ 1) ในขณะที่อย่างน้อย
ปัสสาวะ 200 ลิตรเป็นสิ่งที่จำเป็นในการสร้างแม่แบบ PCR เพียงพอใน
รายงานที่คล้ายกัน [25] ประสิทธิภาพการสกัดสูงนี้สามารถ
กำหนดพื้นผิวของอนุภาคนาโน carboxylated ซึ่ง
ผูกเซลล์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีความสัมพันธ์ที่สูง [14,24,25,35,36] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง
เมื่อใช้กับบัฟเฟอร์ที่มีผลผูกพันลูกจ้างในปัจจุบัน
การศึกษา พื้นที่ผิวสูงกว่าอัตราส่วนปริมาณและการกระจายที่ดี
คุณสมบัติโดยธรรมชาติที่จะอนุภาคนาโนที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้
การประชุมได้เปรียบกว่าที่ใช้กันทั่วไปอนุภาคขนาดไมโคร,
เป็นหลักฐานโดยความสามารถในการผูกพันของพวกเขาเหนือกว่าด้วยเลี้ยงลูกด้วยนม
เซลล์ คาดว่าจะเป็นความเข้มของวง PCR กลายเป็น
ที่แข็งแกร่งกับปริมาณที่เพิ่มขึ้นของกลุ่มตัวอย่าง (50-200 ลิตร?); เพื่อ
? ความสอดคล้องปริมาณ 200 ลิตรเหมาะสำหรับการสกัดดีเอ็นเอ
คุณภาพของดีเอ็นเอที่สกัดปัสสาวะได้รับการประเมินจากการขยาย PCR
ของ สี่ชิ้นส่วนของขนาดที่แตกต่างกันมาจากที่แตกต่างกัน
ของยีน (ตารางที่ 1) โดยเฉพาะวิธี PCR ได้รับการดำเนินการเกี่ยวกับ K-ras, gapdh,

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เทคนิคการเตรียมขั้นตอนง่ายแม่แบบโดย subjecting
/ เซลล์เชิงซ้อนสำหรับโดยตรงโดยไม่ต้องลบก่อนการสลาย
ของอนุภาคนาโนแม่เหล็ก ผูกพันของดีเอ็นเอ
นาโนเหมือนกัน ไอโซโพรพานอล ( หรือเอทานอล ) ถูกเพิ่มเพื่อช่วย
รูปแบบดีเอ็นเอ / สำหรับเชิงซ้อน [ 14,23 ] เป็นทั้งการ
เซลล์ปัสสาวะและการดูดซับของ genomic DNA สามารถ
ตระหนักกับอนุภาคเดียวกันหลายตกค้างสิ่งสกปรก
และตัวยับยั้งเอนไซม์ที่มีอยู่ในปัสสาวะหรือเซลล์ lysate สามารถ
พร้อมออก เพิ่มเติม เนื่องจากดีเอ็นเอสามารถได้อย่างง่ายดายตัวอย่าง
ใช้ TE buffer รูปแบบการวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าดีเอ็นเอที่สกัดได้จากทั้งสดและแช่แข็ง

ตัวอย่างปัสสาวะที่มีอยู่อย่างต่อเนื่อง " ละเลง " ของชิ้นส่วนต่าง ๆตั้งแต่เรื่อง
ขนาด100 BP มากกว่า 23 KB ( ช่องที่ 1 และ 2 รูปที่ 3 ) ดีเอ็นเอที่สกัดด้วยคลอโรฟอร์มวิธีฟีนอล )

รูปแบบคล้ายกัน electrophoretic แสดงชิ้นส่วนดีเอ็นเอ แต่ผลตอบแทนที่ลดลง ( ช่อง 3 , รูปที่ 3 )
ในขณะที่สกัดออกมาจากเลือดทั้งหมดจะปรากฏเป็นวงเดียวที่แตกต่างกัน
บนเจล ( ลู่ที่ 4 รูปที่ 3 ) .
เพื่อศึกษาความไวของการเตรียมดีเอ็นเอ วิธีการ ,
214 BP ดีเอ็นเอลำดับใน exon 4B ของยีนตามลำดับสำหรับสกัดดีเอ็นเอคือ
ขยายกับ 3 ชุดตัวอย่างที่แตกต่างกัน
( 50 , 100 และ 200  L ) ทดสอบโดย PCR ดังแสดงในรูปที่ 4 แถบดีเอ็นเอ
คาดว่าขนาด ( ∼ 214 BP ) พบในปัสสาวะ ( เลน
1 – 4 ) และเลือด ( ช่องที่ 5 ) การขยาย PCR ที่ประสบความสำเร็จคือ
ตรวจพบจากขนาดเล็กเป็น 50  l ตัวอย่าง ( ช่องที่ 1 ) , ในขณะที่อย่างน้อย
200  ผมปัสสาวะจำเป็นเพื่อสร้างพอเทคนิคแม่แบบใน
คล้ายกับรายงาน [ 25 ] ประสิทธิภาพการสกัดสูงนี้สามารถ
ascribed ไป carboxylated พื้นผิวของอนุภาคนาโนซึ่ง
ผูก mammalian เซลล์ที่มีความสามารถสูง 14,24,25,35,36
[ ] , โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้กับบัฟเฟอร์ที่ใช้ในการศึกษา

ยิ่งพื้นที่ผิวปริมาตรกระจาย
: ดีคุณสมบัติที่แท้จริงกับอนุภาคนาโนที่ใช้ในการศึกษา
) ได้เปรียบที่ใช้ไมโครขนาดอนุภาค ,
เป็นหลักฐานโดยความสามารถที่เหนือกว่าผูกพัน
mammalian เซลล์ เป็นที่คาดหวัง , ความเข้มของ PCR วงกลายเป็น
แข็งแกร่งกับการเพิ่มขึ้นของปริมาณตัวอย่าง ( 50 ถึง 200  L ) ;
ความสอดคล้อง ปริมาณ 200  ผมแนะนำสำหรับการสกัดดีเอ็นเอ .
คุณภาพของการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธี PCR ตรวจประเมิน (
4 ชิ้นขนาดต่างๆที่ได้จากยีนแตกต่างกัน
( ตารางที่ 1 ) โดยเฉพาะ โดยมีการ gapdh ตามลำดับ , ,