PBMCs are re-suspended in RPMI -10%

PBMCs are re-suspended in RPMI -10% (or RPMI -0 if RPMI -20% was used to prepare the antigen plates) and should not sit for more than one hour at room temperature. Do not place the cells on ice.
5.22.6. Count ≥300 cells for white blood count and ≥100 cells for viability. Adjust PBMC concentration to 1x106 viable cells/mL for dispensing into culture wells. For Pediatric protocols, some wells may be omitted if not enough PBMCs are obtained; follow guidelines in the protocol or the PIIS.
6. ASSAY SETUP
6.1.1. Thaw antigen/mitogen culture plates at 37°C in an incubator. Label the tissue culture plate with patient identification (PID), date plated, date to be pulsed with isotope and harvested.
6.1.2. Dispense 100μL of the PBMC suspension (106 cells/mL or 100,000 cells per well) into culture wells. Be certain to keep cells suspended, by gentle mixing, while the cells are being dispensed. Cells should be dispensed as soon as possible in order to avoid the medium becoming alkaline. This is day 0. It may be necessary to store LPA plates in bags inside the incubator if lack of humidity is a problem.
7. HARVESTING AND COUNTING
7.1. On the morning of day 6, pulse plates with 25μL/well (1μCi/well) of [H3]TdR.
7.2. After six hours, harvest on glass fiber filters using a cell harvester. If the cell harvester is not in a biohazard hood or splashing during harvesting is a concern, then add 25μL/well of a 5% Triton X-100 detergent solution to inactivate HIV. If harvesting can not be done immediately after the six-hour pulse, plates may be stored at –20°C until harvesting. Do not store plates at –20°C for more than a few days. Do not add Triton X-100 to plates prior to freezing because it causes bubbles during thawing.
7.3. After harvesting, filters are allowed to dry at room temperature on the bench top, punched-out into scintillation vials, or the filter sheets are processed for counting in a betaplate counter. Add scintillation fluid to vials/filters and leave filters in scintillation fluid according to the manufacturer’s directions prior to counting. Count vials/filters on a beta scintillation counter at laboratory-determined settings to measure counts per minute (cpm).
8. CALCULATIONS AND REPORTING OF RESULTS
8.1. LPA data can be expressed and calculated in two different ways following determination of mean values (e.g. from triplicates, quadruplicates); both methods make biological sense. Because the stimulation index (SI) is a ratio, it is greatly influenced by biologically insignificant variations in the low cpm levels of background, unstimulated wells.
8.2. SI = (cpm experimental/ cpm background unstimulated)
8.3. Net counts or cpm = (cpm experimental - cpm background unstimulated)
8.4. For multicenter trials, agreement is slightly better if the SI calculation is used, since the efficiency of counting of different scintillation counters varies. Raw data (cpm) from each culture well shall be entered electronically onto Excel®-based

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เป็นอีกครั้งที่แขวนลอยใน PBMCs RPMI - 10% ( หรือ RPMI - 0 ถ้า RPMI - 20% ใช้เตรียมแอนติเจนจาน ) และไม่ควรนั่งนานกว่า 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง อย่าวางเซลล์บนน้ำแข็ง
5.22.6 . นับเซลล์เม็ดเลือดขาว≥ 300 และ 100 เซลล์≥สำหรับปลากะพงขาว 2 1x106 ปรับความเข้มข้นได้เซลล์ / มล. สำหรับการลงในบ่อเพาะเลี้ยง สำหรับวิธีเด็กบางหลุมอาจจะละเว้น หากนำไปตรวจไม่เพียงพอจะได้รับ ตามแนวทางในโพรโทคอล หรือ piis .
6 วิธีติดตั้ง
และ . ละลายแอนติเจน / วัฒนธรรมที่ปรากฎแผ่น 37 °องศาเซลเซียสในตู้อบ ป้ายทะเบียนด้วยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อผู้ป่วย ( PID ) , วันที่ , ชุบอาจเป็นพัลกับไอโซโทปและเก็บเกี่ยว .
ร . จ่าย 100 μ L ของขาว ช่วงล่าง ( 106 เซลล์ / มิลลิลิตร หรือ 100000 เซลล์ต่อด้วย ) ลงในบ่อเพาะเลี้ยง เป็นบางอย่างเพื่อให้เซลล์ที่ถูกระงับโดยอ่อนโยนผสมในขณะที่เซลล์ที่ถูกจ่าย เซลล์ที่ควรจะจ่ายให้เร็วที่สุดเพื่อหลีกเลี่ยงอาหารที่เป็นด่าง นี่คือวัน 0 มันอาจจะจำเป็นต้องเก็บในถุงภายในตู้อบแผ่น LPA ถ้าไม่มีความชื้นเป็นปัญหา .
7 การเก็บเกี่ยวและนับ
7.1 . ในช่วงเช้าของวันที่ 6ชีพจรแผ่น 25 μ L / ดี ( 1 μ CI / ดี ) [ H3 ] TDR .
7.2 . หลังจาก 6 ชั่วโมง , การเก็บเกี่ยวบนใยแก้วกรองโดยใช้เซลล์เก็บเกี่ยว . ถ้าเซลล์ต่างๆ ไม่ใช่ใน Biohazard ฮูดหรือสาด ในการเก็บเกี่ยวเป็นกังวล แล้วเพิ่ม 25 μ L / ดีของ 5% สารละลาย Triton X-100 ผงซักฟอกเพื่อยับยั้งโรคเอดส์ ถ้าวิกฤติ ไม่สามารถทำได้ทันที หลังจากหกชั่วโมง ชีพจรแผ่นอาจจะถูกเก็บไว้ที่ 20 –° C จนถึงการเก็บเกี่ยว ไม่เก็บจานที่ 20 –° C มากกว่าไม่กี่วัน อย่าใส่ Triton X-100 ที่จานก่อนที่จะหนาว เพราะมันทำให้เกิดฟองอากาศในการละลาย
7.3 . หลังการเก็บเกี่ยว ตัวกรองจะอนุญาตให้แห้งที่อุณหภูมิห้องบนม้านั่งด้านบน เจาะออกมาเป็นหลอดแสง หรือแผ่นกรองมีการประมวลผลสำหรับการนับใน betaplate เคาน์เตอร์เพิ่มข้อมูลเพื่อกรองของเหลวและกรองแสงจากหลอด / ในของเหลว ตามทิศทางของผู้ผลิตก่อนที่จะนับ นับขวดกรองบนเคาน์เตอร์ที่ระบุการตั้งค่าห้องปฏิบัติการเบต้าข้อมูลการวัดครั้งต่อนาที ( CPM )
8 การคำนวณและการรายงานผล
1 .ข้อมูล LPA สามารถแสดงและคำนวณด้วยวิธีที่แตกต่างกันตามการกำหนดหมายความว่าค่า ( เช่น ล้อม quadruplicates , ) ; ทั้งสองวิธีทำให้ความรู้สึกทางชีวภาพ เพราะดัชนีการกระตุ้น ( SI ) คือ อัตราส่วน เป็นอิทธิพลอย่างมากโดยไม่ได้ การเปลี่ยนแปลงในระดับต่ำ CPM ของพื้นหลัง , บ่อ unstimulated .
8.2 .จังหวัด = ( CPM ทดลอง / CPM พื้นหลัง unstimulated )
8.3 นับสุทธิหรือ CPM = ( CPM ทดลอง - CPM พื้นหลัง unstimulated )
4 . สำหรับการทดลองสห ข้อตกลงจะดีขึ้นเล็กน้อยถ้าศรีการคำนวณที่ใช้ เนื่องจากประสิทธิภาพของการนับของเคาน์เตอร์ข้อมูลแตกต่างกันไป ข้อมูลดิบ ( CPM ) จากแต่ละวัฒนธรรมก็จะถูกป้อนไปยัง Excel ® - พื้นฐานทางอิเล็กทรอนิกส์