Immunofluorescence stainingFor in vi

Immunofluorescence staining

For in vivo BrdU incorporation, floating sections (30 m), prepared as described above, were incubated in 50% form- amide/50% SSC buffer (0.3 M NaCl/0.03 M sodium citrate) at 65°C for 2 h. The sections were then rinsed in SSC and incubated in 2N HCl for 30 min at 37°C. The sections were blocked with 5% serum for 1 h, then incubated with primary antibodies against BrdU (at 1:600 dilutions, GeneTex, Inc., San Antonio, TX, USA) overnight at 4°C, followed by second- ary antibody anti-rat ALEXA FLUOR 488 (1:400, Invitrogen- Molecular Probes) for 2 h. Sections were rinsed, transferred on slides, and cover slipped in an antifading agent (Gel/ mount; Biomeda, Foster City, CA, USA). Fluorescent signals were detected with a confocal microscope (NIKON E-2000).

For phenotypic differentiation of BrdU incorporated cells, the sections were incubated with a primary antibody mixture containing antibodies against BrdU, glial fibrillary acidic protein (GFAP),and neuronal nuclei-specific protein (NeuN, 1:300, Chemicon International, Temecula, CA, USA) over- night at 4°C, followed by incubation with secondary antibod- ies. For double labeling of A oligomers and BrdU incorpo- ration, the sections were incubated with a primary antibody mixture containing antibodies against BrdU and A oli- gomers (A11, 1:500, Biosource Inc., Camarillo, CA, USA), followed by incubation with secondary antibodies for 2 h. For double immunostaining for A and phospho-CREB, the sections were incubated with primary antibodies to human amyloid beta (6E10) and to phosphorylated CREB (1:500, Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY, USA). The second- ary antibodies are anti-mouse ALEXA FLUOR 488 for A and anti-rabbit ALEXA FLUOR 594 for pCREB

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ย้อมสี Immunofluorescenceสำหรับในสัตว์ทดลอง BrdU ประสาน ส่วน floating (30 เมตร), เตรียมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น มี incubated ในบัฟเฟอร์ SSC amide/50% แบบฟอร์ม 50% (0.3 M NaCl/0.03 M โซเดียมซิเตรต) ที่ 65° C สำหรับ 2 h ส่วนแล้ว rinsed ใน SSC และ incubated ใน 2N HCl ใน 30 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียส ส่วนถูกบล็อค ด้วยเซรั่ม 5% สำหรับ 1 h แล้ว incubated กับแอนตี้หลักต่อ BrdU (ที่ 1:600 dilutions, GeneTex, Inc., San Antonio, TX สหรัฐอเมริกา) ค้างคืนที่ 4 ° C ตาม ด้วยสอง - ary แอนติบอดีป้องกันหนู 488 FLUOR ALEXA (1: 400, Invitrogen - โมเลกุล Probes) สำหรับส่วน 2 h. ถูก rinsed โอนย้ายบนภาพนิ่ง และครอบคลุมที่เล็ดรอดในตัวแทน antifading (เจ / เมา Biomeda เมืองฟอสเตอร์ CA, USA) สัญญาณฟลูออเรสตรวจพบ ด้วยกล้องจุลทรรศน์ confocal (NIKON E-2000)สำหรับสร้างความแตกต่างไทป์ของเซลล์ BrdU รวม ส่วนมี incubated ด้วยส่วนผสมหลักแอนติบอดีที่ประกอบด้วยแอนตี้ BrdU, glial fibrillary กรดโปรตีน (GFAP), และโปรตีน neuronal แอลฟา-specific (NeuN, 1:300, Chemicon อินเตอร์เนชั่นแนล เต CA, USA) กว่าคืนที่ 4 ° C ตาม ด้วยการบ่มกับ ies antibod รอง สำหรับคู่ติดฉลากมี oligomers และ BrdU incorpo-อาหาร ส่วนมี incubated ด้วยส่วนผสมหลักแอนติบอดีที่ประกอบด้วยแอนตี้ BrdU และ oli-gomers (A11, 1: 500, Biosource Inc., Camarillo, CA, USA), ไปมาแล้ว โดยคณะทันตแพทยศาสตร์กับแอนตี้รองสำหรับ 2 h สำหรับ immunostaining คู่สำหรับ A และ phospho-CREB ส่วนถูก incubated กับแอนตี้หลักการมนุษย์แอมีลอยด์บีตา (6E10) และกับ phosphorylated CREB (1: 500 เซลล์ตามปกติโซลูชั่น เลคเพลซิด NY สหรัฐอเมริกา) ที่สอง - ary แอนตี้ 488 FLUOR ALEXA ป้องกันเมาส์สำหรับ A และป้องกันกระต่าย ALEXA FLUOR 594 สำหรับ pCREB

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Immuno ชั้นย้อมสี uorescence สำหรับในร่างกายรวมตัว BrdU ส่วน oating ชั้น (30 เมตร) ที่จัดทำตามที่อธิบายไว้ข้างต้นถูกบ่มใน 50% form- เอไมด์ / 50% บัฟเฟอร์ SSC (0.3 M NaCl / 0.03 M โซเดียมซิเตรต) ที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมง . ส่วนที่ได้รับการล้างแล้วใน SSC และบ่มใน 2N HCl เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ส่วนนี้ถูกปิดกั้นด้วยเซรั่ม 5% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง, บ่มแล้วกับแอนติบอดีหลักกับ BrdU (1: 600 เจือจาง, GeneTex, Inc, ซานอันโตนิโอ, เท็กซัสสหรัฐอเมริกา) ค้างคืนที่ 4 ° C ตามด้วยสองแอนติบอดี Ary ต่อต้านหนู ALEXA FLUOR 488 (1: 400, Invitrogen- วัดระดับโมเลกุล) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ส่วนที่ถูกล้างย้ายในภาพนิ่งและฝาครอบเล็ดรอดในตัวแทน antifading (เจล / ติด; Biomeda, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) สัญญาณเรืองแสงถูกตรวจพบด้วยกล้องจุลทรรศน์ confocal (NIKON E-2000). สำหรับความแตกต่างของฟีโนไทป์ของ BrdU นิติบุคคลที่จัดตั้งขึ้นเซลล์ส่วนที่ถูกบ่มที่มีส่วนผสมแอนติบอดีหลักที่มีแอนติบอดีต่อ BrdU, glial สาย brillary โปรตีนที่เป็นกรด (GFAP) และนิวเคลียส-speci ประสาทสายค โปรตีน (NeuN, 1: 300, Chemicon นานาชาติ Temecula, CA, USA) คืนเกินที่ 4 ° C ตามด้วยการบ่มด้วยโอบอุ้ม antibod- รอง สำหรับการติดฉลากคู่ oligomers และปันส่วน BrdU incorpo- ส่วนที่ถูกบ่มที่มีส่วนผสมหลักที่มีแอนติบอดีแอนติบอดีต่อ BrdU และ A gomers oli- (A11, 1: 500, Biosource อิงค์แคมาริลโล, CA, USA) ตามมาด้วย บ่มที่มีแอนติบอดี้ที่สองเป็นเวลา 2 ชั่วโมง สำหรับ immunostaining คู่สำหรับ A และ phospho-CREB ส่วนที่ถูกบ่มกับแอนติบอดีหลักเบต้า amyloid มนุษย์ (6E10) และ CREB phosphorylated (1: 500, มือถือส่งสัญญาณ Solutions, Lake Placid, นิวยอร์ก, สหรัฐอเมริกา) แอนติบอดีทุติยภูมิต่อต้านเมาส์ ALEXA FLUOR 488 สำหรับ A และต่อต้านกระต่าย ALEXA FLUOR 594 สำหรับ pCREB

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

มมูโนfl uorescence คราบ

ในสัตว์ทดลอง brdu นิติบุคคล fl oating ส่วน ( 30 เมตร ) เตรียมตามที่อธิบายไว้ข้างต้น คือ บ่มใน 50% และ 50% - แบบฟอร์ม / SSC บัฟเฟอร์ ( 0.3 M NaCl / 0.03 M โซเดียมซิเตรต ) ที่อุณหภูมิ 65 องศา C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ส่วน แล้วล้างใน SSC โดยใน 2 นอร์มัลสำหรับ 30 นาทีที่ 37 องศา ส่วนที่ถูกบล็อกด้วยเซรั่ม 5 % เป็นเวลา 1 ชั่วโมงแล้วบ่มด้วยแอนติบอดีประถมกับ brdu ( ที่ 1:600 เจือจาง genetex , Inc . , San Antonio , TX , USA ) ค้างคืนที่ 4 ° C , ตามมาด้วยที่สองเกี่ยวกับแอนติบอดีต่อต้านหนู Alexa Fluor 488 ( 1 : 400 Invitrogen , - โมเลกุลโพรบ ) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง บางส่วนถูกล้าง ย้ายบนสไลด์ และครอบคลุมลื่นใน antifading ตัวแทน ( เจล / ภูเขา biomeda ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกาสัญญาณที่ตรวจพบด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงด้วย ( Nikon e-2000 )

สำหรับคุณสมบัติของการ brdu รวมเซลล์ ส่วนที่ถูกบ่มด้วยส่วนผสมหลักจากที่มีแอนติบอดีต่อ brdu glial จึง brillary , กรดโปรตีน ( gfap ) และการถ่ายทอดของกาอึน 1:300 โปรตีน C ( , chemicon Temecula , CA , นานาชาติ สหรัฐอเมริกา ) - คืนที่ 4 ° Cตามด้วยการบ่มเพาะกับรอง antibod - IES . สองเท่าของหน่วย และการติดฉลาก brdu incorpo - ปันส่วน , ส่วนที่ถูกบ่มด้วยส่วนผสมหลักจากที่มีแอนติบอดีต่อ brdu และโอลี่ - gomers ( 1 : 500 biosource A11 , Inc , Camarillo , CA , USA ) , ตามด้วยการบ่มด้วยแอนติบอดีมัธยมเป็นเวลา 2 ชั่วโมง สำหรับคู่ immunostaining สำหรับ phospho creb และ ,ส่วนที่ถูกบ่มกับแอนติบอดีหลักบีตามนุษย์ ( 6e10 ) และฟอสฟอรีเลเตต creb ( 1 : 500 สัญญาณมือถือ , โซลูชั่น , Lake Placid , NY , USA ) 2 เกี่ยวกับแอนติบอดีจะ anti เมาส์ Alexa Fluor 488 สำหรับป้องกันกระต่าย Alexa Fluor 594 สำหรับ pcreb