preinduced exponential growth and e

preinduced exponential growth and early stationary phase. The poorly characterized pBBR1
origin (present in pBAD35) is shown here to be present at low copy numbers (~5), similar to
that of the pACYC origin during exponential growth. As expected, the pBAD18 construct
was shown to have an intermediate copy number. BTE copy numbers relative to ompA
increased in early stationary phase for all vectors except pBAD35, which showed no change.
This is likely because of the presence of multiple replication forks on the chromosome
during rapid growth (Nordström and Dasgupta, 2006), or the onset of nutrient limitations in
the medium that stop replication from oriC while replication continues from many plasmid
origins (Friehs, 2004). The plasmids expressing BTE-H204A all displayed lower copy
numbers during stationary phase than the corresponding plasmids expressing BTE, possibly
as a result of increased cell lysis in these induced cultures. Variation in the lysis of whole
cell templates has been previously implicated as a source of error in determining plasmid
copy numbers by qPCR (Providenti et al., 2006). Consistent with this hypothesis, no
discrepancy in copy number was observed between plasmids harboring BTE and BTEH204A
during exponential growth prior to induction.
To determine whether copy number correlated with fatty acid production, total fatty acids
were extracted and derivatized for analysis by GC/MS after 23 h (Fig. 3). In strains
expressing functional BTE, the predominant fatty acid chain length shifted dramatically
from C16 to C12, with C12 fatty acids accounting for up to 75% of the total fatty acid
composition. For the culture expressing pBAD33-BTE, approximately 15% of C12 and 59%
of C14 fatty acids were unsaturated. Lower but significant levels of hydroxylated C12, an
intermediate in the fatty acid elongation cycle, were also observed but not quantified in
functional BTE-expressing strains (Supplementary Fig. 3). Of the functional BTEexpressing
plasmids, the lowest titer (0.25 ± 0.01 g L−1) was observed from the highest copy
number plasmid, pBAD34-BTE. The two plasmids with the lowest overall copy number in
both exponential and early stationary phase, pBAD33-BTE and pBAD35-BTE, accumulated
the highest titers of fatty acids (0.54 ± 0.00 and 0.48 ± 0.00 g L–1, respectively), with
medium copy number plasmid pBAD18-BTE accumulating a slightly lower quantity (0.40 ±
0.03 g L−1). Strains harboring a nonfunctional BTE gene on the various plasmids
accumulated similar quantities of predominantly C16 fatty acids, as expected.
It can therefore be concluded that expression of BTE on a low copy number plasmid results
in optimal fatty acid production. One possible explanation is that higher quantities of
functional thioesterase are produced from the high copy number plasmids, resulting in an
initially rapid rate of accumulation of medium-chain free fatty acids. As there is no known
protein-mediated export mechanism for free fatty acids, they likely pass across the inner
membrane via a transmembrane flip (Black and DiRusso, 2003). Dodecanoic acid, the
dominant BTE product, has a much higher water solubility than longer chain fatty acids
(Vorum et al., 1992) and can possibly cross the outer membrane through porins (Hearn et
al., 2009). A very rapid accumulation of C12 and C14 free fatty acids in the inner membrane
may disrupt the membrane integrity and result in cell lysis. A second possible explanation is
that higher quantities of functional thioesterase significantly deplete C12 and C14 acyl-ACPs
destined for membrane phospholipid incorporation, resulting in a reduced number of viable
cells.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

preinduced เรขาและระยะแรก ๆ เครื่องเขียน PBBR1 งาน characterizedจุดเริ่มต้น (อยู่ใน pBAD35) จะแสดงที่นี่จะอยู่ในต่ำสำเนาหมายเลข (~ 5), เหมือนกับที่จุดเริ่มต้นของ pACYC ระหว่างเรขา ตามที่คาดไว้ pBAD18 สร้างที่แสดงให้มีหมายเลขสำเนากลาง หมายเลขสำเนา BTE สัมพันธ์ ompAเพิ่มขึ้นในระยะแรก ๆ เครื่องเขียนสำหรับเวกเตอร์ทั้งหมดยกเว้น pBAD35 ซึ่งแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงไม่จะมีโอกาส เพราะสถานะของส้อมจำลองหลายบนโครโมโซมในระหว่างการเจริญเติบโตอย่างรวดเร็ว (Nordström และ Dasgupta, 2006), หรือเริ่มมีอาการของข้อจำกัดของธาตุอาหารในสื่อที่จำลองแบบจาก oriC ขณะจำลองหยุดต่อจาก plasmid มากจุดเริ่มต้น (Friehs, 2004) Plasmids แสดง BTE H204A ล่างสำเนาแสดงทั้งหมดหมายเลขประจำระยะกว่า plasmids ตรงที่แสดง BTE อาจจะจากเซลล์เพิ่มการ lysis ในวัฒนธรรมเหล่านี้อาจ ความผันแปรในการ lysis ของทั้งหมดเซลล์ต้นแบบได้รับก่อนหน้านี้อู๊ดเป็นแหล่งของข้อผิดพลาดในการกำหนด plasmidคัดลอกหมายเลข โดย qPCR (Providenti และ al., 2006) สอดคล้องกับสมมติฐานนี้ ไม่ความขัดแย้งในจำนวนของสำเนาที่สังเกตระหว่าง plasmids harboring BTE และ BTEH204Aระหว่างเรขาก่อนเหนี่ยวนำเพื่อตรวจสอบว่า หมายเลขสำเนา correlated ผลิตกรดไขมัน กรดไขมันทั้งหมดสกัด และ derivatized สำหรับการวิเคราะห์ ด้วย GC/MS หลัง 23 h (Fig. 3) ในสายพันธุ์แสดงหน้าที่ BTE กันกรดไขมันโซ่ยาวเปลี่ยนอย่างมากจาก C16 กับ C12 กับกรดไขมัน C12 บัญชีถึง 75% ของกรดไขมันทั้งหมดบทประพันธ์ สำหรับวัฒนธรรมการแสดง pBAD33-BTE ประมาณ 59% และ 15% ของ C12ของ C14 กรดไขมันได้ในระดับที่สม ต่ำแต่ระดับสำคัญของ hydroxylated C12 การกลางในรอบ elongation กรดไขมัน ยัง สังเกต แต่ไม่ quantified ในหน้าที่แสดง BTE สายพันธุ์ (เสริม Fig. 3) ของ BTEexpressing ทำงานplasmids, titer ต่ำ (0.25 ± 0.01 g L−1) ถูกตรวจสอบจากสำเนาสูงสุดplasmid หมายเลข pBAD34 BTE Plasmids สอง มีหมายเลขสำเนาโดยรวมต่ำสุดในเนน และช่วงระยะเครื่องเขียน pBAD33 BTE และ pBAD35-BTE สะสมtiters ที่สูงสุดของกรดไขมัน (±± 0.00 และ 0.48 0.54 0.00 g L – 1 ตามลำดับ), มีสำเนากลางหมายเลข plasmid pBAD18-BTE สะสมปริมาณต่ำกว่าเล็กน้อย (0.40 ±0.03 กรัม L−1) สายพันธุ์ harboring เป็นยีน BTE nonfunctional อาจบน plasmids ต่าง ๆสะสมปริมาณคล้ายเป็น C16 กรดไขมัน ตามที่คาดไว้มันสามารถดังนั้นจึงสรุปได้ว่า นิพจน์ BTE แบบต่ำสำเนาหมายเลข plasmid ผลในการผลิตกรดไขมันดีที่สุด หนึ่งได้อธิบายว่าปริมาณสูงthioesterase ทำงานที่ผลิตจากสูงสำเนาหมายเลข plasmids ในการอัตราเริ่มต้นอย่างรวดเร็วของการสะสมของกรดไขมันห่วงโซ่ขนาดกลางฟรี เนื่องจากมีเป็นไม่รู้จักกันกลไกส่ง mediated โปรตีนกรดไขมันอิสระ พวกเขาจะผ่านตรงข้ามภายในเมมเบรนผ่านพลิก transmembrane (สีดำและ DiRusso, 2003) กรด Dodecanoic การหลักผลิตภัณฑ์ BTE มีการมากขึ้นน้ำละลายกว่ากรดไขมันโซ่ยาว(Vorum et al., 1992) และอาจสามารถข้ามเยื่อหุ้มภายนอกผ่าน porins (Hearn ร้อยเอ็ดal., 2009) สะสมอย่างรวดเร็วมากของ C12 และ C14 ฟรีกรดไขมันในเยื่อภายในอาจรบกวนเยื่อความสมบูรณ์ และส่งผลให้เซลล์ lysis เป็นคำอธิบายที่เป็นไปได้ที่สองที่ปริมาณสูงของ thioesterase ทำงานอย่างมีนัยสำคัญทำ C12 และ C14 acyl ACPsกำหนดสำหรับเยื่อประสานฟอสโฟลิพิด ผลในการลดจำนวนได้เซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

preinduced การเจริญเติบโตและเฟสต้น ลักษณะไม่ดี pBBR1
ต้นกำเนิด (ปัจจุบันใน pBAD35) จะแสดงที่นี่จะอยู่ที่ตัวเลขสำเนาต่ำ (~ 5)
คล้ายกับที่ของแหล่งกำเนิดpACYC ในช่วงการเจริญเติบโต เป็นที่คาดหวังสร้าง pBAD18
แสดงให้เห็นว่ามีจำนวนสำเนากลาง BTE สำเนาตัวเลขที่สัมพันธ์กับ OMPA
ที่เพิ่มขึ้นในเฟสต้นสำหรับเวกเตอร์ทั้งหมดยกเว้น pBAD35 ซึ่งแสดงให้เห็นไม่มีการเปลี่ยนแปลง.
นี้น่าจะเป็นเพราะการปรากฏตัวของส้อมจำลองแบบหลายบนโครโมโซมในระหว่างการเจริญเติบโตอย่างรวดเร็ว (Nordströmและ Dasgupta, 2006) หรือการโจมตี ข้อ จำกัด ของสารอาหารในกลางที่หยุดการจำลองแบบจากoriC ในขณะที่ยังคงการจำลองแบบจากพลาสมิดหลายต้นกำเนิด(Friehs, 2004) พลาสมิดแสดง BTE-H204A ทั้งหมดที่แสดงสำเนาที่ต่ำกว่าตัวเลขในช่วงนิ่งกว่าพลาสมิดที่สอดคล้องกันแสดงBTE อาจจะเป็นผลจากการสลายเซลล์ที่เพิ่มขึ้นในการชักนำให้เกิดวัฒนธรรมเหล่านี้ การเปลี่ยนแปลงในสลายของทั้งเซลล์แม่ได้รับการที่เกี่ยวข้องก่อนหน้านี้เป็นแหล่งที่มาของข้อผิดพลาดในการกำหนดพลาสมิดคัดลอกหมายเลขโดยqPCR (Providenti et al., 2006) สอดคล้องกับสมมติฐานนี้ไม่มีความแตกต่างในหลายสำเนาถูกพบระหว่างพลาสมิดเก็บงำ BTE และ BTEH204A ในช่วงการเจริญเติบโตชี้แจงก่อนที่จะเหนี่ยวนำ. การตรวจสอบว่าจำนวนสำเนามีความสัมพันธ์กับการผลิตกรดไขมันกรดไขมันทั้งหมดถูกสกัดและ derivatized สำหรับการวิเคราะห์โดย GC / MS หลังจาก 23 ชั่วโมง (รูปที่. 3) ในสายพันธุ์ที่แสดง BTE ทำงานความยาวของกรดไขมันห่วงโซ่เด่นขยับขึ้นอย่างมากจากC16 C12 ไปด้วยกรดไขมัน C12 คิดเป็นถึง 75% ของกรดไขมันทั้งหมดองค์ประกอบ สำหรับการแสดงวัฒนธรรม pBAD33-BTE ประมาณ 15% ของ C12 และ 59% ของ C14 กรดไขมันไม่อิ่มตัวเป็น แต่ต่ำกว่าระดับที่มีนัยสำคัญของ hydroxylated C12 เป็นสื่อกลางในวงจรการยืดตัวของกรดไขมันที่ยังพบได้แต่ไม่วัดในสายพันธุ์ที่ BTE-แสดงการทำงาน (เสริมรูปที่. 3) ของการทำงาน BTEexpressing พลาสมิด, titer ต่ำที่สุด (0.25 ± 0.01 กรัม L-1) เป็นที่สังเกตจากสำเนาสูงสุดพลาสมิดจำนวนpBAD34-BTE ทั้งสองพลาสมิดที่มีจำนวนสำเนาโดยรวมต่ำที่สุดในทั้งสองเฟสชี้แจงและต้น pBAD33-BTE และ pBAD35-BTE สะสม titers สูงสุดของกรดไขมัน (0.54 ± 0.00 และ 0.48 ± 0.00 กรัม L-1 ตามลำดับ) โดยมีขนาดกลางจำนวนสำเนาพลาสมิด pBAD18-BTE สะสมในปริมาณที่ลดลงเล็กน้อย (0.40 ± 0.03 กรัม L-1) สายพันธุ์เก็บงำยีน nonfunctional BTE บนพลาสมิดต่างๆสะสมในปริมาณที่ใกล้เคียงกันส่วนใหญ่เป็นกรดไขมันC16 เป็นไปตามคาด. ดังนั้นจึงสามารถสรุปได้ว่าการแสดงออกของ BTE บนสำเนาผลการพลาสมิดจำนวนน้อยในการผลิตกรดไขมันที่ดีที่สุด หนึ่งคำอธิบายที่เป็นไปได้คือปริมาณที่สูงขึ้นของthioesterase การทำงานที่มีการผลิตจากสำเนาพลาสมิดจำนวนสูงส่งผลให้อัตราที่รวดเร็วในขั้นต้นของการสะสมของกลางห่วงโซ่กรดไขมันอิสระ ในฐานะที่ไม่มีรู้จักกลไกการส่งออกโปรตีนสื่อกลางสำหรับกรดไขมันอิสระที่พวกเขามีแนวโน้มที่จะผ่านข้ามภายในเยื่อผ่านพลิกรน(สีดำและ DiRusso, 2003) กรด Dodecanoic ที่สินค้าBTE ที่โดดเด่นมีความสามารถในการละลายน้ำสูงกว่ากรดไขมันห่วงโซ่อีกต่อไป(Vorum et al., 1992) และอาจจะสามารถข้ามผ่านเยื่อหุ้มชั้นนอก porins (เฮิร์น et al., 2009) การสะสมอย่างรวดเร็วของ C12 และ C14 กรดไขมันอิสระในเยื่อชั้นในอาจส่งผลกระทบต่อความสมบูรณ์ของเมมเบรนและผลในการสลายเซลล์ คำอธิบายที่เป็นไปได้ที่สองคือการที่ปริมาณที่สูงขึ้นของการทำงานอย่างมีนัยสำคัญ thioesterase หมดสิ้นลง C12 และ C14-acyl ACPs ชะตาสำหรับการรวมตัวฟอสโฟเมมเบรนที่มีผลในจำนวนที่ลดลงของการทำงานได้เซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

preinduced การเจริญเติบโตและต้น ( ระยะ ไม่โดดเด่น pbbr1
ต้น ( อยู่ใน pbad35 ) จะแสดงที่นี่จะอยู่ที่ตัวเลขคัดลอกต่ำ ( ~ 5
) คล้ายกับที่ของ pacyc ที่มาในช่วงการเจริญเติบโตที่ชี้แจง อย่างที่คาดไว้ pbad18

เป็นมีจำนวนสำเนากลาง ตัวเลขสัมพัทธ์สูงสุด
BTE คัดลอกเพิ่มในเฟสอยู่กับที่ก่อนทั้งหมด ยกเว้น pbad35 เวกเตอร์ ซึ่งพบว่า ไม่มีการเปลี่ยนแปลง
นี่คงเป็นเพราะการแสดงตนของส้อมซ้ำหลายบนโครโมโซม
ในระหว่างการเจริญเติบโตอย่างรวดเร็ว ( nordstr ö m และ dasgupta , 2006 ) , หรือการจำกัดสารอาหารใน
สื่อที่หยุดการ oric ในขณะที่การต่อเนื่องจากจาก ต้นกำเนิดสายพันธุ์
มากมาย ( friehs , 2004 )แสดง bte-h204a พลาสมิดที่แสดงหมายเลขคัดลอก
ลดในช่วง stationary phase มากกว่าที่แสดง BTE ) อาจจะเป็น
ผลจากการเพิ่มขึ้นของการสลายเซลล์เหล่านี้ เกิดวัฒนธรรม การเปลี่ยนแปลงในการสลายของแม่แบบทั้งเซลล์
ได้รับก่อนหน้านี้ที่เกี่ยวข้องในฐานะที่เป็นแหล่งที่มาของข้อผิดพลาดในการกำหนดตัวเลข
คัดลอกพลาสมิดโดย qpcr ( providenti et al . , 2006 )สอดคล้องกับสมมติฐานนี้ ไม่มีความแตกต่างในการคัดลอกหมายเลข
2 ) และระหว่างที่ BTE bteh204a
ในระหว่างการเจริญเติบโตที่ชี้แจงก่อนการคัดลอกเบอร์โทร .
เพื่อตรวจสอบว่ามีความสัมพันธ์กับการผลิตกรดไขมัน , กรดไขมันทั้งหมดถูกสกัดและ derivatized
วิเคราะห์โดย GC / MS หลังจาก 23 H ( รูปที่ 3 ) ในสายพันธุ์
แสดง BTE การทํางานกรดไขมันโซ่ยาวขยับเด่นอย่างมาก
จาก c16 เพื่อ c12 กับ c12 บัญชีกรดไขมันถึง 75 % ของทั้งหมดองค์ประกอบกรด
ไขมัน สำหรับวัฒนธรรมการแสดง pbad33 BTE ประมาณ 15 % ของ c12 และ 59 %
ของ C14 กรดไขมันเป็นชนิดไม่อิ่มตัว แต่ที่สำคัญกว่าระดับ hydroxylated c12 ,
กลางในกรดไขมัน ความยาวรอบพบแต่ไม่ quantified ใน
หน้าที่แสดงสายพันธุ์ ( BTE เสริมรูปที่ 3 ) ของพลาสมิด bteexpressing
าง ระดับต่ำ ( 0.25 ± 0.01 g L − 1 ) สังเกตได้จากสูงสุดคัดลอก
เลขที่พลาสมิด pbad34 BTE , . 2 ) รวมกับค่าคัดลอกเบอร์ใน
ทั้งเอกซ์โพเนนเชียลและต้นนิ่ง เฟส pbad33 BTE pbad35 BTE
และสะสมโดยสูงสุดของกรดไขมัน ( 0.54 ± 0.00 0.00 กรัมต่อลิตรและ 0.48 ±– 1 ตามลำดับ ) กับสำเนากลางเลขที่พลาส pbad18
BTE สะสมปริมาณลดลงเล็กน้อย ( 0.40 ±
0.03 กรัม L − 1 ) สายพันธุ์ที่ยีน BTE nonfunctional บนพลาสมิด
สะสมปริมาณต่าง ๆคล้ายเด่น c16 กรดไขมัน
ตามที่คาดไว้จึงพอสรุปได้ว่า การแสดงออกของ BTE บนพลาสมิดจำนวนสำเนาผล
ในเหมาะสมในการผลิตกรดไขมัน คำอธิบายหนึ่งที่เป็นไปได้ว่าปริมาณสูงกว่า
thioesterase หน้าที่ผลิตจากพลาสมิดจำนวนสำเนาสูง ส่งผลให้มีอัตราการสะสม
ตอนแรกอย่างรวดเร็วของห่วงโซ่ขนาดกลางกรดไขมันอิสระ . เนื่องจากไม่มีรู้จัก
โปรตีนโครงสร้างกลไกส่งออก กรดไขมันอิสระ พวกเขาอาจข้ามผ่านเยื่อหุ้มชั้นใน
ผ่านหัวพลิก ( สีดำและ dirusso , 2003 ) กรดลอริก ,
ผลิตภัณฑ์ BTE เด่น มีการดูดซึมน้ำที่สูงกว่ากรดไขมันห่วงโซ่ยาว
( vorum et al . , 1992 ) และอาจจะสามารถข้ามผ่านเยื่อหุ้มชั้นนอก porins ( เฮิร์นและ
al . , 2009 )การสะสมมากอย่างรวดเร็วและ c12 C14 กรดไขมันอิสระใน
เยื่อชั้นในอาจทำลายเยื่อความซื่อสัตย์และผลในการสลายเซลล์ . คำอธิบายที่สองเป็นไปได้
ที่ปริมาณสูงกว่า thioesterase การทำงานอย่างมากและทำให้หมดสิ้น c12 C14 , acps
destined สำหรับเยื่อฟอสโฟลิปิดบริษัท , ผลในการลดจำนวนของรัฐ
เซลล์