2. Materials and methods2.1. Mahula

2. Materials and methods
2.1. Mahula flowers
Fresh mahula flowers were collected from the forests of Keonj-har district of Orissa, India, during March–April, 2008. The flowers
were brought to the Microbiology Laboratory of Central Tuber
Crops Research Institute, Bhubaneswar, washed in tap water to
get rid of dust and other debris and sun-dried in open for 7 days
to reduce the moisture content to 11%. The sun-dried flowers col-lected from various locations were mixed thoroughly before being
used for ethanol fermentation. The sun-dried flowers have the fol-lowing compositions (expressed in g/100 g dry weight basis):
moisture, 11.0 ± 0.32; starch, 0.9 ± 0.007; total sugar (glucose, fruc-tose, sucrose and maltose), 61 ± 0.34; crude protein, 6.5 ± 0.27;
crude fiber, 15.3 ± 0.5; total ash, 1.8 ± 0.31; undetermined solids,
3.5 ± 0.42. The pH of the mahula flower was measured in slurry
prepared with flower:water in 1:5 ratio.
2.2. Microorganism and culture condition
The yeast S. cerevisiae(CTCRI strain) was earlier used for ethanol
fermentation [4] maintained on Malt extract–Yeast extract–Glu-cose–Peptone (MYGP) medium [(g/l): malt extract, 3; yeast extract,
5; peptone, 5; glucose, 20; agar, 15] and the pH was adjusted to 5.5.
The culture was stored at 4 ± 0.5C for further use.
2.3. Preparation of inoculum
The inoculum was prepared in 100 ml growth medium (as men-tioned above but without agar) taken in sterilized (at 121 C for
20 min) 250 ml Erlenmeyer flask. The flask was inoculated with a
loopful of the S. cerevisiae culture and incubated for 24 h at 30C
at 120 rpm in an orbital shaker incubator (Remi Pvt. Ltd., Bombay,
India). This served as the inoculum for free cells for ethanol
production.
For immobilized cells, 60 ml of yeast inoculum [equivalent to
10% of the fermentation medium (600 ml)] was immobilized with
the luffa discs as the matrix described in the following section.
2.4. Immobilization of whole cells in luffa sponge discs
The luffa sponge discs were obtained from mature dried fruits
of L. cylindrica. The sponge was cut into discs of 2.5-cm diameter,
3–4 mm thick, and washed in boiling water three to four times.
The luffa discs were then oven-dried at 70 C. Sixty milliliter of
the yeast inoculum was directly poured into six luffa sponge discs
contained in 500-ml beaker. After the cells (inoculum) were
trapped within the matrix of the sponge, these immobilized luffa
discs were taken out and washed thoroughly with fresh sterilized
MYGP broth to remove the free cells before being used for the fer-mentation process. The flow-chart forS. cerevisiae cell immobiliza-tion method in luffa sponge discs is given in Fig. 1.
2.5. Fermentation medium
Mahula flowers (100 g) were crushed (flower:water ratio 1:5,
w/v) in a mixer-grinder (TTK Prestige Ltd., Bangalore, India) to
make slurry. (NH4
)
2 SO
4
was added to the slurry at the rate of
1 g/l as a source of nitrogen for growth of S. cerevisiae and subse-quently, the pH was adjusted to 5.5 with the addition of 1 N NaOH.
Then the slurry (600 ml) taken in 1 l Erlenmeyer flasks was inocu-lated with 10% inoculum in case of free cell fermentation and six
immobilized luffa sponge discs in case of immobilized cell fermen-tation. Triplicate flasks ( n = 3) were kept separately for free and
immobilized cell experiments for 96 h at the room temperature
(30 ± 2 C).
2.6. Analytical methods
At 24 h interval, fermented broths (in triplicate flasks) were re-moved and the contents were analyzed for total sugar and ethanol.
The ethanol content of the fermented broth was determined by
measuring specific gravity of the distillate according to the proce-dure described by Amerine and Ough [14] . In this procedure, the
weight of a certain volume of an alcohol distillate was compared
to the weight of exactly the same volume of distilled water. The ra-tio of the weights of the two (alcohol:water) gave the specific grav-ity of the distillate. The total sugar was assayed by Anthrone
method[15] . The pH was measured using a pH meter (Systronics,
Ahmadabad, India) fitted with a glass electrode. The immobilized
cells, separated after fermentation, were reused for successive
three batches. The fermentation kinetics was studied as per the
formulae given by Bailey and Ollis[16] .
2.7. Statistical analysis
The data of ethanol production using free and immobilized cells
of S. cerevisiae was analyzed using one way ANOVA. Where signif-icant difference in ANOVA (p < 0.05) was detected by the Fisher’s
Least Significance Difference (LSD) multiple comparison test which
was applied to compare the factor level difference. The analysis
was performed using MSTAT-C (version 2.0, Michigan State Uni-versity, Michigan, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 ดอกไม้ Mahula
mahula สดดอกไม้ถูกเก็บรวบรวมจากป่าของอำเภอ Keonj ฮาร์ Orissa อินเดีย ระหว่างเดือนมีนาคม – เมษายน 2008 ดอกไม้
ถูกนำไปจุลชีววิทยาปฏิบัติการของศูนย์กลางหัว
สถาบันวิจัยพืชไร่ ภุพเนศวร เครื่องซักผ้าในน้ำประปาเพื่อ
กำจัดฝุ่นและเศษขยะอื่น ๆ และแดดเดียวในเปิด 7 วัน
เพื่อลดความชื้นเนื้อหา 11% คอลัมน์-lected แดดเดียวดอกไม้จากสถานต่าง ๆ ถูกผสมอย่างละเอียดการ
ใช้หมักเอทานอล ดอกไม้แห้งซันมีองค์ fol ควายเหล็ก (แสดงในพื้นฐาน กรัม/100 กรัมน้ำหนักแห้ง):
ความชื้น ± 11.0 $ 0.32 แป้ง, ± 0.9 0.007 รวมน้ำตาล (กลูโคส fruc tose ซูโครส และ maltose), 61 ± 0.34 โปรตีนหยาบ 6.5 ± 0.27;
เส้นใยหยาบ 15.3 ± 0.5 รวมเถ้า 1.8 ±$ 0.31 ของแข็งถูกระบุ,
3.5 ± 0.42 มีวัด pH ของดอกไม้ mahula ในสารละลาย
พร้อมดอกไม้: น้ำในอัตราส่วน 1:5.
2.2 จุลินทรีย์และวัฒนธรรมเงื่อนไข
ยีสต์ S. cerevisiae (ต้องใช้ CTCRI) ถูกใช้ก่อนหน้านี้สำหรับเอทานอล
หมัก [4] อยู่ในข้าวมอลต์สกัด – ยีสต์สกัด – Glu-cose – Peptone (MYGP) กลาง [(g/l): มอลต์สกัด 3 ยีสต์สกัด,
5 peptone, 5 กลูโคส 20 agar, 15] และถูกปรับ pH 5.5.
วัฒนธรรมถูกเก็บไว้ที่ 4 ± 0.5 C สำหรับต่อใช้งาน
2.3 การเตรียม inoculum
inoculum ถูกเตรียมใน 100 มลเชื้อ (เป็นคน tioned ข้างบน แต่ไม่ มี agar) ถ่ายใน sterilized (ที่ 121 C สำหรับ
20 นาที) 250 ml Erlenmeyer หนาว หนาวมี inoculated กับการ
loopful ของได้ cerevisiae วัฒนธรรม และ incubated ใน 24 ชมที่ 30 C
ที่ 120 รอบต่อนาทีในการบ่มเพาะวิสาหกิจเชคเกอร์ของวงโคจร (Remi pvt. จำกัด บอมเบย์,
อินเดีย) นี้ทำหน้าที่เป็น inoculum ฟรีเซลล์สำหรับเอทานอล
ผลิต
สำหรับตรึงเซลล์ 60 ml ของ inoculum ยีสต์ [เทียบเท่ากับ
10% หมักกลาง (600 มล.)] ถูกตรึงด้วย
แผ่นใยบวบเป็นเมตริกซ์ที่กล่าวถึงในต่อไปนี้ส่วน
2.4 ตรึงโปของเซลล์ทั้งหมดในดิสก์ฟองน้ำใยบวบ
แผ่นฟองน้ำใยบวบได้รับมาจากผู้ใหญ่คลาสสิค
ของ L. และ ฟองน้ำที่ตัดเป็นแผ่นเส้นผ่าศูนย์กลาง 2.5 ซม.,
3-4 มม.หนา และหินในน้ำเดือด 3-4 ครั้ง
ผิวดิสก์ได้แล้วเตาอบแห้งที่ milliliter 60 C. 70 ของ
inoculum ยีสต์โดยตรงที่ poured เป็นแผ่นฟองน้ำใยบวบ 6
มีอยู่ในบีกเกอร์ 500 ml หลังจากเซลล์ (inoculum)
เหล่านี้ติดอยู่ภายในเมทริกซ์ของฟองน้ำ ตรึงผิว
ดิสก์ถูกเอาออก และล้างสะอาด ด้วยสด sterilized
MYGP ซุปเอาเซลล์ฟรีก่อนที่จะใช้สำหรับกระบวนการเอกสาร fer Flow-chart forS วิธีสเตรชัน immobiliza เซลล์ cerevisiae ในใยบวบฟองน้ำดิสก์ถูกกำหนดใน Fig. 1.
2.5 หมักกลาง
ถูกบดดอกไม้ Mahula (100 กรัม) (ดอกไม้: น้ำอัตราส่วน 1:5,
w/v) ในการผสมเครื่องบด (TTK เพรสทีจ จำกัด บังกาลอร์ อินเดีย) กับ
ทำให้สารละลาย (NH4
)
2 ดังนั้น
4
ถูกเพิ่มลงในสารละลายในอัตรา
ถูกปรับ 1 g/l เป็นแหล่งของไนโตรเจนสำหรับการเติบโตของ S. cerevisiae และ subse quently, pH 5.5 แห่ง 1 N NaOH
แล้วสารละลาย (600 มล.) ถ่ายในน้ำ 1 l Erlenmeyer ถูก inocu lated กับ inoculum 10% กรณีหมักเซลล์ว่างและ 6
หาแผ่นฟองน้ำใยบวบในกรณีเซลล์เอนไซม์ fermen-tation Triplicate นำ (n = 3) ที่ถูกเก็บไว้แยกต่างหากสำหรับฟรี และ
หาทดลองเซลล์สำหรับ h 96 ที่
(30 ± 2 C) อุณหภูมิห้อง
2.6 วิธีวิเคราะห์
ในช่วงเวลา 24 ชม ร้า broths (ในน้ำ triplicate) ถูกย้ายอีกครั้ง และมีวิเคราะห์เนื้อหารวมน้ำตาลและเอทานอล
เนื้อหาเอทานอลของซุปร้าถูกกำหนดโดย
วัดความถ่วงจำเพาะของกลั่นตาม dure proce ที่อธิบายไว้ โดย Amerine และ Ough [14] ในขั้นตอนนี้ การ
เป็นการเปรียบเทียบน้ำหนักของปริมาณการกลั่นแอลกอฮอล์
น้ำหนักของตรงเดียวกันระดับน้ำกลั่น ติ้ว ra น้ำหนักของทั้งสอง (แอลกอฮอล์: น้ำ) ให้ grav-ity เฉพาะของกลั่น น้ำตาลรวมถูก assayed โดย Anthrone
วิธี [15] มีวัด pH โดยใช้เครื่องวัดค่า pH (Systronics,
อาห์เมดาบัด อินเดีย) กับอิเล็กโทรดแก้ว ที่เอนไซม์
เซลล์ แบ่งหลังจากหมัก ถูกใช้สำหรับต่อ
ชุดสาม มีศึกษาจลนพลศาสตร์หมักตาม
สูตร Bailey และ Ollis [16] .
2.7 วิเคราะห์ทางสถิติ
ข้อมูลของการผลิตเอทานอลโดยใช้เซลล์เอนไซม์ และฟรี
ของ S. cerevisiae ที่วิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว ที่ signif icant ความแตกต่าง (p < 0.05) การวิเคราะห์ความแปรปรวนพบของ Fisher
ผลต่างนัยสำคัญน้อยที่สุด (LSD) ทดสอบเปรียบเทียบหลายที่
ใช้เปรียบเทียบความแตกต่างระดับปัจจัย การวิเคราะห์
ทำใช้ MSTAT-C (รุ่น 2.0 รัฐมิชิแกน Uni versity มิชิแกน สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . ดอกไม้ mahula
ดอกไม้ mahula สดที่เก็บจากป่าของ keonj Har ตำบลของโอริสสา อินเดีย ในช่วงเดือนมีนาคม–เมษายน 2551 ดอกไม้
ถูกพาตัวไปที่กลางหัวของห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา
พืช สถาบันวิจัย ภุพเนศวร ล้างในน้ำ

กำจัดฝุ่นและเศษซากอื่น ๆ และตากแดดในที่โล่ง
7 วันเพื่อลดความชื้นเป็น 11 % ดวงอาทิตย์แห้งดอกโคล lected จากสถานที่ต่างๆ มาผสมอย่างละเอียดก่อนการ
ใช้สำหรับหมักเอทานอล ดวงอาทิตย์แห้งดอกมีสีขาว lowing องค์ประกอบ ( แสดงในกรัม / 100 กรัมน้ำหนักแห้ง ) :
ความชื้น , 11.0 ± 0.32 ; แป้ง - 0.9 ± ; ปริมาณน้ำตาล ( กลูโคส fruc tose ซูโครส น้ำตาล ) , 61 ± 0.34 ; โปรตีน , 6.5 ± 0.27 ;
เส้นใยหยาบ ± 0.5 0.7 ; เถ้ารวม 1.8 ± 0.31 ; ของแข็งบึกบึน
3.5 , ± 0.42 . pH ของ mahula ดอกไม้วัดในสารละลาย
เตรียมดอกไม้ : น้ำในอัตราส่วน 1 : 5 .
2.2 . จุลินทรีย์และยีสต์ S . cerevisiae วัฒนธรรมสภาพ
( ctcri สายพันธุ์ ) คือก่อนหน้านี้ที่ใช้สำหรับการหมักเอทานอล
[ 4 ] รักษา malt extract สารสกัดจากยีสต์ –––เปปโตน ( GLU กว่นระ ) ( [ ( g / l ) : malt extract , 3 ;ยีสต์สกัด extract
5 ; 5 ; กลูโคส 20 ; วุ้น 15 ] และปรับ pH 5.5 .
วัฒนธรรมที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 ± 0.5  C สำหรับการใช้งานต่อไป .
2.3 การเตรียมเชื้อ
เชื้อเตรียม 100 มิลลิลิตร growth medium ( เป็นมนุษย์ tioned ข้างต้น แต่ไม่มีวุ้น ) ถ่ายในการฆ่าเชื้อที่ 121 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที 
เออร์เลนเมเยอร์ ) 250 ml . ขวด ขวดเป็นเชื้อด้วย
loopful ของ sวัฒนธรรมและบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 30  C
120 รอบต่อนาทีใน incubator shaker วิถีโคจร ( เรมิ Pvt . จำกัด อินเดียบอมเบย์ ,
) นี้ทำหน้าที่เป็นเชื้อเซลล์ฟรีสำหรับการผลิตเอทานอล
.
สำหรับการตรึงเซลล์ 60 มิลลิลิตร เทียบเท่ากับเชื้อยีสต์ [
10% ของการหมักขนาดกลาง ( 600 มล. ) ] ถูกตรึงกับแผ่นใย
เป็นเมทริกซ์ที่อธิบายไว้ในส่วนต่อไปนี้
2.4 .การตรึงเซลล์ทั้งหมดในใยบวบฟองน้ำใยบวบ ฟองน้ำ แผ่นดิสก์
ได้จากผู้ใหญ่ผลไม้แห้ง
L . ถั่วขาว . ฟองน้ำที่ถูกตัดเป็นแผ่นขนาด 2.5-cm
3 – 4 มม. , หนาและล้างในน้ำสามถึงสี่ครั้ง
ใยแผ่น แล้วอบให้แห้งที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียส  60 มิลลิลิตรของ
ยีสต์เชื้อโดยตรง เทใส่ใยบวบ ฟองน้ำแผ่น
6ที่มีอยู่ในบีกเกอร์ขนาด 500 ml . หลังจากที่เซลล์ ( 3 )
ติดภายในเมทริกซ์ของฟองน้ำ ใยบวบ แผ่นดิสก์เหล่านี้ตรึง
ถ่ายออก และล้างให้สะอาดด้วยน้ำซุปจืดฆ่าเชื้อ
นระลบเซลล์ฟรีก่อนที่จะใช้สำหรับเป็น mentation กระบวนการ การไหลแผนภูมิสำหรับ . S . cerevisiae เซลล์ immobiliza tion ในใยบวบ ฟองน้ำ แผ่น เป็นวิธีที่ให้ในรูปที่ 1 .
2.5หมักปานกลาง
mahula ดอกไม้ ( 100 กรัม ) ที่ถูกบด ( ดอกไม้ : น้ำ อัตราส่วน 1 : 5 ,
w / v ) ในเครื่องบดผสม ( TTK Prestige จำกัด , บังกาลอร์ , อินเดีย )

ให้เสีย . ( NH4
)

4
2 ดังนั้นก็เพิ่มความเข้มข้นในอัตรา
1 กรัมต่อลิตร เป็นแหล่งไนโตรเจนสำหรับการเจริญเติบโตของ S . cerevisiae subse quently , pH 5.5 กับปรับเพิ่ม 1 N NaOH .
แล้วค่า ( 600 มล. ) ถ่ายใน 1 ลิตร ขวด เออร์เลนเมเยอร์ถูก inocu ที่มีเชื้อสาย 10% ในกรณีของการหมักเซลล์ฟรีและหก
( ใยบวบฟองน้ำแผ่นในกรณีที่เซลล์ตรึง fermen tation . ทำสำเนาสามฉบับ flasks ( n = 3 ) ถูกเก็บไว้แยกต่างหากสำหรับฟรีและ
เซลล์ตรึงการทดลองสำหรับ 96 H ที่อุณหภูมิห้อง ( 30 ± 
2 C )
2.6 วิธีการวิเคราะห์
ในช่วงเวลา 24 ชั่วโมงาหมัก ( ทั้งสามใบขวด ) จะย้ายและเนื้อหาวิเคราะห์ปริมาณน้ำตาลและเอทานอล เอทานอล
เนื้อหาของน้ำหมักถูกกำหนดโดย
วัดความถ่วงจำเพาะของกลั่นตาม proce ระหว่างและอธิบายโดย amerine จริงๆ [ 14 ] ในขั้นตอนนี้ ,
น้ำหนักของปริมาณบางอย่างของสุรากลั่นเทียบ
กับน้ำหนักของ ตรงเดียวกัน ปริมาณน้ำกลั่น ราเนียมของน้ำหนักของทั้งสอง ( เหล้า : น้ำ ) ให้ grav ity โดยกลั่น . น้ำตาลทั้งหมด โดยวิธีเอนไซม์แอนโทรน
[ 15 ] ค่า pH คือการวัดโดยใช้เครื่องวัด ( systronics
, Ahmadabad , อินเดีย ) พอดีกับขั้วไฟฟ้าแก้ว ตรึง
เซลล์แยกออกจากกันหลังจากหมักเป็น mid ต่อเนื่อง
สามชุด จลนพลศาสตร์ของการหมักศึกษาตาม
สูตรให้และเบลีย์ ollis [ 16 ] .
2.7 . การวิเคราะห์ทางสถิติ
ข้อมูลการผลิตเอทานอลโดยใช้ฟรีและการตรึงเซลล์
S . cerevisiae วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว . ที่ signif ไอ้แค้นในความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ( p < 0.05 ) ถูกตรวจพบโดยเป็น
ฟิชเชอร์อย่างน้อยความแตกต่าง ( LSD ) ทดสอบเปรียบเทียบพหุคูณซึ่ง
มีวัตถุประสงค์เพื่อเปรียบเทียบระดับปัจจัยต่าง การวิเคราะห์การใช้ mstat-c
( รุ่น 2.0 , รัฐมิชิแกนยูนิ versity , Michigan , USA )