Materials and MethodsConstruction o

Materials and Methods
Construction of Plasmids That Contain DNA Templates for the Synthesis
of siRNAs Under the Control of the U6 Promoter. Plasmid
pmU6 (315
1) (gift of S. Altman, Yale University, New
Haven, CT) was used as a template for PCR isolation of the U6
promoter (315 to 1) with an added ApaI cloning site at the
transcriptional initiation site, which was cloned into Bluescript
(BS) to generate the parent plasmid BS
U6. A general strategy
for constructing an RNAi plasmid involved subcloning an inverted
repeat into BS
U6 at the ApaI site. The selection of the
coding sequences for siRNA was empirically determined but
they started with GG and were analyzed by BLAST research to
ensure that they did not have significant sequence homology with
other genes. Insertion of the individual repeat motifs into BS
U6
was achieved in two separate steps. For example, to generate the
BS
U6
gfp RNAi plasmid, a 22-nt oligo (oligo 1) corresponding
to nucleotides 106–127 of the green fluorescent protein (GFP)
coding region was first inserted into the BS
U6 vector digested
with ApaI (blunted) and XhoI. The inverted motif that contains
the 6-nt spacer and five Ts (oligo 2) was then subcloned into
the XhoI and EcoRI sites of the intermediate plasmid to
generate BS
U6
gfp. Oligo 1 is 5
-GGCGATGCCACCTACGGCAAGC-
3
(forward) and 5
-TCGAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCC-
3
(reverse). Oligo 2 is 5
-TCGAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTTTTTG-
3
(forward) and 5
-
AATTCAAAAAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGC-3

(reverse).
Construction of RNAi plasmids for the endogenous genes
[lamin A
C, cyclin-dependent kinase-2 (cdk-2), and DNA methyltransferase-
1 (dnmt-1)] was essentially the same as above. The
sequences for the bodies of the siRNAs for lamin A
C, cdk-2, and
dnmt-1 were taken from GenBank accession nos. XM-086566
(nucleotides 1627–1647), XM-049150 (nucleotides 652–672),
and NM-001379 (nucleotides 598–617), respectively.
Cell Culture and Transfections. HeLa, U-2 OS, H1299, and C-33A
(American Type Culture Collection) cells were cultured in
DMEM (GIBCO) supplemented with 10% of heat-inactivated
FBS. Cells grown on coverslips in 6-well plates were transfected
by using a calcium phosphate method and harvested 2–3

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการก่อสร้าง Plasmids ที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์ของ siRNAs ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ U6 PlasmidpmU6 (315 1) (ของขวัญของ S. Altman มหาวิทยา ลัยเยล ใหม่Haven, CT) ใช้เป็นแม่แบบสำหรับแยก PCR U6โปรโมเตอร์ (315-1) มีการอภัยเพิ่มโคลนการเว็บไซต์เริ่มต้น transcriptional ซึ่งเป็นการลอกแบบลงใน Bluescript(BS) การสร้าง plasmid หลักบี U6 กลยุทธ์ทั่วไปก่อสร้างการ RNAi plasmid ที่เกี่ยวข้องกับ subcloning การคว่ำทำซ้ำลงในบี U6 ไซต์อภัย การเลือกการลำดับในการเขียนโค้ดสำหรับ siRNA เชิงประสบการณ์ด้วยกำหนด แต่เริ่มต้นกับ GG และถูกวิเคราะห์ โดยระเบิดวิจัยเพื่อให้แน่ใจว่า พวกเขาไม่มีลำดับสำคัญ homology กับอื่น ๆ ยีน ลวดลายที่ซ้ำแต่ละแทรกเข้าบี U6สำเร็จในสองขั้นตอนแยกต่างหาก ตัวอย่างเช่น เพื่อสร้างความบี U6 gfp RNAi plasmid โอลิ 22-nt (โอลิ 1) สอดคล้องกันการนิวคลีโอไทด์ 106 – 127 ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP)รหัสภูมิภาคครั้งแรกแทรกลงในเวกเตอร์ U6 บีที่ถูกย่อยอภัย (blunted) และ XhoI ลายสลับที่ประกอบด้วยสเปเซอร์ 6-nt และ Ts 5 (โอลิ 2) คือ subcloned แล้วเข้าเว็บไซต์ XhoI และ EcoRI ของ plasmid กลางเพื่อสร้างบี U6 gfp โอลิ 1 เป็น 5 - GGCGATGCCACCTACGGCAAGC-3 (ข้างหน้า) และ 5 - TCGAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCC-3 (ย้อนกลับ) โอลิ 2 เป็น 5 - TCGAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTTTTTG-3 (ข้างหน้า) และ 5-AATTCAAAAAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGC-3(ย้อนหลัง)การก่อสร้างของ RNAi plasmids สำหรับยีนภายนอก[lamin A C ขึ้น cyclin ไคเนสรี-2 (cdk-2), และดีเอ็นเอ methyltransferase -1 (dnmt-1)] เป็นหลักเหมือนกับข้างต้น การลำดับสำหรับร่างกายของ siRNAs สำหรับ lamin A C, cdk-2 และdnmt-1 ถูกนำมาจากชุดหมายเลขการภาคยานุวัติ GenBank XM-086566(นิวคลีโอไทด์ 1627 – 1647), XM-049150 (นิวคลีโอไทด์ 652 – 672),และ NM-001379 (นิวคลีโอไทด์ 598 – 617), ตามลำดับเซลล์และ Transfections HeLa, U-2 OS, H1299 และ C-33Aเซลล์ (อเมริกันชนิดลเล็ก) ถูกล้างในDMEM (GIBCO) เสริม ด้วย 10% ของความร้อนยกFBS ปลูกบน coverslips ในจานหลุม 6 เซลล์ถูก transfectedโดยใช้วิธีแคลเซียมฟอสเฟต และเก็บเกี่ยว 2-3

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธี
การก่อสร้างของพลาสมิดที่ประกอบด้วยแม่ดีเอ็นเอสังเคราะห์
ของ siRNAs ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ U6 พลาสมิด
pmU6 (? 315 ?? 1) (ของขวัญจากเอส Altman, มหาวิทยาลัยเยลนิว
เฮเวนส์) ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบสำหรับการแยก PCR ของ U6
ก่อการ (? 315? 1) กับเพิ่มอภัยโคลนเว็บไซต์ที่
เว็บไซต์เริ่มต้นการถอดรหัสซึ่งถูกโคลนเข้าสู่ Bluescript
(BS) เพื่อสร้างผู้ปกครองพลาสมิด BS? U6 กลยุทธ์ทั่วไป
สำหรับการสร้างพลาสมิดที่เกี่ยวข้อง RNAi subcloning คว่ำ
ซ้ำเข้าไป BS? U6 ที่เว็บไซต์อภัย การเลือกของที่
มีลำดับการถอดรหัสสำหรับ siRNA ก็ตัดสินใจที่สังเกตุ แต่
พวกเขาเริ่มต้นด้วยการ GG และได้รับการวิเคราะห์โดยการวิจัยระเบิด
แน่ใจว่าพวกเขาไม่ได้มีความคล้ายคลึงกันอย่างมีนัยสำคัญกับลำดับ
ยีนอื่น ๆ แทรกลวดลายซ้ำแต่ละคนลง BS? U6
ก็ประสบความสำเร็จในสองขั้นตอนที่แยกต่างหาก ยกตัวอย่างเช่นการสร้าง
BS? U6? GFP RNAi พลาสมิดที่ Oligo 22 NT (Oligo 1) ที่สอดคล้องกัน
ไปนิวคลีโอ 106-127 ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP)
เขตการเข้ารหัสเป็นครั้งแรกที่แทรกเข้าไปใน BS? U6 เวกเตอร์ย่อย
ด้วย อภัย (ทื่อ) และ XhoI บรรทัดฐานฤๅษีที่มี
spacer 6 NT และห้า Ts (Oligo 2) ถูก subcloned แล้วเป็น
XhoI และ EcoRI เว็บไซต์ของพลาสมิดกลางเพื่อ
สร้าง BS? U6? GFP Oligo 1 คือ 5? -GGCGATGCCACCTACGGCAAGC-
3 หรือไม่? (Forward) และ 5? -TCGAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCC-
3 หรือไม่? (ย้อนกลับ) Oligo 2 เป็น 5? -TCGAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTTTTTG-
3 หรือไม่? (Forward) และ 5? -
? AATTCAAAAAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGC-3
(ย้อนกลับ).
การก่อสร้างของพลาสมิด RNAi สำหรับยีนภายนอก
[Lamin C, cyclin ขึ้นอยู่กับไคเนส-2 (CDK-2) และดีเอ็นเอ methyltransferase-?
1 (dnmt-1 )] เป็นหลักเช่นเดียวกับข้างต้น
ลำดับสำหรับศพของ siRNAs สำหรับ Lamin หรือไม่? C, CDK-2 และ
dnmt-1 ถูกนำมาจาก GenBank ภาคยานุวัติ Nos XM-086566
(นิวคลีโอ 1627-1647) XM-049150 (นิวคลีโอ 652-672)
และ NM-001379 (นิวคลีโอ 598-617) ตามลำดับ.
การเพาะเลี้ยงเซลล์และ Transfections HeLa, U-2 OS, H1299 และ C-33A
(ชนิดวัฒนธรรมอเมริกันเก็บ) เซลล์เพาะเลี้ยงใน
DMEM (GIBCO) เสริมด้วย 10% ของความร้อนที่ใช้งาน
FBS เซลล์ที่ปลูกใน coverslips ในแผ่น 6 ดีถูก transfected
โดยใช้วิธีการที่แคลเซียมฟอสเฟตและเก็บเกี่ยว 2-3

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการการสร้างพลาสมิดที่มีแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์ดีเอ็นเอของ u6 sirnas ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ พลาสมิดpmu6 ( 3151 ) ( ของขวัญของเอส อัลท์แมน มหาวิทยาลัยเยล ใหม่ยัง , CT ) ถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับการแยกของ u6 ดีเอ็นเอส่งเสริมการขาย ( ที่ 1 ) ด้วยการเพิ่มเว็บไซต์ที่อภัย โคลนนิ่งลองเริ่มต้นเว็บไซต์ที่ถูกโคลนเข้าไปใน bluescript( BS ) เพื่อสร้างสายพันธุ์พ่อแม่ bsu6 . กลยุทธ์ทั่วไปสำหรับการมีส่วนร่วมในอนาคตกลับหาพลาสมิดย้ำเข้าไป bsu6 ที่อภัยเว็บไซต์ การเลือกของรหัสลำดับสำหรับบริษัทคือใช้กำหนดแต่พวกเขาเริ่มต้นกับ GG และวิเคราะห์ ข้อมูลโดยใช้การวิจัยระเบิดตรวจสอบให้แน่ใจว่าพวกเขาไม่ได้มีความดับเป็นด้วยยีนอื่น ๆ การใส่ลวดลาย ซ้ำแต่ละคนเป็น bsu6ได้บรรลุแล้วในขั้นตอนที่สองที่แยกต่างหาก ตัวอย่างเช่น ในการสร้างหา bsu6gfp พลาสมิด , 22 NT โอลิโก ( โอลิโก 1 ) ที่สอดคล้องกันกับขนาด 106 – 127 ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ( GFP )รหัสภูมิภาคเป็นครั้งแรกที่แทรกลงใน bsu6 เวกเตอร์ย่อยด้วยอภัย ( ทื่อ ) และ xhoi . รูปกลับหัวที่ประกอบด้วยในช่วง 6-nt ห้า TS ( โอลิโก 2 ) ของเข้าแล้วการ xhoi EcoRI และเว็บไซต์กลางของพลาสมิดสร้าง bsu6gfp . 1 5-ggcgatgccacctacggcaagc - โอลิโก3 ( ไปข้างหน้า ) และ 5-tcgagcttgccgtaggtggcatcgcc -3 ( ย้อนกลับ ) 2 5-tcgagcttgccgtaggtggcatcgccctttttg - โอลิโก( ต่อ ) และ 5 - 3aattcaaaaagggcgatgccacctacggcaagc-3( ย้อนกลับ )การสร้างพลาสมิดสำหรับยีนภายในโอนิกส์[ ลามิน AC ขึ้นอยู่กับลักษณะ kinase-2 ( cdk-2 ) และ methyltransferase - ดีเอ็นเอ1 ( dnmt-1 ) ] เป็นหลักเช่นเดียวกับข้างต้น ที่ลำดับสำหรับศพของ sirnas สำหรับลามิน AC cdk-2 , และdnmt-1 ถ่ายจากขนาดการ xm-086566 NOS( เบส 1627 – 1395 ) xm-049150 ( ขนาด 652 – 672 )nm-001379 ( เบส ) และ 598 617 ) ตามลำดับการเพาะเลี้ยงเซลล์ และ transfections . ถึง u-2 , OS , h1299 และ c-33a( ชนิดของคอลเลกชันอเมริกันวัฒนธรรม ) ในเซลล์เพาะเลี้ยงdmem ( gibco ) 10% ของความร้อนซึ่งเสริมด้วยFBS เซลล์ที่ปลูกใน coverslips ใน 6-well แผ่นถูก transfectedโดยการใช้แคลเซียมฟอสเฟตและเก็บเกี่ยว 2 – 3 วิธี