2.4. Isolation and purification of

2.4. Isolation and purification of new red pigment
Cell-free fermented broth (4 L) was used for pigment purification. The filtrate
was concentrated to 1 L by using rotary evaporator (Rotavapor R-210, Buchi, Switzerland). Concentrated broth was lyophilized and powdered. The powder (5.5 g) was
extracted using hexane (total 500 mL) for 1 h in agitation (120 rpm) and concentrated to 2.4 g by using vacuum rotary evaporator.
The extracted crude pigment was loaded to silica gel (60–120 mesh) column.
Hexane, followed by various ratios of hexane and ethyl acetate were used as eluent.
Column eluted fractions read through spectrophotometer between 300 and 700 nm
were pooled together. Finally, ethanol was used to elute the target compound (with
other polar compounds).
To obtain high purity compound additional preparative TLC step in the purification protocol was incorporated. This ethanol fraction was concentrated and applied
to preparative TLC (20 cm × 20 cm, silica gel G). The running solvent was a mixture
of ethyl acetate, formic acid, acetic acid and water (100:11:11:26). The target band
Rf 0.42) was scrapped off, dissolved in ethanol, and separated from silica through
filtration (Whatman No. 1 filter paper, Whatman, England). The sample was concentrated to dryness at 45 ◦C under reduced pressure in a rotary evaporator (Rotavapor
RE, with cooler bath Julabo F40, Buchi).
To further check the purity of the pigment the purified product was analyzed
on C18 column (Techsphere 5ODS 4 m, 250 mm × 4.6 mm) using an analytical HPLC
(Waters, Milford, USA) equipped with a 2487 dual absorbance detector (Waters), set
at 400 and 500 nm. The flow rate was 0.5 mL min−1 using the mobile phase of acetonitrile mixed with water (80:20, v/v). The red pigment obtained from preparative
TLC was further purified by semi-preparative HPLC (Waters, USA) on a C18 column
(100 mm × 19 mm, XBridge Prep, Waters, USA) by using a separation gradient of
water mixed with methanol (80:20 to 0:100, v/v) over 30 min. The flow rate was
0.8 mL min−1

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 การแยกและการฟอกเม็ดสีแดงใหม่เซลล์ฟรีร้าซุป (4 ลิตร) ใช้สำหรับฟอกเม็ดสี การสารกรองเข้มข้นใน 1 L โดย evaporator โรตารี่ (Rotavapor R-210, Buchi สวิตเซอร์แลนด์) ซุปเข้มข้น lyophilized และผง มีผง (5.5 กรัม)สกัดโดยใช้เฮกเซน (รวม 500 mL) สำหรับ h 1 ในอาการกังวลต่อ (120 รอบต่อนาที) และเข้มข้นกับ 2.4 g โดย evaporator สิวโรตารี่ผงน้ำมันแยกถูกโหลดคอลัมน์ซิลิก้าเจล (60 – 120 ตาข่าย)เฮกเซน ตาม ด้วยอัตราส่วนต่าง ๆ ของเฮกเซนเอทิล acetate ถูกใช้เป็น eluentคอลัมน์ eluted เศษส่วนอ่านผ่านเครื่องทดสอบกรดด่างระหว่าง 300 และ 700 nmถูกทางถูกพูกัน สุดท้าย เอทานอลใช้สารประกอบเป้าหมาย(eluteอื่น ๆ ขั้วสาร)เพื่อให้ได้ความบริสุทธิ์สูงผสม preparative TLC ขั้นตอนเพิ่มเติมในโพรโทคอลฟอกถูกรวม เข้มข้น และใช้เศษส่วนนี้เอทานอลการ preparative TLC (20 ซม. × 20 ซม. ซิลิก้าเจล G) ตัวทำละลายที่ใช้เป็นส่วนผสมของเอทิล acetate กรด กรดอะซิติก และน้ำ (100:11:11:26) วงเป้าหมายRf 0.42) ซากปิด ละลายในเอทานอล และแยกออกจากซิลิก้าผ่านกรอง (Whatman No. 1 กระดาษกรอง Whatman อังกฤษ) ตัวอย่างเข้มข้นเพื่อความแห้งกร้านที่ ◦C 45 ภายใต้ความดันลดใน evaporator โรตารี่ (Rotavaporอีกครั้ง กับน้ำเย็น Julabo F40, Buchi)ได้วิเคราะห์ความบริสุทธิ์ของผงผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมในคอลัมน์ C18 (Techsphere 5ODS 4 m, 250 มม. × 4.6 มม.) โดยใช้การวิเคราะห์ HPLC(น้ำ ลฟอร์ด สหรัฐอเมริกา) พร้อมกับการจับคู่ absorbance 2487 (น้ำ) ตั้งค่าที่ 400 และ 500 nm อัตราการไหล min−1 0.5 mL ใช้ระยะเคลื่อนของ acetonitrile ผสมกับน้ำ (80:20, v/v) รงควัตถุสีแดงที่ได้รับจาก preparativeTLC ที่บริสุทธิ์ต่อไป โดยกึ่ง preparative HPLC (น้ำ สหรัฐอเมริกา) ในคอลัมน์ C18(100 มม. × 19 มม. เตรียม XBridge น้ำ สหรัฐอเมริกา) โดยใช้การไล่ระดับสีแยกของน้ำผสมกับเมทานอล (80:20 เพื่อ 0:100, v/v) กว่า 30 นาที อัตราการไหลได้min−1 0.8 mL

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของเม็ดสีแดงใหม่
น้ำซุปหมักเซลล์ฟรี (4 ลิตร) ถูกนำมาใช้สำหรับการทำให้บริสุทธิ์เม็ดสี กรอง
เข้มข้น 1 ลิตรโดยใช้เครื่องระเหยแบบหมุน (Rotavapor R-210, Buchi วิตเซอร์แลนด์) น้ำซุปเข้มข้นก็แห้งและผง ผง (5.5 กรัม) ถูก
สกัดโดยใช้เฮกเซน (รวม 500 มิลลิลิตร) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในการกวน (120 รอบต่อนาที) และความเข้มข้น 2.4 กรัมโดยใช้สูญญากาศเครื่องระเหยแบบหมุน.
สีดิบที่สกัดได้โหลดไปซิลิกาเจล (60-120 ตาข่าย) คอลัมน์.
Hexane ตามอัตราส่วนต่างๆของเฮกเซนและเอทิลอะซิเตถูกนำมาใช้เป็นตัวชะ.
คอลัมน์เศษส่วนชะอ่านผ่าน spectrophotometer ระหว่าง 300 และ 700 นาโนเมตร
ถูกรวบรวมเข้าด้วยกัน สุดท้ายเอทานอลถูกใช้ในการชะสารเป้าหมาย (ที่มี
สารโพลาร์และอื่น ๆ ).
ที่จะได้รับสารมีความบริสุทธิ์สูงขั้นตอนเตรียม TLC เพิ่มเติมในโปรโตคอลบริสุทธิ์จัดตั้งขึ้น ส่วนเอทานอลความเข้มข้นนี้ได้และนำไปใช้
ในการเตรียม TLC (20 ซม. × 20 ซมซิลิกาเจล G) ตัวทำละลายที่ทำงานเป็นส่วนผสม
ของน้ำนมกรดฟอร์มิค, กรดอะซิติกและน้ำ (100: 11: 11: 26) วงเป้าหมาย
Rf 0.42) ถูกทิ้งออกละลายในเอทานอลและแยกออกจากซิลิกาที่ผ่าน
การกรอง (Whatman ฉบับที่ 1 กระดาษกรอง Whatman อังกฤษ) ตัวอย่างเข้มข้นเพื่อความแห้งกร้านที่ 45 ◦Cภายใต้ความกดดันที่ลดลงในเครื่องระเหยแบบหมุน (Rotavapor
RE, มีห้องอาบน้ำเย็น Julabo F40, Buchi).
เพื่อเป็นการตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเม็ดสีผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ได้รับการวิเคราะห์
ในคอลัมน์ C18 (Techsphere 5ODS 4 ? ม., 250 มม× 4.6 มม) โดยใช้การวิเคราะห์ HPLC
(น้ำ, ฟอร์ดสหรัฐอเมริกา) การติดตั้งเครื่องตรวจจับการดูดกลืนแสงแบบ dual 2487 (น้ำ) ตั้ง
อยู่ที่ 400 และ 500 นาโนเมตร อัตราการไหล 0.5 มิลลิลิตร 1 นาทีโดยใช้เฟสเคลื่อนที่ของ acetonitrile ผสมกับน้ำ (80:20, v / v) สีแดงที่ได้จากการเตรียม
TLC บริสุทธิ์ต่อไปโดยกึ่งเตรียม HPLC (น้ำ, USA) ในคอลัมน์ C18
(100 มิลลิเมตร× 19 มม XBridge เตรียมน้ำสหรัฐอเมริกา) โดยใช้การไล่ระดับสีแยก
น้ำผสมกับเมทานอล (80 : 20-0: 100 v / v) กว่า 30 นาที อัตราการไหลเป็น
0.8 มิลลิลิตร 1 นาที

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การแยกและการฟอกใหม่สีแดงหมัก
มือถือฟรีซุป ( 4 ลิตร ) ใช้สีบริสุทธิ์ 148
คือความเข้มข้น 1 โดยใช้โรตารี่ evaporator ( rotavapor r-210 บูชิ , สวิตเซอร์แลนด์ ) น้ำซุปข้นและแห้งเป็นผง ผง ( 5.5 g )
สกัดโดยใช้เฮกเซน ( รวม 500 มล. ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในการปั่น ( 120 รอบต่อนาที ) และเข้มข้น 24 g โดยใช้สุญญากาศระเหย สกัดหยาบ
โหลดเม็ดสีคือ ซิลิกาเจล ( 60 - 120 ตาข่าย ) คอลัมน์
เฮกเซน ในอัตราส่วนต่างๆ ตามด้วยเฮกเซนและเอทิลอะซิเตท ใช้นี้ คอลัมน์ตัวอย่างเศษส่วน
อ่านผ่านวัสดุระหว่าง 300 และ 700 nm
ถูกรวมเข้าด้วยกัน ในที่สุด เอทานอลที่ใช้ elute สารประกอบเป้าหมาย ( มีสารประกอบโพลาร์ ๆ

)เพื่อให้ได้สารประกอบเพิ่มเติมค่าความบริสุทธิ์สูง ( ขั้นตอนในการขั้นตอนถูกรวม . ส่วนนี้คือเอทานอลเข้มข้นและประยุกต์
เพื่อเตรียม TLC ( 20 cm × 20 ซม. , ซิลิกาเจลกรัม ) การใช้ตัวทำละลายผสมของ เอทิลอะซิเตทเป็น
, กรด , กรดและน้ำ ( 100:11:11:26 ) วงดนตรี
เป้าหมาย RF 0.42 ) ถูกทำลายไปละลายในเอทานอลและแยกจากซิลิกาที่ผ่านการกรอง ( whatman
1 ไส้กรองกระดาษ whatman , อังกฤษ ) ตัวอย่างแบบแห้ง 45 ◦ C ภายใต้การลดความดันในเครื่องระเหยแบบหมุน ( rotavapor
อีกครั้งกับอาบน้ำสูตรเย็น julabo บูชิ , )
เพิ่มเติม ตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเม็ดสีและผลิตภัณฑ์ วิเคราะห์
ในคอลัมน์ C18 techsphere 5ods 4  M 250 มม. × 4.6 มม. ) โดยใช้
HPLC วิเคราะห์( น้ำ , ฟอร์ด , USA ) พร้อมกับ 2487 Dual การดูดกลืนแสงตรวจจับ ( น้ำ ) , การตั้งค่า
ที่ 400 และ 500 นาโนเมตร อัตราการไหลเท่ากับ 0.5 มิลลิลิตรต่อนาที− 1 โดยใช้เฟสเคลื่อนที่ของไนไตรล์ผสมกับน้ำ ( 80 , V / V ) รงควัตถุสีแดงที่ได้จากค่า
TLC ยังบริสุทธิ์ โดย HPLC กึ่งเบื้องต้น ( น้ำ , USA ) ใน c18 คอลัมน์
( 100 มม. × 19 มม. xbridge เตรียมน้ำสหรัฐอเมริกา ) โดยใช้การไล่ระดับของ
น้ำผสมกับเมทานอล ( 80 ถึง 0 v / v ) กว่า 30 นาทีอัตราการไหลเท่ากับ
0.8 มิลลิลิตรต่อนาที− 1