Activity-based screening of metagen

Activity-based screening of metagenomic library clones depends on the expression of genes and accessory machinery for the protein activity in the surrogate hosts (Martinez et al., 2004; Taupp et al., 2011). Multihost-systems have been developed to facilitate functional screening. For example, the commercial fosmid pCC1FOS that replicates only in E. coli and close bacteria was modified by inserting RK2 origin of transfer (oriT) and expressing RK2 replication protein TrfA in trans, in order to performfunctional screening in non-E. coli Gram
−
hosts (Aakvik et al., 2009). Broad-host-range cosmids of RK2 derivative were used previously for screening natural products (Craig et al., 2010), genes involved in polyhydroxyalkanoate metabolism (Wang et al., 2006; Schallmey et al., 2011), quorum sensing systems (Hao et al., 2010) and tryptophan synthesis (Li et al., 2005). In this work, we constructed newbroad-hostrange Gateway® entry cosmids pJC8 and pJC24 (Fig. 1) derived from pRK7813, able to replicate in a large number of Proteobacteria.The two cosmids have the same backbone for library construction, after the stuffer fragments are removed during vector preparation. The pJC8 and pJC24 have been employed to construct other metagenomic libraries of Canadian soil DNA and human gut, respectively (http://www.cm2bl. org; Lam et al., unpublished).
In order to increase screening efficiency and mining novel enzymes, we demonstrated that the cloned metagenomic DNA could be efficiently transferred to a specific Gateway® destination vector, and this will allow specialized functional screening in diverse hosts. The Gateway® destination vector pYES-DEST52 (Invitrogen) can be used for functional screening in Saccharomyces. The destination plasmid pDG148-GW can be adapted for functional metagenomic studies in

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กิจกรรมการตรวจคัดกรองโคลน metagenomic ไลบรารีตามการแสดงออกของยีนและเครื่องจักรอุปกรณ์สำหรับกิจกรรมโปรตีนในโฮสต์ตัวแทน (มาร์ติเน et al. 2004 Taupp et al. 2011) ระบบ multihost ได้รับการพัฒนาเพื่อความสะดวกในการคัดกรองทำงาน เช่น pCC1FOS fosmid พาณิชย์ที่ replicates เฉพาะใน E. coli และแบคทีเรียปิดถูก modified โดยใส่ต้นกำเนิด RK2 โอน (oriT) และ RK2 จำลองแบบโปรตีน TrfA ในทรานส์ เพื่อคัดกรอง performfunctional ใน E. ไม่แสดง coli กรัม−โฮสต์ (Aakvik et al. 2009) Cosmids โฮสต์ช่วงกว้างของอนุพันธ์ RK2 ใช้ก่อนหน้านี้สำหรับการคัดกรองผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ (Craig et al. 2010), ยีนที่เกี่ยวข้องในการเผาผลาญ polyhydroxyalkanoate (Wang et al. 2006 Schallmey et al. 2011), ตรวจจับระบบ (Hao et al. 2010) ควอรัมและการสังเคราะห์โพรไบโอ (Li et al. 2005) ในงานนี้ เราสร้าง pJC8 cosmids newbroad hostrange Gateway® รายการและ pJC24 (รูปที่ 1) ได้มาจาก pRK7813 สามารถทำซ้ำในจำนวน Proteobacteria.The 2 cosmids มีกระดูกสันหลังเดียวกันสำหรับการก่อสร้างห้องสมุด หลังจากเศษ stuffer จะถูกเอาออกในระหว่างการเตรียมการของเวกเตอร์ PJC8 และ pJC24 ได้รับการว่าจ้างสร้างไลบรารีอื่น ๆ metagenomic แคนาดาดินดีเอ็นเอและลำไส้ของมนุษย์ ตามลำดับ (http://www.cm2bl. org ลำ et al. ยกเลิกประกาศ)เพื่อเพิ่ม efficiency คัดกรองและการทำเหมืองแร่เอนไซม์นวนิยาย เราแสดงให้เห็นว่า metagenomic โคลนดีเอ็นเออาจจะโอนย้ายไปที่ปลายทางเวกเตอร์ Gateway® specific efficiently และจะทำให้คัดกรองเฉพาะที่ทำงานในโฮสต์มีความหลากหลาย The Gateway® ปลายทางเวกเตอร์ pYES-DEST52 (Invitrogen) สามารถใช้ตรวจงานใน Saccharomyces ปลายทาง plasmid pDG148-GW สามารถปรับ metagenomic งานศึกษาใน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การตรวจคัดกรองตามกิจกรรมของโคลนห้องสมุด Metagenomic ขึ้นอยู่กับการแสดงออกของยีนและอุปกรณ์เสริมสำหรับกิจกรรมโปรตีนในครอบครัวตัวแทน (มาร์ติเน et al, 2004;.. Taupp et al, 2011) Multihost ระบบได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่ออำนวยความสะดวกในการตรวจคัดกรองการทำงาน ยกตัวอย่างเช่น pCC1FOS fosmid เชิงพาณิชย์ที่ซ้ำเฉพาะใน E. coli และแบคทีเรียที่ใกล้เป็น Fi Modi ed โดยการใส่กำเนิด RK2 ของการถ่ายโอน (Orit) และการแสดงการจำลองแบบโปรตีน RK2 TrfA ในทรานส์เพื่อที่จะคัดกรอง performfunctional ไม่ใช่-E coli กรัม
-
โฮสต์ (. Aakvik et al, 2009) cosmids กว้างเป็นเจ้าภาพช่วงของ RK2 อนุพันธ์ถูกนำมาใช้ก่อนหน้านี้สำหรับการตรวจคัดกรองผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ, ยีนที่เกี่ยวข้องในการเผาผลาญ polyhydroxyalkanoate (เครก et al, 2010.) (วัง et al, 2006;.. Schallmey et al, 2011), ระบบตรวจจับองค์ประชุม ( Hao et al., 2010) และการสังเคราะห์โพรไบโอ (Li et al., 2005) ในงานนี้เราสร้าง newbroad-hostrange Gateway®รายการ cosmids pJC8 และ pJC24 (รูปที่ 1). ที่ได้มาจาก pRK7813 สามารถที่จะทำซ้ำในจำนวนมากของ Proteobacteria.The สอง cosmids มีกระดูกสันหลังเดียวกันสำหรับการก่อสร้างห้องสมุดหลังจากชิ้นส่วนหู จะถูกลบออกในระหว่างการเตรียมเวกเตอร์ pJC8 และ pJC24 ได้รับการว่าจ้างในการสร้างห้องสมุด Metagenomic อื่น ๆ ของดีเอ็นเอดินแคนาดาและลำไส้ของมนุษย์ตามลำดับ (http:. org //www.cm2bl; Lam, et al, ไม่ถูกเผยแพร่.).
เพื่อเพิ่มการตรวจคัดกรอง EF ciency Fi และเอนไซม์นวนิยายการทำเหมืองแร่ เราแสดงให้เห็นว่าดีเอ็นเอ Metagenomic โคลนอาจจะ Fi EF โอนอย่างมีประสิทธิภาพไปยังระบุไว้ C Gateway®เวกเตอร์ปลายทางและนี้จะช่วยให้การตรวจคัดกรองการทำงานเฉพาะในการเป็นเจ้าภาพที่มีความหลากหลาย Gateway®ปลายทางเวกเตอร์ pYES-DEST52 (Invitrogen) สามารถนำมาใช้สำหรับการคัดกรองการทำงานใน Saccharomyces ปลายทางพลาสมิด pDG148-GW สามารถดัดแปลงสำหรับการศึกษา Metagenomic ในการทำงาน