2.5. Specific immune response2.5.1.

2.5. Specific immune response
2.5.1. Enzyme linked immunosorbant assay (ELISA)
The serum antibody response to A. hydrophila was measured using an indirect ELISA method described by Delamare et al. [19] with minor modifications [20]. Flat-bottomed microtiter plate was coated with (100 μL/well) whole bacterial cells. The bacteria were earlier harvested from overnight liquid culture, washed thrice with 0.15 mol/L NaCl solution and adjusted to 3 × 106 CFU in 0.05 M carbonate bicarbonate buffer (pH 9.6). The plate was incubated overnight at 4 °C, washed thrice with PBS containing 0.05% (v/v) Tween 20 (PBS-T). Non-specific binding sites were blocked with (100 μL/well) 1% (w/v) BSA in PBS. The plate was incubated at 28 °C for 1 h and washed thrice with PBS-T. In each well, 100 μL of test serum sample (diluted to 1:30 in PBS-T) was added and incubated at 28 °C for 1 h; the plate was washed thrice with PBS-T. In each well, 100 μL rabbit anti-catla polyclonal antibody (produced in our laboratory, diluted 1:100 using PBS) was added. The plate was allowed to stand for 1 h at 37 °C; washed thrice with PBS-T. Then 100 μL of goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase (GeNei, India, diluted 1:2000 in PBS) was added to each well and incubated at 37 °C for 1 h. The plate was again washed thrice with PBS-T. 100 μL of 3, 3′, 5, 5′- tetramethyl benzidine (GeNei, India) mixed with 0.1% (v/v) of hydrogen peroxide was added for colour development. The reaction was stopped by adding 25 μL of 1 M sulphuric acid. The optical density was measured at 450 nm. The mean absorbance value of each well was used to express serum antibody level.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5 การกำหนดภูมิคุ้มกันตอบสนอง2.5.1. เอนไซม์ลิงค์ immunosorbant assay (ELISA)การเซรั่มแอนติบอดีตอบสนองต่อ A. hydrophila ถูกวัดโดยใช้วิธี ELISA อ้อมอธิบายโดย Delamare et al. [19] มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย [20] จาน flat-bottomed microtiter ถูกเคลือบ ด้วยเซลล์แบคทีเรียทั้งหมด (100 μL/ดี) แบคทีเรียก่อนหน้านี้เก็บเกี่ยวผลผลิตจากวัฒนธรรมของเหลวค้างคืน ล้างเลย ด้วย 0.15 โมล/L NaCl แก้ปัญหา และปรับปรุง 3 × 106 CFU ในบัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนตคาร์บอเนต 0.05 M (pH 9.6) จานถูก incubated ค้างคืนที่ 4 ° C ล้าง ด้วย PBS ประกอบด้วย 0.05% (v/v) Tween 20 (PBS-T) เลย รวมไม่ใช่เฉพาะเว็บไซต์ที่ถูกบล็อก ด้วย (100 μL/ดี) 1% (w/v) บีเอสเอใน PBS จาน incubated ที่ 28 ° C สำหรับ 1 h และล้าง ด้วย PBS ต.สามครั้ง ในแต่ละบ่อ μL 100 ของการทดสอบตัวอย่างซีรั่ม (ยกเว้นถึง 1:30 ใน PBS-T) ถูกเพิ่ม และ incubated ที่ 28 ° C สำหรับ h 1 จานไม่ล้าง ด้วย PBS ต.สามครั้ง ในแต่ละดี 100 μL กระต่ายปลากระโห้อินเดียป้องกัน polyclonal แอนติบอดี (ผลิตในห้องปฏิบัติการของเรา ทำให้เจือจาง 1: 100 ใช้ PBS) เพิ่มขึ้น แผ่นได้รับอนุญาตให้ยืนสำหรับ h 1 ที่ 37 ° C ล้าง ด้วย PBS ต.สามครั้ง แล้ว 100 μL ของแอนติบอดี IgG กลวง มี peroxidase horseradish (GeNei อินเดีย ยกเว้น 1:2000 ใน PBS) กระต่ายป้องกันแพะที่เพิ่มในแต่ละดี และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ 1 h จานอีกถูกล้าง ด้วย PBS ต.สามครั้ง 100 μL 3, 3′, 5 เพิ่มสีพัฒนา benzidine 5′ tetramethyl (GeNei อินเดีย) ผสมกับ 0.1% (v/v) ของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ หยุดปฏิกิริยา โดยการเพิ่ม μL 25 ของ 1 M กรดซัลฟุริก มีที่วัดความหนาแน่นออปติคอล 450 nm ค่า absorbance หมายความว่าของดีแต่ละที่ใช้แสดงระดับแอนติบอดีเซรั่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 เฉพาะการตอบสนองภูมิคุ้มกัน
ดาวน์โหลด . เอนไซม์ที่เชื่อมโยง immunosorbant assay ( ELISA )
เซรั่มแอนติบอดีตอบสนอง . ในการวัดโดยวิธี ELISA ที่อธิบายโดย delamare et al . ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย [ 19 ] [ 20 ] ไมโครแบน bottomed จานเคลือบ ( 100 μ L / ดี ) เซลล์แบคทีเรียทั้ง แบคทีเรียถูกเก็บเกี่ยวจากคืนก่อนหน้านี้ของเหลววัฒนธรรมซักสามครั้งกับ 0.15 mol / L NaCl สารละลายปรับ 3 × 106 cfu ใน 0.05 M คาร์บอเนต ไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ pH 9.6 ) จานบ่มค้างคืนที่ 4 ° C ซักสามครั้งกับ PBS ที่มี 0.05 % ( v / v ) Tween 20 ( pbs-t ) ไม่เฉพาะเจาะจงรวมเว็บไซต์ที่ถูกบล็อกด้วย ( 100 μ L / ดี ) 1% ( w / v ) BSA ใน PBS จานบ่มที่อุณหภูมิ 28 องศา C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วล้างด้วย pbs-t. สามครั้งในแต่ละคือ100 μผมทดสอบตัวอย่างซีรั่ม ( ประมาณ 1 : 30 ใน pbs-t ) คือการเพิ่มและบ่มที่อุณหภูมิ 28 องศา C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ; จานซักสามครั้งกับ pbs-t. ในแต่ละดี 100 μ l กระต่าย anti ปลากระโห้อินเดียแอนติบอดีโพลี ( ที่ผลิตในห้องปฏิบัติการของเราใช้เจือจาง 1 : 100 PBS ) ถูกเพิ่มเข้ามา จานได้รับอนุญาตให้ยืนเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศา C ; ล้างสามครั้งกับ pbs-t.แล้ว 100 μผมแพะกระต่าย IgG conjugated กับแอนติบอดีต่อต้าน มะรุม เปอร์ออกซิเดส ( genei , อินเดีย , เจือจาง 1:2000 ใน PBS ) ที่ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละอย่างดีและบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จานอีกซักสามครั้งกับ pbs-t. 100 μ L 3 , 3 ได้รับ 5 , 5 ’ - ผล ( genei เบนซิดีนอินเดีย ) ผสมกับ 0.1 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) ของ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ได้เพิ่มการพัฒนาสีปฏิกิริยาที่ถูกหยุดโดยการเพิ่ม 25 μ l กรดกำมะถัน 1 M . ความหนาแน่นของแสง คือ วัดที่ 450 nm . หมายถึงค่าแต่ละค่าเป็นอย่างดีใช้แสดงระดับแอนติบอดีในเลือด