Immobilization of affinity ligands

Immobilization of affinity ligands on supporting matrices is a key step for the preparation of affinity chromatography resins, and an efficient coupling strategy can significantly improve the validity and cost of the affinity system, especially for systems that employ expensive recombinant proteins or antibodies as affinity ligands. This study described a simple method for obtaining site-specific immobilization of protein A (the ligand) via aldehyde-hydrazide conjugation and its application in antibody purification via protein A chromatography. An aldehyde group was generated at the N-terminus of protein A in vivo by co-expressing a formylglycine-generating enzyme (FGE) and recombinant protein A containing a FGE recognizing sequence (aldehyde tag) in Escherichia coli. The resulting aldehyde allowed direct immobilization of protein A onto the hydrazide-modified agarose matrices under mild condition. We found that 100 mM aniline was most effective for catalyzing the coupling reaction, and the recombinant protein A could be coupled with high selectivity, directly from a crude cell extract. The site-specific immobilized protein A showed good capacity for antibody purification. The specificity of the aldehyde-hydrazide reaction not only allowed site-specific immobilization of affinity ligands, but also improved the cost of the process by employing unpurified ligands, a method that might be of great use to industrial applications.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตรึงโป ligands ความสัมพันธ์สนับสนุนเมทริกซ์เป็นขั้นตอนสำคัญสำหรับการเตรียมของเรซิ่น chromatography ความสัมพันธ์ และกลยุทธ์การคลัปมีประสิทธิภาพมากช่วยให้มีผลบังคับใช้และต้นทุนของระบบความสัมพันธ์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับระบบที่ใช้ recombinant โปรตีนราคาแพงหรือแอนตี้เป็น ligands ความสัมพันธ์ การศึกษานี้อธิบายวิธีง่าย ๆ สำหรับการได้รับเฉพาะตรึงโปโปรตีน A (ลิแกนด์) ผ่าน conjugation hydrazide แอลดีไฮด์และการประยุกต์ในแอนติบอดีฟอกผ่าน chromatography โปรตีน A กลุ่มแอลดีไฮด์ถูกสร้างขึ้นที่นัส N โปรตีน A ในสัตว์ทดลอง โดยร่วมแสดงกับ formylglycine สร้างเอนไซม์ (FGE) และ recombinant โปรตีนที่ประกอบด้วยการจดจำลำดับ (แอลดีไฮด์แท็ก) ใน Escherichia coli FGE แอลดีไฮด์ที่เกิดโดยตรงตรึงโปโปรตีน A บนเมทริกซ์ agarose hydrazide แก้ไขภายใต้เงื่อนไขที่ไม่รุนแรงได้ เราพบว่า aniline 100 มม.มีประสิทธิภาพสูงสุดสำหรับ catalyzing ปฏิกิริยาคลัป และ recombinant โปรตีน A สามารถควบคู่กับวิธีสูง ตรงจากสารสกัดน้ำมันเซลล์ เฉพาะการตรึงโปรตีนแอนติบอดีฟอกดีจุแสดง Specificity ของแอลดีไฮด์-hydrazide ปฏิกิริยาไม่เพียงได้ตรึงโป ligands ความสัมพันธ์เฉพาะ แต่ยัง พัฒนาต้นทุนของกระบวนการ โดยใช้ unpurified ligands วิธีการที่ใช้มากในงานอุตสาหกรรม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การตรึงแกนด์ความสัมพันธ์ในการสนับสนุนการฝึกอบรมเป็นขั้นตอนสำคัญในการจัดทำเรซิ่นโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดและเป็นกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพการมีเพศสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญสามารถปรับปรุงความถูกต้องและค่าใช้จ่ายของระบบความสัมพันธ์โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับระบบที่ใช้โปรตีนมีราคาแพงหรือแอนติบอดีเป็นแกนด์ความสัมพันธ์ การศึกษาครั้งนี้อธิบายวิธีการที่ง่ายสำหรับการได้รับการตรึงเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงของโปรตีน A (ลิแกนด์) ผ่านผันลดีไฮด์-hydrazide และการประยุกต์ใช้ในการทำให้บริสุทธิ์แอนติบอดีผ่านโปรตีนโค กลุ่มลดีไฮด์ถูกสร้างขึ้นที่ N-ปลายทางของโปรตีนในร่างกายโดยการร่วมแสดงความเอนไซม์ formylglycine สร้าง (FGE) และโปรตีนที่มี FGE ตระหนักถึงลำดับ (แท็กลดีไฮด์) ในเชื้อ Escherichia coli ลดีไฮด์ส่งผลให้ได้รับอนุญาตให้ตรึงโดยตรงของโปรตีนบนเมทริกซ์ agarose hydrazide แก้ไขภายใต้เงื่อนไขที่ไม่รุนแรง เราพบว่า 100 มิลลิสวรรค์มีประสิทธิภาพมากที่สุดสำหรับการเร่งปฏิกิริยาการมีเพศสัมพันธ์และโปรตีนรีคอมบิแนอาจจะควบคู่ไปกับการเลือกสูงโดยตรงจากสารสกัดจากเซลล์น้ำมันดิบ เว็บไซต์เฉพาะโปรตีนตรึงแสดงให้เห็นความสามารถในการที่ดีสำหรับการทำให้บริสุทธิ์แอนติบอดี ความจำเพาะของลดีไฮด์-hydrazide ปฏิกิริยาไม่ได้รับอนุญาตเท่านั้นตรึงเว็บไซต์ที่เฉพาะเจาะจงของความสัมพันธ์แกนด์ แต่ยังมีการปรับปรุงค่าใช้จ่ายของกระบวนการโดยใช้แกนด์ unpurified, วิธีการที่อาจจะมีการใช้งานที่ดีเพื่อการใช้งานอุตสาหกรรม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผลของกลุ่มสนับสนุนลิแกนด์ในเมทริกซ์เป็นขั้นตอนสำคัญสำหรับการเตรียมการของเรซินี่ 6 และกลยุทธ์การเชื่อมต่อที่มีประสิทธิภาพสามารถปรับปรุงความถูกต้องและค่าใช้จ่ายของระบบความสัมพันธ์ โดยเฉพาะระบบที่ใช้โปรตีนรีคอมบิแนนท์แพงหรือแอนติบอดีเป็นพี่น้องกันปกติ .การศึกษานี้อธิบายวิธีการง่ายๆสำหรับการได้รับการผลิตเฉพาะของโปรตีน ( ลิแกนด์ ) ผ่านการไฮดราไซด์ aldehydes และการประยุกต์ใช้ในแอนติบอดีโปรตีนบริสุทธิ์ผ่านโครมาโตกราฟีเป็นอัลดีไฮด์กลุ่มยีนสร้างโปรตีนในร่างกาย โดยแสดง formylglycine สร้างเอนไซม์ CO ( fge ) และรีคอมบิแนนท์โปรตีนที่มี fge จำลำดับ ( aldehydes แท็ก ) ใน Escherichia coli ผลโดยตรงของอัลดีไฮด์อนุญาตการตรึงโปรตีนบนไฮดราไซด์แบบเมทริกซ์ ( ภายใต้ภาวะที่ไม่รุนแรงเราพบว่ามันมีประสิทธิภาพมากที่สุดสำหรับการ 100 มิลลิเมตร และการเชื่อมต่อของปฏิกิริยา และรีคอมบิแนนท์โปรตีนอาจจะควบคู่ไปกับการสูง โดยตรงจากสารสกัดเซลล์ดิบ โดยเฉพาะการตรึงโปรตีนว่าผลิตแอนติบอดี บริสุทธิ์ ความจำเพาะของ aldehydes ไฮดราไซด์ปฏิกิริยาการตรึงไม่อนุญาตให้เฉพาะทางเฉพาะของลิแกนด์แต่ยังเพิ่มต้นทุนของกระบวนการ โดยการใช้ unpurified ลิแกนด์ วิธีการที่อาจจะใช้ดีอุตสาหกรรม