Protoplasts were isolated enzymatic

Protoplasts were isolated enzymatically from cell suspensions 4 d post-subculture and their viability determined by the uptake of fluorescein diacetate (FDA) (Widholm, 1972). In initial experiments, protoplasts were suspended at a final density of 2 x 10” ml-’ in 3 ml aliquots of KPR medium made semi-solid with 0.4% (w/v) Sea Plaque agarose (Thompson et al., 1986). Protoplasts were transferred, prior to gelling of the medium, to 30 ml glass screw-capped bottles (Beatson Clark and Co. Ltd., Rotherham, UK) either alone (control) or over 6 ml aliquots of sterile perfluorodecalin (Flutec” PP.5; BNFL Fluorochemicals Ltd., Preston, UK). The latter was saturated with oxygen (10 mbar; 15 min) prior to being overlaid with protoplasts in the agarose medium. Cultures were incubated in the dark at 28 + 1°C. After 21 d, the aliquots of agarose-medium containing the embedded protoplasts were divided into 4 equal segments. All 4 segments were transferred to a 5 cm Petri dish
containing 3 ml of liquid KPR medium and the dish sealed with Nescofilm (Bando Chemical Industries Ltd., Kobe. Japan). Cultures were incubated as before for a further 14 d, at which time protoplast-derived colonies were visible. All experiments were replicated 3 times. In a variation of this protocol, which was developed primarily to improve and to simplify the handling procedure during culture, the 30 ml glass bottles were replaced with tissue culture plates each with 24 circular wells (Costar Corporation, Cambridge, USA). Each well contained either 1 ml of 0.4% (w/v) Sea Plaque agarose-solidified KPR medium with embedded protoplasts (control) or 1 ml of the same protoplast suspension over 2 ml of oxygenated PFC. The dishes were sealed with Nescofilm. After 7

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

protoplasts ถูกแยกเอนไซม์จากเซลล์แขวนลอย 4 d โพสต์วัฒนธรรมและความมีชีวิตของพวกเขาถูกกำหนดโดยการดูดซึมของ fluorescein diacetate (FDA) (Widholm, 1972) ในการทดลองครั้งแรก protoplasts ที่ถูกระงับความหนาแน่นสุดท้ายของ 2 x 10 "ml- ใน 3 มล. aliquots ของกลาง KPR ทำกึ่งของแข็งที่มี 0.4% (w / v) ทะเลโล่ agarose (ธ อมป์สัน et al., 1986) protoplasts ถูกย้ายก่อนที่จะก่อเจลของกลาง 30 มล. ขวดแก้วสกรูปกคลุม (Beatson คลาร์กและ จำกัด ปาร์คสหราชอาณาจักร) เพียงอย่างเดียว (ควบคุม) หรือมากกว่า 6 มล. aliquots ของ perfluorodecalin หมัน (Flutec "พีพี 5; BNFL fluorochemicals จำกัด เพรสตันสหราชอาณาจักร) หลังถูกอิ่มตัวกับออกซิเจน (10 เอ็มบาร์ 15 นาที) ก่อนที่จะถูกบุด้วย protoplasts ในกลาง agarose วัฒนธรรมถูกบ่มในที่มืดวันที่ 28 + 1 องศาเซลเซียส หลังจาก 21 D, aliquots ของกลาง agarose มี protoplasts ฝังตัวถูกแบ่งออกเป็น 4 ส่วนเท่ากัน ทั้งหมด 4 ส่วนถูกย้ายไป 5 ซม. จานเลี้ยงเชื้อ
ที่มี 3 มล. ของกลาง KPR เหลวและจานปิดผนึกด้วย Nescofilm (Bando เคมีอุตสาหกรรม จำกัด , โกเบ. ญี่ปุ่น) วัฒนธรรมถูกบ่มเป็นมาก่อนอีก 14 วันเวลาที่โปรโตพลาอาณานิคมมาได้รับการมองเห็น การทดลองทั้งหมดถูกจำลองแบบ 3 ครั้ง ในรูปแบบของโปรโตคอลนี้ซึ่งได้รับการพัฒนาเป็นหลักในการเพิ่มประสิทธิภาพและลดความซับซ้อนของขั้นตอนการจัดการระหว่างวัฒนธรรม 30 มล. ขวดแก้วถูกแทนที่ด้วยจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อแต่ละคนมี 24 หลุมวงกลม (Costar คอร์ปอเรชั่นเคมบริดจ์, สหรัฐอเมริกา) แต่ละคนมีดีทั้งแบบ 1 มล. 0.4% (w / v) ทะเลโล่ agarose-ผลึกขนาดกลาง KPR กับ protoplasts ฝังตัว (ควบคุม) หรือ 1 มิลลิลิตรของโปรโตพลาระงับเดียวกันซ้ำ 2 มิลลิลิตรของออกซิเจนฉิบหาย อาหารถูกปิดผนึกด้วย Nescofilm หลังจากที่ 7

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ที่แยกได้จากเซลล์แขวนลอยพบว่า enzymatically 4 D โพสต์และความมีชีวิตของวัฒนธรรมย่อย โดยพิจารณาการี่ ได ซิเตท ( FDA ) ( widholm , 1972 ) ในการทดลองเบื้องต้นพบว่าถูกระงับในขั้นสุดท้ายความหนาแน่น 2 x 10 " มล. - ' 3 ml เฉยๆของ kpr กลางทำกึ่งของแข็งด้วย 0.4 % ( w / v ) หินปูน ( ทะเล ( Thompson et al . , 1986 ) พบว่าย้ายไปก่อนที่จะ gelling ของปานกลางเพื่อ 30 ml ขวดแก้วฝาครอบสกรู ( beatson คลาร์กและจำกัด ของ UK ) คนเดียว ( ควบคุม ) หรือกว่า 6 ml เฉยๆของ perfluorodecalin เป็นหมัน ( flutec " pp.5 ; bnfl fluorochemicals จำกัด , เพรสตัน , UK ) หลังถูกอิ่มตัวกับออกซิเจน ( mbar ; 15 นาที 10 ) ก่อนที่จะถูกหุ้มด้วยเอนไซม์ใน , ปานกลางวัฒนธรรมที่ถูกเลี้ยงในที่มืดที่ 28 1 องศา หลัง 21 D , เฉยๆ , ฝังตัวของอาหารที่มีเอนไซม์แบ่งออกเป็น 4 ส่วนเท่ากัน ทั้งหมด 4 ส่วน ถูกย้ายไป 5 ซม. จานเพาะเชื้อ
ที่มี 3 มล. ของ kpr ขนาดกลางและจานปิดผนึกด้วย nescofilm ของเหลว ( Bando เคมีอุตสาหกรรม จำกัด , โกเบ ญี่ปุ่น ) วัฒนธรรมที่ถูกบ่มไว้ เพื่ออีก 14 วันเวลาที่โปรได้มาอาณานิคมได้ถูกมองเห็น ทั้งหมดทดลองซ้ำ 3 ครั้ง ในรูปแบบของโปรโตคอลนี้ซึ่งได้รับการพัฒนาเป็นหลักเพื่อปรับปรุงและลดความซับซ้อนของการจัดการกระบวนการระหว่างวัฒนธรรม 30 ml ขวดแก้วถูกแทนที่ด้วยเนื้อเยื่อแผ่นละ 24 วงกลมเวลส์ ( COSTAR Corporation , เคมบริดจ์ , สหรัฐอเมริกา ) แต่ละคนก็มีทั้ง 1 ml เท่ากับ 04 % ( w / v ) ทะเลจุลินทรีย์ก้อน ( kpr กลางกับจริงฝังตัว ( ควบคุม ) หรือ 1 มิลลิลิตร ระงับโปรเดียวกันมากกว่า 2 ml ของออกซิเจน PFC . อาหารถูกผนึกด้วย nescofilm . หลังจาก 7