5. 4 Collection and Subculture of E

5. 4 Collection and Subculture of Euglena ทรานสฟอร์แมนต์

Cells subjected to drug selection were collected as
follows. Culture was performed on the selective plate medium at
27°C for about 2 weeks, and lawn-like cells on the plate were
suspended in 5 ml of sterile water to collect the cells. The
cells in the cell สารแขวนลอย were counted, and the cells (0.5x106
cells) were cultured again in a selective plate medium (25 µg/ml
or 50 µg/ml of ซีโอซิน, 100 µg/ml of ซีโฟแทกซีม). After growth,
the cells were suspended and cultured again in the selective
plate medium. The initial number of cells in culture was reduced from 0.5x106 cells in a stepwise manner with each passage. After several passages, a single โคโลนี formed on the selective plate medium was collected and cultured in 3 ml of selective liquid
medium (50 lag/ml of ซีโอซิน, 50 µg/ml of ซีโฟแทกซีม), the cells
that showed good growth were used as an isolated Euglena ทรานสฟอร์แมนต์.
5. 5 Investigating the Stability of Introduced Trait in Euglena ทรานสฟอร์แมนต์
The cells were repeatedly subcultured in a KH liquid
medium containing 50 [tg/ml of ซีโอซิน, and the resulting cells
were repeatedly subcultured in a ซีโอซิน-free KH liquid medium for
the number of the times indicated in Figs. 14 and 15. The
subculturing was performed by transferring 1/150 the amount of cells into a fresh KH liquid medium every week.
The thus-obtained cells, which had not been exposed to
the drug for a certain period of time, were cultured again in a
KH liquid medium containing 50 jig/ml of ซีโอซิน, and their growth was investigated.
[0067]

The cells that continued to be cultured in the absence
of ซีโอซิน for a certain period of time were also used in the
following DNA or RNA analysis.
[0068]
5. 6 Detection of Introduced Gene
5. 6. 1 Total DNA Extraction from Euglena ทรานสฟอร์แมนต์
The Euglena ทรานสฟอร์แมนต์ was cultured in a ซีโอซิน-
containing medium or a ซีโอซิน-free medium for 4 to 5 days,
collected by centrifugation, and washed twice with PBS(-) (the
composition of 10xPBS(-) is shown in Table 5) . The resulting
ทรานสฟอร์แมนต์ was suspended in NTES (Table 6) in an amount that
was three to four times the volume of the cells and heated at 65°C
for 10 minutes. Further, the same amount of PCI was added,

followed by vigorous stirring and centrifugation (17,400xg, 4°C, 5
min). To the supernatant collected from this, an equal amount of
PCI was added, followed by stirring. Centrifugation was then
performed again. To the collected supernatant, a 1/10-fold amount
of 3M NaOAc was added. After inverting several times, a 2.5-fold
amount of 100 ethanol was added, followed by mixing. The
resulting mixture was allowed to stand at room temperature for 15
minutes and subjected to centrifugation (11,100xg, 4°C, 5 min).
The supernatant was completely removed, and the precipitate was






washed with 1 ml of 70% ethanol. The precipitate was air-dried at room temperature and dissolved in 20 µg/ml of a TE buffer
containing RNase A, followed by RNA degradation at 37°C overnight. The obtained solution was used as a total DNA solution.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5. 4 การเก็บรวบรวมและวัฒนธรรมของยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์เซลล์ยัดเยียดให้เลือกยาเสพติดที่ถูกเก็บรวบรวมเป็นดังต่อไปนี้ วัฒนธรรมได้ดำเนินการในสื่อเลือกแผ่นที่27 องศาเซลเซียสเป็นเวลาประมาณ 2 สัปดาห์และเซลล์สนามหญ้าเหมือนบนจานที่ถูกระงับใน 5 ml ของน้ำผ่านการฆ่าเชื้อในการเก็บรวบรวมเซลล์ เซลล์ในเซลล์สารแขวนลอยนับและเซลล์ (0.5x106 เซลล์) มาเลี้ยงอีกครั้งในกลางแผ่นเลือก (25 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรหรือ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรซีโอซิน 100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรซีโฟแท กซีม) หลังจากที่การเจริญเติบโตของเซลล์ที่ถูกระงับการเพาะเลี้ยงและอีกครั้งในการเลือกสื่อแผ่น จำนวนเริ่มต้นของเซลล์ในวัฒนธรรมลดลงจาก 0.5x106 เซลล์ในลักษณะแบบขั้นตอนด้วยเนื้อเรื่องแต่ละ หลังจากหลายทางเดินเดี่ยวโคโลนีที่เกิดขึ้นในสื่อแผ่นเลือกที่ถูกเก็บรวบรวมและเพาะเลี้ยงใน 3 มล. ของของเหลวเลือกขนาดกลาง (50 ล่าช้า / มิลลิลิตรซีโอซิน 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรซีโฟแทกซีม) เซลล์ที่แสดงให้เห็นการเติบโตที่ดีถูกนำมาใช้เป็นยูกลีนาแยกทรานสฟอร์แมนต์. 5 5 ตรวจสอบเสถียรภาพของลักษณะแนะนำในยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์เซลล์ที่ถูกเลี้ยงซ้ำในของเหลว KH กลางมี 50 [TG / มิลลิลิตรซีโอซินและเซลล์ที่เกิดซ้ำ ๆ ถูกเลี้ยงในซีโอ ซินฟรี KH ของเหลวกลางจำนวนครั้งที่ระบุไว้ในมะเดื่อ 14 และ 15 ได้ดำเนินการถ่ายเชื้อโดยการโอน 1/150 จำนวนของเซลล์ลงในอาหารเหลว KH สดทุกสัปดาห์. เซลล์จึง-ได้ซึ่งไม่ได้รับการสัมผัสกับยาเสพติดในช่วงเวลาหนึ่งของเวลาที่ได้รับการเพาะเลี้ยงอีกครั้ง ในอาหารเหลวที่มี KH 50 จิ๊ก / มลซีโอซินและการเจริญเติบโตของพวกเขาได้รับการตรวจสอบ. [0067] เซลล์ที่ยังคงถูกเลี้ยงในกรณีที่ไม่มีของซีโอซินเป็นระยะเวลาหนึ่งของเวลาที่ยังถูกนำมาใช้ในการดีเอ็นเอต่อไปหรือการวิเคราะห์ RNA. [0068] 5 6 การตรวจหายีนแนะนำ5 6. 1 รวมการสกัดดีเอ็นเอจากยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์ยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์เป็นที่เลี้ยงในซีโอซิน - ที่มีขนาดกลางหรือซีโอซินฟรีสื่อกลางในการ 4-5 วันที่เก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงและล้างครั้งที่สองกับพีบีเอส (-) ( องค์ประกอบของ 10xPBS (-) จะแสดงในตารางที่ 5) ส่งผลให้ทรานสฟอร์แมนต์ถูกระงับใน NTES (ตารางที่ 6) ในจำนวนเงินที่เป็น 3-4 ครั้งปริมาณของเซลล์และให้ความร้อนที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที นอกจากนี้จำนวนเงินเดียวกันของ PCI ที่เพิ่มขึ้นตามมาด้วยการกวนแข็งแรงและมีการหมุนเหวี่ยง (17,400xg 4 องศาเซลเซียส 5 นาที) เพื่อใสที่รวบรวมจากนี้จำนวนเงินที่เท่ากันของPCI ถูกเพิ่มเข้ามาตามด้วยการกวน ปั่นแล้วได้รับการดำเนินการอีกครั้ง เพื่อเก็บรวบรวมใส, 1 / จำนวน 10 เท่าของ 3M NaOAc ถูกเพิ่มเข้ามา หลังจากที่กลับหัวหลายครั้ง 2.5 เท่าจำนวน 100 เอทานอลที่เพิ่มขึ้นตามมาด้วยการผสม ส่วนผสมที่เกิดได้รับอนุญาตให้ยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาทีและอยู่ภายใต้การหมุนเหวี่ยง (11,100xg 4 องศาเซลเซียส 5 นาที). ใสถูกลบออกอย่างสมบูรณ์และตะกอนที่ถูกล้างด้วย 1 มิลลิลิตรของเอทานอล 70% ตะกอนเป็นอากาศแห้งที่อุณหภูมิห้องและละลายใน 20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรบัฟเฟอร์ TE มี RNase ตามด้วยการย่อยสลายอาร์เอ็นเอที่ 37 ° C ในชั่วข้ามคืน วิธีการแก้ปัญหาที่ได้ถูกนำมาใช้เป็นวิธีการแก้ปัญหาดีเอ็นเอทั้งหมด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

5 4 คอลเลกชันและวัฒนธรรมย่อยของยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์

เซลล์ภายใต้การคัดเลือกยาถูกรวบรวมเป็น
1 วัฒนธรรมมีการใช้จานกลางที่
27 °องศาเซลเซียสเป็นเวลาประมาณ 2 สัปดาห์ และสนามหญ้า เช่น เซลล์บนแผ่น
แขวนลอยใน 5 มิลลิลิตร น้ำหมัน เพื่อเก็บเซลล์
เซลล์ในเซลล์สารแขวนลอยถูกนับและเซลล์ ( 0.5x106
เซลล์เพาะเลี้ยงอีกครั้งในกลางแผ่นงาน ( 25 µ g / ml
หรือ 50 µ g / ml ซีโอซิน 100 µ g / ml ซีโฟแทกซีม ) หลังจากการเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย
) และอีกครั้งในกลางจานเลือก

เริ่มต้นจำนวนเซลล์ในวัฒนธรรมลดลงจาก 0.5x106 เซลล์ในลักษณะที่คนแต่ละช่องทาง หลังจากหลายหัวข้อเป็นโคโลนีเดียวที่เกิดขึ้นกลางจานเลือกรวบรวมและเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลว
เลือก 3 มิลลิลิตร ( 50 ล่าช้า / ml ซีโอซิน 50 µ g / ml ซีโฟแทกซีม ) เซลล์มีการเจริญเติบโตดี
ที่ถูกใช้เป็นแยกยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์ .
5 5 ตรวจสอบความมั่นคงของยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์
แนะนำคุณลักษณะในเซลล์ก็ซ้ำๆ subcultured ใน KH เหลว
ขนาดกลางที่มี 50 [ TG / ml ซีโอซินและเกิดเป็นซ้ำ ๆในเซลล์
subcultured ซีโอซิน - KH ฟรีอาหารเหลวสำหรับ
จำนวนครั้งที่พบในผลมะเดื่อ . 14 และ 15
การกระทำโดยการโอน 1 / 150 จำนวนเซลล์ใน KH สดอาหารเหลวทุกสัปดาห์
จึงได้เซลล์ซึ่งไม่ได้รับการเปิดเผย
ยาสำหรับระยะเวลาหนึ่งของเวลาที่ถูกเลี้ยงในอีก
KH อาหารเหลวที่มีปริมาณมากซีโอซิน 50 มิลลิลิตร และการเจริญเติบโตของพวกเขาถูกตรวจสอบ 0067
[ ]

เซลล์ที่ยังคงมีเลี้ยงในการขาดงานของซีโอซิน
สำหรับระยะเวลาหนึ่งของเวลา นอกจากนี้ยังใช้ในการวิเคราะห์ DNA หรือ RNA ต่อไป
.
[ ]
0068 5 6 ตรวจสอบแนะนำยีน
5 6 .1 รวมการสกัดดีเอ็นเอจากห้วยทรายทรานสฟอร์แมนต์
ยูกลีนาทรานสฟอร์แมนต์เลี้ยงในซีโอซิน -
ที่มีขนาดกลาง หรือซีโอซิน - กลางฟรีสำหรับ 4 ถึง 5 วัน โดยปั่น
เก็บและล้างสองครั้งกับ PBS ( (
- ) องค์ประกอบของ 10xpbs ( - ) แสดงดังตารางที่ 5 )
ผลทรานสฟอร์แมนต์ถูกระงับใน ntes ( ตารางที่ 6 ) ในจํานวนนั้น
เป็นสามถึงสี่เท่าของปริมาตรของเซลล์และอุณหภูมิ 65 องศา C
เป็นเวลา 10 นาที นอกจากนี้จำนวนเงินเดียวกันของ PCI คือเพิ่ม

ตามด้วยคึกคักตื่นเต้นและปั่น ( 17400xg 4 ° C , 5
มิน ) ให้นำจำนวนนี้ เป็นจํานวนเท่าของ
PCI เพิ่มตามด้วย ตื่นเต้นปั่นแล้ว
อีกครั้ง เพื่อรวบรวมนำ , 1 / 10 เท่าจํานวน
ของ 3M naoac ถูกเพิ่มเข้ามา หลังจากกลับหัวหลายครั้ง 2.5-fold
ปริมาณเอทานอล 100 ก็เพิ่มตามด้วยการผสม
ผลส่วนผสมถูกปล่อยให้ยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที และต้องปั่น
( 11100xg 4 ° C ,
5 นาที ) นำมันออกและตกตะกอนอยู่






ซัก 1 มล. ของแอลกอฮอล์ 70% ที่เป็นอากาศแห้งที่อุณหภูมิห้องและละลายใน 20 µ g / ml ของ TE buffer
ที่มีเลส , ตามด้วยการย่อยสลาย RNA ที่ 37 ° C ในชั่วข้ามคืน นำสารละลายที่ใช้เป็นสารละลายดีเอ็นเอทั้งหมด .