For the time course experiments, K5

For the time course experiments, K562 cells (50 × 106/ml) were preincubated for 30 min at 37 °C without or with 500 μM DIDS and then 100 μl aliquots were incubated with 1 mM ABA for 0.5, 5, 10, 15 min at 22 °C.

NCTC 2544 cells were trypsinized and resuspended in HBSS (50 × 106/ml) and incubated with 1 mM ABA for 0.5, 5, 15, 30 min at 22 °C. ABA influx into K562 and NCTC 2544 was detected by HPLC analysis as described in Vigliarolo et al. (2015).

In the chloride-free experiments, 100 μl aliquots of K562 were washed 4 times with Na-citrate buffer, the cells were resuspended in HBSS or in Na-citrate buffer and then incubated in triplicate with 100 nM [3H]ABA at 22 °C for 5 min in the presence or absence of 100 mM NaCl. The intracellular radioactivity of the samples was estimated as above.

K562 transfected without (Ctrl) and with (siNC) or with AE2 siRNA were washed, resuspended in HBSS (30 × 106/ml) and incubated with 1 mM ABA at 22 °C for 5 min. ABA influx was estimated by HPLC analysis as above.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ครั้งที่ทดลองการหลักสูตร K562 เซลล์ (50 × 106/มิลลิลิตร) ถูก preincubated 30 นาทีที่ 37 ° C โดยไม่มี หรือ มี 500 ไมครอน DIDS และ aliquots μl 100 แล้วได้รับการกกกับ ABA 1 มม. 0.5, 5, 10, 15 นาทีที่ 22 องศาเซลเซียสเซลล์ NCTC 2544 trypsinized และ resuspended ใน HBSS (50 × 106/มิลลิลิตร) และรับการกกกับ 1 มม. ABA 0.5, 5, 15, 30 นาทีที่อุณหภูมิ 22 องศาเซลเซียส ไหลเข้า ABA K562 และ NCTC 2544 ตรวจพบ โดยการวิเคราะห์ HPLC ตามที่อธิบายไว้ใน Vigliarolo et al. (2015)ในการทดลองที่ปราศจากคลอไรด์ 100 μl aliquots ของ K562 ถูกล้าง 4 ครั้ง ด้วยนาซิเตรตบัฟเฟอร์ resuspended HBSS หรือ ในนาซิเตรตบัฟเฟอร์แล้ว รับการกกลข้อกับ 100 nM [3H] ABA ที่ 22 ° C สำหรับ 5 นาทีในการมีหรือไม่มีของ 100 มม. NaCl เซลล์ กัมมันตภาพรังสีภายในเซลล์ตัวอย่างได้ประมาณดังกล่าวK562 transfected โดย (Ctrl) และ มี (ฮ็อตซิงก์) หรือกับ AE2 siRNA ล้าง resuspended ใน HBSS (30 × 106/มิลลิลิตร) และได้รับการกกกับ 1 มม. ABA ที่ 22 ° C สำหรับประมาณอีก 5 นาที ABA โดย HPLC ในการวิเคราะห์ดังกล่าวข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับเวลาการทดลองหลักสูตรเซลล์ K562 (50 × 106 / ml) ถูก preincubated เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสโดยไม่ต้องหรือ 500 ไมครอน DIDs แล้ว 100 aliquots ไมโครลิตรถูกบ่ม 1 มิลลิ ABA 0.5, 5, 10, 15 นาที วันที่ 22 ° C.

NCTC 2544 เซลล์ถูก trypsinized และ resuspended ใน HBSS (50 × 106 / ml) และบ่ม 1 มิลลิ ABA 0.5, 5, 15, 30 นาทีที่ 22 ° C ABA ไหลบ่าเข้ามาลงใน K562 และ NCTC 2544 ถูกตรวจพบโดยการวิเคราะห์ HPLC ที่อธิบายไว้ใน Vigliarolo et al, (2015).

ในการทดลองคลอไรด์ฟรี 100 aliquots ไมโครลิตรของ K562 ถูกล้างครั้งที่ 4 กับบัฟเฟอร์นาซิเตรตเซลล์ที่ถูก resuspended ใน HBSS หรือในบัฟเฟอร์นาซิเตรตและบ่มในเพิ่มขึ้นสามเท่ากับ 100 นาโนเมตร [3H] ABA แล้ว วันที่ 22 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีในการมีหรือไม่มี 100 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์ กัมมันตภาพรังสีภายในเซลล์ของกลุ่มตัวอย่างเป็นที่คาดกันไว้ข้างต้น.

K562 transfected โดยไม่ต้อง (Ctrl) และ (sinc) หรือ AE2 siRNA ถูกล้าง resuspended ใน HBSS (30 × 106 / ml) และบ่ม 1 มิลลิ ABA ที่ 22 องศาเซลเซียส 5 นาที ABA ไหลบ่าเข้ามาได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์ HPLC ดังกล่าวข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับเวลาที่แน่นอน โดย k562 ( 50 × 106 เซลล์ / มิลลิลิตร preincubated สำหรับ 30 นาทีที่ 37 องศา C ไม่มีหรือมีμ M DIDS 500 และ 100 μผมเฉยๆถูกบ่มกับ 1 มม. ABA สำหรับ 0 , 5 , 10 , 15 นาทีที่ 22 องศาnctc 2544 cells และ trypsinized resuspended ใน hbss ( 50 × 106 / มิลลิลิตร ) และแยก 1 0.5 มม. 2 , 5 , 15 , 30 นาทีที่ 22 องศา และ ABA เข้า k562 nctc 2544 ตรวจพบโดยการวิเคราะห์ HPLC ตามที่อธิบายไว้ใน vigliarolo et al . ( 2015 )ในการทดลองคลอไรด์ฟรี 100 μผมเฉยๆของ k562 ถูกล้าง 4 ครั้ง กับ นา ซิเตรตบัฟเฟอร์ เซลล์ก็ resuspended ใน hbss หรือในนา บัฟเฟอร์ซิแล้วบ่มทั้งสามใบ กับ 100 nm [ 3H ] ABA ที่ 22 ° C เป็นเวลา 5 นาทีในการแสดงตนหรือขาดของ NaCl 100 มม. กัมมันตภาพรังสีของตัวอย่าง การประมาณเป็นข้างต้นk562 transfected โดยไม่ ( Ctrl ) และ ( sinc ) หรือ ae2 บริษัทถูกล้าง resuspended ใน hbss ( 30 × 106 / มิลลิลิตร ) และแยก 1 มม. ABA ที่ 22 องศา C เป็นเวลา 5 นาที โดยการวิเคราะห์ HPLC ABA ไหลเข้าซึ่งเป็นข้างต้น