2.2. Samples and protein extraction

2.2. Samples and protein extraction protocols
2.2.1. Sample origin
The oranges used in this work came from two different varieties
(Navel and Sanguinelli), which were kindly donated by Fontestad
company (Museros, Valencia, Spain). All oranges used in this study
were collected in January 2014 in the Valencian region, Spain.
Three orange juices were also analysed: the first (Z1) was kindly
donated by a Spanish juice manufacturer (Zumos Valencianos del
Mediterráneo S.A.); the second (Z2) was a commercial Spanish
orange juice not from concentrate (Hacendado brand), and the
third (Z3) was a commercial Italian orange juice 100% from concentrate
(Zuegg Skipper brand). Finally, two soft drinks were also
analysed: orange Fanta (Z4, whose label indicated a 12% orange
juice content) and Sanpellegrino Aranciata, an Italian orangeade
(Z5, whose label indicated a 15.6% juice content).
2.2.2. Protein extraction
Before orange protein extraction, the surface of orange fruits
was washed with lukewarm 1% SDS solution, to eliminate bacterial
and surface contamination from human hands. Next, the thin flavedo
peel was carefully excised and reduced to very minute fragments
via a treatment in a fruit blender for 10 min at maximum
power. For exploring the proteomes of both peels and pulp, two
extraction protocols were devised after full homogenisations of
these two tissues. The native extraction buffer contained 50 mM
Tris–HCl (pH 7.2), 50 mM NaCl and 2% (m/v) CHAPS, whereas the
denatured buffer contained additionally 1% (m/v) SDS and 25 mM
DTT dissolved in the same buffer. Protease inhibitor cocktails were
added to both extraction buffers, in order to prevent protein
degradation by protease action. In detail 15 g of minced peel and
75 g of pulp were mixed respectively with 40 mL and 5 mL of each
extraction buffer and gently shaken for 3 h at room temperature
for the native buffer and under boiling conditions for the
denatured one. Finally the homogenates were centrifuged at
18,000 rpm for 10 min.
2.2.3. Combinatorial peptide ligand libraries treatment
After centrifugation, the recovered volumes of both protein
extracts from orange peel and pulp were incubated with combinatorial
peptide ligand libraries (CPLLs): while the native samples
were ready to be incubated with CPLLs, the denatured ones were
diluted 1:10 (v/v) with a buffer containing 50 mM Tris–HCl (pH
7.2), 50 mM NaCl, 25 mM DTT and protease inhibitor cocktail, in
order to reduce the original 1% SDS amount to 0.1% (m/v), so as
to allow an effective protein capture (Fasoli et al., 2010). Peel and
pulp extracts obtained under both native and denatured conditions
were divided into two aliquots prior to CPLL capture, which were
titrated at pH 7.2 using 1 M NaOH and at pH 2.2 by addition of formic
acid and 0.1% TFA. Three technical replicas on two different
biological samples were performed.
For detection of proteinaceous material in the orange juices and
soft drinks, two aliquots of 100 mL for each juice/soft drink were
added to 10 mL of native and denatured extraction buffer after centrifugation
(18,000 rpm for 10 min), in order to eliminate insoluble
materials. One of the aliquots was adjusted to pH 7.2 and the other
one was titrated to pH 2.2 as previously described. Also in this case
the CPLL treatment was performed via gentle shaking overnight at
room temperature at pH 7.2 and pH 2.2. The adsorbed proteins
were then desorbed with a solution containing 4% SDS and
20 mM DTT for 15 min, under boiling conditions (Candiano et al.,
2009). To determine the protein concentration, a Bio-Rad DC protein
assay was performed on pulp and peel extracts, orange juices
and drinks. It was a colorimetric assay based on the Lowry assay,
where proteins create complexes with copper in an alkaline
medium able to reduce the Folin reagent, producing a blue colour

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. ตัวอย่างโปรโตคอลการสกัดโปรตีนและ2.2.1 ตัวอย่างมาส้มที่ใช้ในการทำงานนี้มาจากสองสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน(Navel และ Sanguinelli), ซึ่งได้กรุณาบริจาค โดย Fontestadบริษัท (Museros, Valencia สเปน) ส้มทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้ถูกรวบรวมไว้ในเดือน 2014 มกราคมในภูมิภาควาเลนเซีย ประเทศสเปนนอกจากนี้ยังมี analysed น้ำส้มสาม: แรก (Z1) ได้กรุณาบริจาค โดยผู้ผลิตน้ำสเปน (Zumos Valencianos delMediterráneo S.A.); ที่สอง (Z2) ถูกสเปนค้าน้ำส้มไม่ได้มาจากสมาธิ (ยี่ห้อ Hacendado), และสาม (Z3) ถูกส้มอิตาลีการค้าน้ำผลไม้ 100% เข้มข้น(ยี่ห้อ Zuegg ฟิร่าพาเลส) สุดท้าย สองเครื่องดื่มแนะนำanalysed: แฟนต้าน้ำส้ม (Z4 ป้ายชื่อซึ่งระบุ 12% สีส้มน้ำเนื้อหา) และ Sanpellegrino Aranciata, orangeade อิตาลี(Z5 ป้ายชื่อที่ระบุเนื้อหา 15.6% น้ำ)2.2.2 การโปรตีนสกัดก่อนที่จะแยกโปรตีนส้ม พื้นผิวของผลไม้ส้มถูกล้าง ด้วยอุ่น 1% SDS แก้ไข กำจัดแบคทีเรียและพื้นผิวการปนเปื้อนจากมือมนุษย์ ถัดไป flavedo บางเปลือกอย่าง excised และลดการกระจายตัวมากนาทีผ่านการรักษาใน blender ผลไม้สำหรับ 10 นาทีที่สูงสุดพลังงาน ใน proteomes ทั้ง peels และเยื่อกระดาษ 2แยกโพรโทคอลถูกกำหนดหลังจาก homogenisations เต็มรูปแบบของเนื้อเยื่อเหล่านี้ 2 บัฟเฟอร์สกัดดั้งเดิมอยู่ 50 มม.ทริสเรทติ้ง – HCl (pH 7.2), NaCl 50 มม.และ 2% (m/v) CHAPS ขณะบัฟเฟอร์ denatured อยู่นอกจากนี้ SDS 1% (m/v) และ 25 มม.DTT ละลายในบัฟเฟอร์ที่เดียวกัน ค็อกเทลรติเอสเตอร์ได้บัฟเฟอร์ทั้งสกัด เพิ่มการป้องกันไม่ให้โปรตีนสลายตัว โดยการกระทำรติเอส ในรายละเอียดของเปลือกสับ 15 กรัม และ75 กรัมของเยื่อกระดาษที่ผสมตามลำดับ 40 mL และ 5 mL ของแต่ละแยกบัฟเฟอร์ และเขย่าเบา ๆ สำหรับ h 3 ที่อุณหภูมิห้องสำหรับบัฟเฟอร์ดั้งเดิม และเดือดเงื่อนไขสำหรับการdenatured หนึ่ง สุดท้าย homogenates ถูก centrifuged ที่รอบต่อนาที 18000 สำหรับ 10 นาที2.2.3 การรักษาไลบรารีของลิแกนด์เพปไทด์ปัญหาหลังจาก centrifugation กู้คืนไดรฟ์ข้อมูลของโปรตีนทั้งสองสารสกัดจากเปลือกส้มและเยื่อกระดาษมี incubated กับปัญหาเพปไทด์ลิแกนด์ไลบรารี (CPLLs): ในขณะที่ตัวอย่างดั้งเดิมเขาพร้อมจะเป็น incubated กับ CPLLs ที่ denatured คนได้แตกออก 1:10 (v/v) มีบัฟเฟอร์ประกอบด้วย 50 mM ตรี – HCl (pH7.2), NaCl, 50 มม. 25 มม. DTT และรติเอสเตอร์ค็อกเทล ในสั่งให้ลดจำนวนเงินเริ่มต้น 1% SDS 0.1% (m/v), เพื่อเพื่อให้การจับภาพมีประสิทธิภาพโปรตีน (Fasoli et al., 2010) ลอก และสารสกัดจากเยื่อที่ได้รับภายใต้เงื่อนไขดั้งเดิม และ denaturedถูกแบ่งออกเป็นสอง aliquots ก่อนจับ CPLL ซึ่งtitrated pH 7.2 ใช้ 1 M NaOH และ ที่ pH 2.2 โดยเพิ่ม formicกรด และ 0.1% TFA 3 เทคนิคจำลองสองแตกต่างกันมีดำเนินการตัวอย่างทางชีวภาพตรวจวัสดุ proteinaceous ในน้ำส้ม และมี aliquots สองของ 100 mL สำหรับแต่ละเครื่องดื่มน้ำอัดลม/น้ำดื่มเพิ่ม 10 mL สกัดดั้งเดิม และ denatured บัฟเฟอร์หลัง centrifugation(18000 rpm สำหรับ 10 นาที), การกำจัดไม่ละลายวัสดุ Aliquots อย่างใดอย่างหนึ่งถูกปรับ pH 7.2 และอื่น ๆหนึ่งถูก titrated ให้ pH 2.2 เป็นก่อนหน้านี้อธิบาย นอกจากนี้ในกรณีนี้การรักษา CPLL ทำผ่านเบาสั่นค้างคืนที่อุณหภูมิห้องที่ pH 7.2 และ pH 2.2 โปรตีน adsorbedมี desorbed แล้ว มีการแก้ไขปัญหาที่ประกอบด้วย SDS 4% และ20 มม. DTT สำหรับ 15 นาที ภายใต้เงื่อนไขการเดือด (Candiano et al.,2009) กำหนดความเข้มข้นโปรตีน โปรตีนไบโอ-Rad DCทำการทดสอบบนเยื่อ และสารสกัด จากเปลือก น้ำส้มและเครื่องดื่ม ก็วิเคราะห์เหมือนที่ใช้วิเคราะห์ Lowryซึ่งโปรตีนสร้างคอมเพล็กซ์กับทองแดงในการด่างกลางสามารถลดรีเอเจนต์ Folin ผลิตสีสีน้ำเงิน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 ตัวอย่างและโปรโตคอลการสกัดโปรตีน
2.2.1
ตัวอย่างแหล่งกำเนิดส้มที่ใช้ในงานนี้มาจากทั้งสองสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน
(สะดือและ Sanguinelli) ซึ่งได้รับบริจาคกรุณาโดย Fontestad
บริษัท (Museros, วาเลนเซีย, สเปน) ส้มทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้ถูกเก็บไว้ในมกราคม 2014 ในภูมิภาควาเลนเซีย, สเปน. สามน้ำผลไม้สีส้มยังวิเคราะห์: ครั้งแรก (Z1) ได้กรุณาบริจาคมาจากผู้ผลิตน้ำผลไม้สเปน(Zumos Valencianos เดMediterráneo SA); ที่สอง (Z2) เป็นเชิงพาณิชย์สเปนน้ำส้มไม่ได้มาจากสมาธิ(ยี่ห้อ Hacendado) และสาม (Z3) เป็นน้ำส้มพาณิชย์อิตาลี 100% จากสมาธิ (ยี่ห้อ Zuegg สกิปเปอร์) ในที่สุดทั้งสองเครื่องดื่มยังวิเคราะห์: แฟนต้าส้ม (Z4 ที่มีฉลากระบุสีส้ม 12% เนื้อหาน้ำผลไม้) และ Sanpellegrino Aranciata อิตาลีน้ำส้ม. (Z5 ที่มีฉลากระบุปริมาณน้ำ 15.6%) 2.2.2 การสกัดโปรตีนก่อนการสกัดโปรตีนสีส้ม, พื้นผิวของผลไม้สีส้มถูกล้างด้วยอุ่น1% SDS วิธีการแก้ปัญหาเพื่อขจัดเชื้อแบคทีเรียปนเปื้อนและพื้นผิวจากมือของมนุษย์ ถัดไป flavedo บางเปลือกถูกตัดอย่างระมัดระวังและลดลงไปนาทีเศษมากผ่านการรักษาในเครื่องปั่นผลไม้เป็นเวลา10 นาทีที่สูงสุดพลังงาน สำหรับการสำรวจ proteomes ทั้งเปลือกและเยื่อกระดาษสองโปรโตคอลสกัดได้วางแผนหลังจากhomogenisations เต็มรูปแบบของทั้งสองเนื้อเยื่อ บัฟเฟอร์สกัดพื้นเมืองที่มีอยู่ 50 มิลลิTris-HCl (pH 7.2) 50 มิลลิโซเดียมคลอไรด์และ 2% (m / v) CHAPS ในขณะที่กันชนแปลงสภาพที่มีอยู่นอกจากนี้1% (m / v) SDS และ 25 มิลลิDTT ละลายในเดียวกัน กันชน ยับยั้งเอนไซม์โปรติเอค็อกเทลถูกเพิ่มทั้งบัฟเฟอร์สกัดเพื่อป้องกันไม่ให้โปรตีนที่ย่อยสลายโดยการกระทำของโปรติเอส ในรายละเอียด 15 กรัมเปลือกสับ75 กรัมของเยื่อกระดาษผสมตามลำดับ 40 มิลลิลิตรและ 5 มิลลิลิตรของแต่ละบัฟเฟอร์การสกัดและการเขย่าเบาๆ 3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องสำหรับบัฟเฟอร์พื้นเมืองและภายใต้เงื่อนไขที่เดือดสำหรับหนึ่งแปลงสภาพ สุดท้าย homogenates ถูกหมุนเหวี่ยงที่18,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที. 2.2.3 ห้องสมุดแกนด์เปปไทด์ Combinatorial การรักษาหลังจากการหมุนเหวี่ยงที่ปริมาณการฟื้นตัวของทั้งสองโปรตีนสารสกัดจากเปลือกส้มและเยื่อกระดาษถูกบ่มกับcombinatorial ห้องสมุดแกนด์เปปไทด์ (CPLLs) ในขณะที่กลุ่มตัวอย่างพื้นเมืองก็พร้อมที่จะได้รับการบ่มกับCPLLs ที่คนแปลงสภาพถูกเจือจาง1: 10 (v / v) กับกันชนที่มี 50 มิลลิ Tris-HCl (pH 7.2) 50 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 25 มิลลิ DTT และค๊อกเทลยับยั้งโปรติเอสในเพื่อที่จะลดจากเดิม1% จำนวน SDS 0.1% (m / v) เพื่อที่จะช่วยให้การจับภาพโปรตีนที่มีประสิทธิภาพ(Fasoli et al., 2010) เปลือกและสารสกัดจากเยื่อกระดาษที่ได้รับภายใต้เงื่อนไขที่ทั้งพื้นเมืองและแปลงสภาพถูกแบ่งออกเป็นสองaliquots ก่อนที่จะมีการจับภาพ CPLL ซึ่งได้รับการปรับขนาดที่pH 7.2 โดยใช้ 1 M NaOH และที่ pH 2.2 โดยนอกเหนือจากฟอร์มิกรดและ0.1% TFA สามแบบจำลองทางเทคนิคทั้งสองแตกต่างกันตัวอย่างทางชีวภาพได้ดำเนินการ. สำหรับการตรวจสอบของวัสดุโปรตีนในน้ำผลไม้สีส้มและเครื่องดื่มสอง aliquots 100 มิลลิลิตรสำหรับแต่ละน้ำผลไม้ / เครื่องดื่มที่ได้รับเพิ่มถึง10 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์สกัดพื้นเมืองและแปลงสภาพหลังจากการหมุนเหวี่ยง(18,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที) เพื่อที่จะกำจัดที่ไม่ละลายน้ำวัสดุ หนึ่งใน aliquots ปรับค่า pH 7.2 และอื่น ๆคนหนึ่งถูกปรับขนาดตามค่า pH 2.2 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ นอกจากนี้ในกรณีนี้การรักษา CPLL ได้ดำเนินการผ่านอ่อนโยนสั่นค้างคืนที่อุณหภูมิห้องที่pH 7.2 และ pH 2.2 โปรตีนที่ดูดซับถูกหลุดออกแล้วด้วยวิธีการแก้ปัญหาที่มี SDS 4% และ 20 มิลลิ DTT เป็นเวลา 15 นาทีภายใต้เงื่อนไขเดือด (Candiano et al., 2009) การตรวจสอบความเข้มข้นของโปรตีนซึ่งเป็นโปรตีนซี Bio-Rad ทดสอบได้รับการดำเนินการเกี่ยวกับสารสกัดจากเปลือกเยื่อกระดาษและน้ำผลไม้สีส้มและเครื่องดื่ม มันเป็นทดสอบสีขึ้นอยู่กับการทดสอบโลว์รีย์ที่สร้างโปรตีนคอมเพล็กซ์กับทองแดงในอัลคาไลน์ขนาดกลางสามารถลดสารFolin ผลิตสีฟ้า

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . ตัวอย่างโปรโตคอลและการสกัดโปรตีน
2.2.1 . ตัวอย่างประเทศ
ส้มที่ใช้ในงานวิจัยนี้มาจากสองสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน
( สะดือและแซงกวิเนลลิ ) ที่กรุณาบริจาคโดย บริษัท fontestad
( museros , Valencia , สเปน ) ทั้งหมดที่ส้มใช้ในการศึกษา
เก็บตัวมกราคม 2014 ในภูมิภาค , เชียนสเปน .
3 สีส้มน้ำผลไม้ยังวิเคราะห์ : ครั้งแรก ( Z1
) กรุณาบริจาคโดยผู้ผลิตน้ำผลไม้สเปน ( zumos valencianos del
mediterr . kgm นีโอ S.A . ) ; ที่สอง ( กขึ้น ) เป็นส้มสเปน
พาณิชย์ไม่เข้มข้น ( hacendado แบรนด์ ) และ
3 ( z3 ) เป็นเชิงพาณิชย์อิตาเลียนน้ำส้ม 100% จากสมาธิ
( zuegg กัปตันแบรนด์ ) ในที่สุด สองเครื่องดื่มยัง
วิเคราะห์ : น้ำส้มแฟนต้า ( Z4 ที่มีฉลากระบุ
สีส้ม 12 เปอร์เซ็นต์ปริมาณน้ำ ) และ sanpellegrino aranciata ,
น้ำส้มคั้นอิตาลี ( z5 ที่มีฉลากระบุปริมาณน้ำเป็น 15.6% ) .
2.2.2 . การสกัดโปรตีน
ก่อนการสกัดโปรตีนส้ม , พื้นผิวของผลไม้ส้ม
ถูกล้างด้วยสารละลาย 1% SDS รุ่ม เพื่อกำจัดแบคทีเรีย และการปนเปื้อนจากมือ
ผิวมนุษย์ ต่อไป
ฟลาเวโดบางเปลือกอย่างรอบคอบตัดและลดเศษ
มาก นาทีผ่านการรักษาในเครื่องปั่นผลไม้ สำหรับ 10 นาทีที่สุดพลัง

สำหรับการสำรวจ proteomes ทั้งเปลือกและเนื้อ สอง
การสกัดโปรโตคอลถูกสร้างขึ้นหลังจาก homogenisations เต็ม
สองคนนี้เนื้อเยื่อ บัฟเฟอร์การสกัดพื้นเมืองที่มีอยู่ 50 mm
ทริส– HCl ( pH 7.2 ) , เกลือ 50 มม. และ 2 % ( M / V )
) พวกใช้บัฟเฟอร์ที่มีอยู่นอกจากนี้ 1% ( M / V ) SDS และ 25 mm
DTT ละลายบัฟเฟอร์เดียวกัน โปรตีเ นฮิบิเตอร์ค็อกเทลถูก
เพิ่มทั้งการสกัด บัฟเฟอร์ เพื่อป้องกันการสลายของโปรตีนและเอนไซม์
โดยการกระทำ ในรายละเอียด 15 กรัม และ 75 กรัมสับเปลือก
เยื่อกระดาษผสมกับ 40 มิลลิลิตร ตามลำดับ และ 5 มิลลิลิตรการสกัดแต่ละบัฟเฟอร์ และเขย่าเบา ๆ
3
) ที่อุณหภูมิห้องสำหรับบัฟเฟอร์พื้นเมืองและภายใต้เงื่อนไขเดือด
ใช้หนึ่ง ในที่สุด homogenates เป็นระดับที่ 18 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที

2.2.3 . การรักษาระบบห้องสมุดเปปไทด์
หลังการปั่นเหวี่ยง , กู้คืนปริมาณของโปรตีนสารสกัดจากเปลือกส้มและเนื้อ

มีการแยกเปปไทด์ ) ห้องสมุด ( cplls ) : ในขณะที่
ตัวอย่างพื้นเมืองพร้อมที่จะบ่มด้วย cplls อันที่ใช้อยู่
เจือจาง 1 : 10 ( v / v ) กับบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 50 มม. โดย– HCl ( M
7.2 ) , เกลือ 50 มม. 25 มม. และ protease inhibitor ในส่วนค๊อกเทล
เพื่อลดเดิม 1% SDS ในปริมาณ 0.1 % ( M / 5 ) เพื่อให้มีโปรตีนที่มีประสิทธิภาพการจับ
( fasoli et al . , 2010 ) สารสกัดจากเปลือกและเยื่อกระดาษที่ได้รับภายใต้
ทั้งท้องถิ่น และใช้เงื่อนไข
แบ่งออกเป็นสองส่วนที่หารลงตัวก่อน cpll จับ ซึ่งตลอดเวลาที่ pH 7.2 ใช้
1 M NaOH และ pH 2.2 โดยการเติมกรดมิค
และ 0.1% ในระดับ . สามแบบจําลองด้านสองตัวอย่างทางชีวภาพที่แตกต่างกัน

สำหรับการวิจัย การ proteinaceous วัสดุในส้มและผลไม้
เครื่องดื่มสองเฉยๆ 100 ml น้ำผลไม้ / เครื่องดื่มถูก
แต่ละเพิ่ม 10 มล. พื้นเมืองและใช้สกัดกันชนหลังการปั่นเหวี่ยง
( 18 , 000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที ) เพื่อกำจัดวัสดุที่ไม่ละลาย

หนึ่งในส่วนที่หารลงตัว คือ ค่า pH 7.2 และอื่น ๆหนึ่งคือ pH 2.2
ตลอดเวลาตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ นอกจากนี้ในกรณีนี้
cpll ทำการรักษาผ่านทางอ่อนโยนสั่นค้างคืนที่ห้อง
อุณหภูมิ pH 7.2 และ pH 2.2 . การดูดซับโปรตีน
แล้วศึกษากับสารละลายที่มี 4 % SDS และ
20 - 20 เดือด 15 นาที ภายใต้เงื่อนไข ( candiano et al . ,
2009 ) เพื่อศึกษาระดับโปรตีน , โปรตีนชีวภาพราด DC
( คือใช้สารสกัดจากเปลือกส้ม
, น้ำผลไม้และเครื่องดื่ม มันเป็นวิธี Colorimetric ขึ้นอยู่กับเบสโดย
ที่โปรตีนสร้างเชิงซ้อนทองแดงในด่าง
กลางสามารถลด folin รีเอเจนต์ , การผลิตสีฟ้า