Plasmid ConstructionAll cloning was

Plasmid Construction
All cloning was performed in E. coli DH10B cells (Invitrogen, Carlsbad, CA), and all
enzymes for cloning were purchased from New England Biolabs (Ipswich, MA). The accD
gene encoding the β-subunit of acetyl-CoA carboxyltransferase, the accA gene encoding the
α-subunit of acetyl-CoA carboxyltransferase, and the accBC operon encoding biotin
carboxyl carrier protein and biotin carboxylase were amplified by PCR from MG1655
genomic DNA with their putative upstream RBS using primers 7 and 8, 9 and 10, and 11
and 12, respectively. These PCR products were sequentially inserted into pBAD33 (Guzman
et al., 1995) between the SacI and XmaI sites (pRL1), SalI and XbaI sites (pRL2), and SphI
and XhoI sites to create the artificial operon accDABC in plasmid pBAD33-ACC.
The BTE fragment from plasmid pUC57-BTE between the XmaI and HindIII sites was
inserted into plasmid pBAD18 (Guzman et al., 1995) to generate plasmid pBAD18-BTE. To
create a nonfunctional BTE for use as a negative control, a catalytic histidine at amino acid
204 was identified based on prior alignments of BTE with other plant acyl-ACP
thioesterases (Yuan et al., 1996). A two-step megaprimer PCR procedure (Xu et al., 2003)
was used to mutagenize the first two nucleotides of the histidine codon at position 204 to
create an alanine codon. Primers 13 and 14 were used in the first reaction to generate a 3′
megaprimer from pBAD18-BTE template. This purified megaprimer and primer 15 were
used to generate the complete BTE-H204A fragment, which was inserted as described for
BTE to form plasmid pBAD18-BTE-H204A.
To generate a low copy vector harboring the PBAD promoter system, the 1697-bp fragment
between the start of the araC gene and the end of the rrnB terminator was amplified from
pBAD18 (Guzman et al., 1995) with primers 16 and 17. This insert was treated with T4
polynucleotide kinase and blunt ligated into EcoRV-digested plasmid pBT-2 (Lynch and
Gill, 2006) to form plasmid pBAD35. A fragment containing the BTE gene was amplified
from pBAD18-BTE using primers 18 and 19 and inserted into pBAD35 between the XmaI
and SphI sites to generate plasmid pBAD35-BTE. The same procedure was performed using
pBAD18-BTE-H204A as a template to form plasmid pBAD35-BTE-H204A.
To generate a high copy vector harboring the PBAD promoter system, the 1693-bp fragment
between the start of the araC gene and the end of the rrnB terminator was amplified from
pBAD33 with primers 20 and 21. The 2284-bp fragment of pUC19 (New England Biolabs)
containing the origin and AmpR marker was amplified with primers 22 and 23. These two
fragments were digested with XhoI and BglII and ligated to form plasmid pBAD34. The
XmaI/HindIII fragments containing BTE or BTE-H204A from pBAD18-BTE and pBAD18-
BTE-H204A were inserted into pBAD34 to form plasmids pBAD34-BTE and pBAD34-
BTE-H204A. All plasmid constructs thus described were verified by sequencing.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ก่อสร้าง plasmidโคลนทั้งหมดทำในเซลล์ E. coli DH10B (Invitrogen คาร์ลส CA), และทั้งหมดเอนไซม์สำหรับโคลนถูกซื้อจากนิวอิงแลนด์ Biolabs (อิปสวิช MA) AccDยีนβ-ย่อยของ acetyl-CoA carboxyltransferase การเข้ารหัสการเข้ารหัสแอคคายีนด้วยกองทัพย่อยของ acetyl-CoA carboxyltransferase, operon accBC เข้าไบโอตินcarboxyl ขนส่งโปรตีนและไบโอติน carboxylase ถูกขยาย โดย PCR จาก MG1655genomic DNA กับ RBS ขั้นต้นน้ำของ putative ใช้ไพรเมอร์ที่ 7 และ 8, 9 และ 10 และ 1112 ตามลำดับ ผลิตภัณฑ์ PCR ได้ถูกแทรกลำดับ pBAD33 (Guzmanและ al., 1995) ระหว่าง SacI และ XmaI ไซต์ (pRL1), ไซต์สลี่และ XbaI (pRL2), และ SphIและเว็บไซต์ XhoI เพื่อสร้าง accDABC ประดิษฐ์ operon ใน plasmid pBAD33-บัญชีส่วน BTE จาก BTE pUC57 plasmid ระหว่างไซต์ XmaI และ HindIII ได้แทรก plasmid pBAD18 (Guzman และ al., 1995) การสร้าง plasmid pBAD18 BTE ถึงสร้าง BTE nonfunctional อาจใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบ histidine เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาที่กรดอะมิโนระบุ 204 ตามก่อนจัดแนวของ BTE กับอื่น ๆ พืช acyl-ACPthioesterases (หยวน et al., 1996) สองขั้นตอน megaprimer PCR ขั้นตอน (Xu และ al., 2003)ใช้ mutagenize นิวคลีโอไทด์สองของรหัสพันธุกรรม histidine ที่ตำแหน่ง 204สร้างรหัสพันธุกรรมผิดอะลานีน ไพรเมอร์ที่ 13 และ 14 ใช้ในปฏิกิริยาแรกเพื่อสร้างการ 3′megaprimer จากแม่ pBAD18 BTE Megaprimer บริสุทธิ์นี้และสีรองพื้น 15ใช้ในการสร้างส่วน BTE H204A สมบูรณ์ ที่ถูกแทรกตามที่อธิบายไว้ในBTE แบบ plasmid pBAD18-BTE-H204Aการสร้างเวกเตอร์สำเนาต่ำ harboring ระบบ PBAD โปรโมเตอร์ ส่วน 1697 bpระหว่างยีน araC เริ่มต้นและสิ้นสุด rrnB เทอร์มิเนเตอร์ถูกขยายจากpBAD18 (Guzman และ al., 1995) ด้วยไพรเมอร์ที่ 16 และ 17 แทรกนี้ได้รับ T4polynucleotide kinase และทู่ควบเป็นเจ่า EcoRV plasmid pBT-2 (Lynch และเหงือก 2006) เพื่อ plasmid pBAD35 ส่วนที่ประกอบด้วยยีน BTE ถูกขยายจาก pBAD18-BTE ใช้ไพรเมอร์ที่ 18 และ 19 และแทรกลงในระหว่างการ XmaI pBAD35และเว็บไซต์ SphI เพื่อสร้าง plasmid pBAD35 BTE ทำขั้นตอนเดียวกันโดยใช้pBAD18-BTE-H204A เป็นแม่แบบเพื่อ plasmid pBAD35-BTE-H204Aการสร้างเวกเตอร์สูงสำเนา harboring ระบบ PBAD โปรโมเตอร์ ส่วน 1693 bpระหว่างยีน araC เริ่มต้นและสิ้นสุด rrnB เทอร์มิเนเตอร์ถูกขยายจากpBAD33 ด้วยไพรเมอร์ที่ 20 และ 21 ส่วน 2284 bp ของ pUC19 (นิวอิงแลนด์ Biolabs)ประกอบด้วยต้นกำเนิดและเครื่องหมาย AmpR ถูกขยาย ด้วยไพรเมอร์ที่ 22 และ 23 สองเหล่านี้ถูกย่อย XhoI และ BglII และควบกับ pBAD34 plasmid ฟอร์ม ที่บางส่วนของ XmaI/HindIII ประกอบด้วย BTE หรือ BTE H204A pBAD18 BTE และ pBAD18-BTE H204A ถูกแทรกไว้ใน pBAD34 ฟอร์ม plasmids pBAD34 BTE และ pBAD34 -BTE-H204A โครงสร้าง plasmid ทั้งหมดจึง อธิบายได้ตรวจสอบตามลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ก่อสร้างพลาสมิดโคลนทั้งหมดที่ได้ดำเนินการในเซลล์ E. coli DH10B (Invitrogen, Carlsbad, CA) และเอนไซม์สำหรับโคลนที่ซื้อมาจากนิวอิงแลนด์Biolabs (อิปส, แมสซาชูเซต) accD ยีนเข้ารหัสβ-subunit ของ carboxyltransferase acetyl-CoA ยีน ACCA เข้ารหัสα-subunit ของ carboxyltransferase acetyl-CoA และไบโอตินเข้ารหัส operon accBC โปรตีน carboxyl ให้บริการและคาร์บอกซิไบโอตินถูกขยายโดยวิธี PCR จาก MG1655 ดีเอ็นเอของพวกเขาด้วย RBS ต้นน้ำสมมุติโดยใช้ไพรเมอร์ที่ 7 และ 8, 9 และ 10 และ 11 และ 12 ตามลำดับ ผลิตภัณฑ์เหล่านี้ PCR เสียบตามลำดับเข้า pBAD33 (Guzman et al., 1995) ระหว่าง SACI และเว็บไซต์ XmaI (pRL1) สาลี่และเว็บไซต์ XbaI (pRL2) และ SphI และเว็บไซต์ XhoI เพื่อสร้าง operon เทียม accDABC ในพลาสมิด pBAD33 แม็ก . ชิ้น BTE จากพลาสมิด pUC57-BTE ระหว่างเว็บไซต์ XmaI และ HindIII ถูกใส่เข้าไปในพลาสมิดpBAD18 (Guzman et al., 1995) ในการสร้างพลาสมิด pBAD18-BTE เพื่อสร้าง BTE nonfunctional สำหรับการใช้งานเป็นตัวควบคุมเชิงลบเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาที่ฮิสติดีนกรดอะมิโน 204 ที่ถูกระบุอยู่บนพื้นฐานของการจัดแนวก่อน BTE กับพืชอื่น ๆ acyl-ACP thioesterases (หยวน et al., 1996) megaprimer สองขั้นตอนขั้นตอนวิธี PCR (Xu et al., 2003) ถูกใช้ในการ mutagenize สองคนแรกของนิวคลีโอ codon ฮิสติดีนที่ 204 ตำแหน่งที่จะสร้างcodon อะลานีน ไพรเมอร์ 13 และ 14 ถูกนำมาใช้ในการทำปฏิกิริยาแรกที่สร้าง 3 'megaprimer จากแม่ pBAD18-BTE นี้ megaprimer บริสุทธิ์และไพรเมอร์ 15 ถูกใช้ในการสร้างชิ้นส่วนสมบูรณ์BTE-H204A ซึ่งถูกแทรกตามที่อธิบายไว้สำหรับBTE ในรูปแบบพลาสมิด pBAD18-BTE-H204A. เพื่อสร้างเวกเตอร์สำเนาต่ำเก็บงำระบบก่อการ PBAD, ส่วน 1697-bp ระหว่างจุดเริ่มต้นของยีน Arac และจุดสิ้นสุดของเทอร์มิ rrnB ที่ถูกขยายจากpBAD18 (Guzman et al., 1995) ด้วยไพรเมอร์ที่ 16 และ 17 แทรกนี้ได้รับการรักษาด้วย T4 ไคเนส Polynucleotide และทื่อ ligated เข้าไปในพลาสมิด EcoRV ย่อย pBT- 2 (ลินช์และกิลล์2006) ในรูปแบบพลาสมิด pBAD35 ส่วนที่มียีน BTE ถูกขยายจากpBAD18-BTE ใช้ไพรเมอร์ที่ 18 และ 19 และแทรกเข้าไปใน pBAD35 ระหว่าง XmaI เว็บไซต์และ SphI การสร้างพลาสมิด pBAD35-BTE ขั้นตอนเดียวกันได้รับการดำเนินการโดยใช้pBAD18-BTE-H204A เป็นแม่แบบในรูปแบบพลาสมิด pBAD35-BTE-H204A. เพื่อสร้างสำเนาสูงเวกเตอร์เก็บงำระบบก่อการ PBAD, ส่วน 1693-bp ระหว่างจุดเริ่มต้นของยีน Arac และสิ้นสุดที่ ของเทอร์มิ rrnB ถูกขยายจากpBAD33 กับไพรเมอร์ที่ 20 และ 21 ส่วน 2284-bp ของ pUC19 (นิวอิงแลนด์ Biolabs) ที่มีแหล่งกำเนิดและเครื่องหมาย AmpR ถูกขยายด้วยไพรเมอร์ 22 และ 23 ทั้งสองชิ้นส่วนถูกย่อยด้วยXhoI และ BglII และ ligated ในรูปแบบพลาสมิด pBAD34 XmaI / ชิ้นส่วน HindIII มี BTE หรือ BTE-H204A จาก pBAD18-BTE และ pBAD18- BTE-H204A ถูกใส่เข้าไปใน pBAD34 ในรูปแบบพลาสมิด pBAD34-BTE และ pBAD34- BTE-H204A พลาสมิดทั้งหมดโครงสร้างอธิบายถึงเหตุที่ถูกตรวจสอบโดยลำดับ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสร้างพลาสมิด
ทั้งหมดแสดงในเซลล์ E . coli dh10b ( Invitrogen Carlsbad , CA ) และเอนไซม์
สำหรับการซื้อมาจากอังกฤษ biolabs ( อิปสวิช , MA ) การ accd
ยีนบีตา - ย่อยของ COA อะ carboxyltransferase การเข้ารหัส , การแสดงของยีนแอลฟาอะ
ย่อยของ COA carboxyltransferase การเข้ารหัสและการเข้ารหัส biotin
accbc โอเปอรอนโปรตีนขนส่งหมู่คาร์บอกซิลและไบโอตินอวัยวะสืบพันธุ์ถูกขยายโดย PCR จาก mg1655
ดีเอ็นเอด้วยการแสดงออกโดยใช้ไพรเมอร์ที่ 7 , 8 , 9 และ 10 และ 11
และ 12 ตามลำดับ ผลิตภัณฑ์ PCR เหล่านี้เป็นแทรกเข้าไป pbad33 ( Guzman
et al . , 1995 ) และระหว่างซาซิ xmai เว็บไซต์ ( prl1 ) และเว็บไซต์ ( โดย xbai prl2 ) และ sphi