DNA manipulations Standard methods

DNA manipulations
Standard methods were used for DNA purification, restriction enzyme digestion, agarose gel electrophoresis, and ligation (Ortiz- Herrera et al., 2004). Genomic DNA was isolated and purified by a cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) miniprep procedure. A 6.4 kb DNA probe containing the entire phz locus from P. fluorescens F15 was generated by PCR performed with oligonucleotide primers phz-up and phz-low (Table 1). The amplification was carried out by
using a 50 _l reaction mixture containing 1x eLONGase buffer (Life Technologies, Inc., Rockville, Md.), 2 mM MgSO4, 3.0% dimethyl sulfoxide, 200 _M (each) dGTP, dATP, dTTP, and dCTP, 10 pmol of each primer, 0.7 _l of eLONGase enzyme mixture (Cinagene, Inc.), and 20 ng of purified genomic DNA from isolated strains. All amplifications were performed with a PTC- 200 thermal cycler. Amplification was performed in a thermal cycler programmed. The reaction conditions are: a initial denaturation of 94°C for 2 min followed by 37 cycles of 94°C for 1 min, 64°C for 1 min, and 72°C
for 1 min. A final extension step of 72°C for 10 min was included to complete the reaction. Amplified DNA fragments were examined by horizontal electrophoresis in 1.5% agarose gel in TBE buffer containing 90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA (pH 8.3), with 8 _L aliquots of PCR products. Gels were stained with ethidium bromide and were photographed under UV light (312 nm).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

dna กิจวัตร
วิธีการมาตรฐานที่ใช้สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ dna ข้อ จำกัด การย่อยอาหารเอนไซม์อิเจล agarose และ ligation (ออร์ติซ-herrera, et al., 2004) dna จีโนมที่แยกและบริสุทธิ์โดยโบรไมด์ cetyltrimethylammonium (ctab) ขั้นตอน miniprep สอบสวน dna 6.4 กิโลไบต์ที่มีสถานที PHz ทั้งหมดจากพีfluorescens f15 ถูกสร้างขึ้นโดยวิธี PCR ดำเนินการกับไพรเมอร์ oligonucleotide PHz ขึ้นและ PHz ต่ำ (ตารางที่ 1) ขยายได้ดำเนินการโดย
ใช้ผสมปฏิกิริยา 50 _l มีบัฟเฟอร์ elongase 1x (เทคโนโลยีชีวิต, inc., Rockville, MD.), 2 มิลลิเมตร MgSO4, 3.0% dimethyl sulfoxide 200 _m (แต่ละคน) dgtp, dATP, dttp, และ dctp 10 pmol ไพรเมอร์ของแต่ละ 0.7 _l ส่วนผสมของเอนไซม์ elongase (cinagene,inc.) และ 20 ng ของดีเอ็นเอบริสุทธิ์จากสายพันธุ์ที่แยก amplifications ทั้งหมดถูกดำเนินการกับ Cycler ร้อน PTC-200 ขยายได้ดำเนินการใน Cycler ร้อนโปรแกรม เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาคือ denaturation เริ่มต้นจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 37 รอบ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที, 64 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและ 72 ° c
1 นาทีเป็นขั้นตอนสุดท้ายของการขยาย 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีถูกรวมเพื่อให้เกิดปฏิกิริยา ขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกตรวจสอบโดยอิแนวนอนใน 1.5% เจล agarose ในบัฟเฟอร์ TBE มี 90 มิลลิเมตร tris-borate 2 มม. EDTA (ph 8.3) กับ 8 aliquots _l ของผลิตภัณฑ์ pcr เจลที่ถูกย้อมด้วยสี ethidium โบรไมด์และได้รับการถ่ายภาพภายใต้แสงยูวี (312 นาโนเมตร).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอ manipulations ภาพ
ใช้วิธีการมาตรฐานสำหรับ DNA ฟอก ย่อยอาหารเอนไซม์จำกัด electrophoresis agarose เจล และไข่ (พล.ต. - รับเชิญ et al., 2004) Genomic DNA แยกต่างหาก และบริสุทธิ์ ด้วยกระบวนการ miniprep โบรไมด์ (CTAB) cetyltrimethylammonium Kb 6.4 ดีเอ็นเอโพรบประกอบด้วยโลกัสโพลทั้ง phz จากพี fluorescens F15 ถูกสร้างขึ้น โดย PCR ทำ phz oligonucleotide ไพรเมอร์สายและ phz-ต่ำ (ตารางที่ 1) ขยายตัวถูกดำเนินการโดย
ใช้ส่วนผสมปฏิกิริยา 50 _l ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ x eLONGase 1 (ชีวิตเทคโนโลยี อิงค์ ร็อควิลล์ Md.), 2 มม. MgSO4, 3.0% dimethyl sulfoxide, dGTP (ละ) 200 _M, dATP, dTTP และ dCTP, 10 pmol แต่ละพื้น _l 0.7 ส่วนผสมเอนไซม์ eLONGase (Cinagene Inc.), และ 20 ng เอ็น genomic บริสุทธิ์จากสายพันธุ์ที่แยก Amplifications ทั้งหมดที่ทำกับ cycler ร้อนที่ PTC - 200 ขยายงานใน cycler ร้อนที่ตั้งโปรแกรม มีเงื่อนไขปฏิกิริยา: denaturation เริ่มต้นของ 94° C สำหรับ 2 นาทีตาม ด้วยรอบ 37 94 องศาเซลเซียสใน 1 นาที 64° C สำหรับ 1 นาที และ 72° C
ใน 1 นาที ขั้นตอนสุดท้ายขยาย 72 องศาเซลเซียสใน 10 นาทีไม่รวมอยู่ในการทำปฏิกิริยา ชิ้นส่วนดีเอ็นเอเอาต์ถูกตรวจสอบ โดยแนว electrophoresis ในเจล 1.5% agarose ในบัฟเฟอร์ TBE ประกอบด้วย 90 มม. borate ตรี 2 mM EDTA (pH 8.3), มี 8 _L aliquots ผลิตภัณฑ์ PCR เจมีสีกับโบรไมด์ ethidium และถูกถ่ายภาพภายใต้แสง UV (312 nm) .

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีการ
ตามมาตรฐานดีเอ็นเอต้นเหตุได้ถูกนำมาใช้สำหรับทำน้ำบริสุทธิ์ดีเอ็นเอระบบย่อยอาหารเจลเอนไซม์การจำกัด electrophoresis agarose และ ligation ( ortiz - Herrera et al . 2004 ) genomic ดีเอ็นเอก็ถูกแยกออกจากกันและบริสุทธิ์โดย cetyltrimethylammonium ไม่น่าทึ่ง( ctab )ขั้นตอน miniprep ที่ อุปกรณ์ตรวจสอบดีเอ็นเอ 6.4 KB ที่ประกอบด้วย phz ทั้งที่ สภาพ จาก P .fluorescens F 15 ถูกสร้างขึ้นโดย pcr ทำกับ primers oligonucleotide phz และ phz - ต่ำ(ตารางที่ 1 ) ที่ใช้การขยายเสียงเป็นการกระทำโดย
การใช้ที่ 50 _l ปฏิกริยาการผสมผสานประกอบด้วย 1 x elongase Buffer (อายุการใช้งานเทคโนโลยี, Inc ., Rockville Executive Meeting Center , md. ), 2 มม. mgso4 , 3.0% dimethyl sulfoxide , 200 _m (แต่ละ) dgtp , datp , dttp ,และ dctp , 10 pmol ของแต่ละ Primer , 0.7 _l ของ elongase เอนไซม์( cinagene ,, Inc .)และ 20 ไนจีเรียของดีเอ็นเอ genomic บริสุทธิ์จากพันธุ์แยกกันต่างหาก. amplifications ทั้งหมดเป็นคนทำกับ cycler ระบายความร้อน PTC - A 200 ใช้การขยายเสียงได้ดำเนินการใน cycler ระบายความร้อนที่ตั้งโปรแกรมไว้ เงื่อนไขปฏิกริยาที่เป็น denaturation ครั้งแรกที่ 94 ° C สำหรับ 2 นาทีตามด้วย 37 รอบในนาที 94 ° C สำหรับ 164 ° C สำหรับ 1 นาทีและ 72 ° C
สำหรับ 1 นาทีขั้นตอนที่ขยายเวลาครั้งสุดท้ายในนาทีที่ 72 ° C สำหรับ 10 ถูกรวมไว้ในการทำปฏิกริยาที่ แอมพลิฟายเศษดีเอ็นเอก็ถูกตรวจสอบโดย electrophoresis ในแนวนอนใน 1.5% เจล agarose ใน tbe บัฟเฟอร์สำหรับประกอบด้วย 90 มม.ผลิตไฟฟ้าราชบุรี - borate 2 ม.ม. edta ( PH 8.3 )พร้อมด้วย 8 aliquots _l pcr ของ ผลิตภัณฑ์ ผลิตภัณฑ์ ประเภท แวกซ์,เจลมีแต้มสีพร้อมด้วยไม่น่าทึ่ง ethidium และถ่าย ภาพ ภายใต้ สภาพ แสง UV ( 312 nm )..