[0019] In a tenth aspect, the discl

[0019] In a tenth aspect, the disclosure provides for a method of preparing เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม for การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, the method ซึ่งประกอบรวมด้วย incubating the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม in a composition ซึ่งประกอบรวมด้วย skim milk, กลีเซอรอล and a carbohydrate.
[0020] In an eleventh aspect, the disclosure provides for the use of a composition ซึ่งประกอบรวมด้วย skim milk, กลีเซอรอล and a carbohydrate for preparing เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม for การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง.
[0021] In a twelfth aspect, the disclosure provides for the use of a composition ซึ่งประกอบรวมด้วย skim milk, กลีเซอรอล and a carbohydrate for the freezing of เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม.

DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
[0022] The การประดิษฐ์ will be better understood with reference to the detailed description when considered in conjunction with the non-limiting examples and the accompanying drawings, in which:
[0023] รูป 1 shows bright field microscopic images of encapsulated Lactobacillus acidophilus cells in freeze dried form after being treated with the method of the การประดิษฐ์ using 5% skimmed milk powder and 1% กลีเซอรอล as ไครโอโพรเทกแทนต์, โดยที่ in the cells were incubated in each incubation step in an incubation solution containing increasing concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์. The increasing concentrations of the ไครโอโพรเทกแทนต์ are achieved by serially diluting in each incubation step the bacterial growth solution from 100% to 50% to 25% to 12.5% to 6.25% to 3.125% to 0% with cyroprotectant solution (5% skimmed milk powder and 1% กลีเซอรอล);



4







[0024] รูป 2 shows the protective effect of capsules on Lactobacillus acidophilus
bacteria during การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, using an สารละลาย บ่ม containing skim milk and กลีเซอรอล (5% skim milk and 1% กลีเซอรอล in water) as ไครโอโพรเทกแทนต์. The protection effect was examined by a การอยู่รอดและเติบโตได้ test following rehydration of the freeze-dried bacteria. The การอยู่รอดและเติบโตได้ was compared to freshly encapsulated bacterial cells as reference and is expressed in % การอยู่รอดและเติบโตได้.
[0025] รูป 3 shows the comparison of two different freeze media/สารละลาย บ่มs (สารละลาย บ่ม 1: de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) medium containing DMSO as ไครโอโพรเทกแทนต์, สารละลาย บ่ม 2: 5% skim milk and 1% กลีเซอรอล in water) with regard to survival of the Lactobacillus acidophilus bacteria during การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง;
[0026] รูป 4 shows bright field microscopic images of an empty capsule which has been re-hydrated after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. The freezing medium used was skim milk with 1% กลีเซอรอล. The freezing step prior to การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง was carried out in liquid nitrogen.
[0027] รูป 5 shows bright field microscopic images of an empty capsule which has been re-hydrated after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. The freezing medium used was skim milk with 1% กลีเซอรอล. The freezing step prior to การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง was carried out in an ethanol/dry ice bath.
[0028] รูป 6 shows bright field microscopic images of an empty capsule freeze-dried in phosphate buffered saline (PBS) without ไครโอโพรเทกแทนต์ with the pre-freezing step carried out in an ethanol/dry ice bath;
[0029] รูป 7 shows bright field microscopic images of an empty capsule freeze-dried in PBS with 10% DMSO, with the pre-freezing step being carried out in an ethanol/dry ice bath; [0030] รูป 8 shows bright field microscopic images of an empty capsule freeze-dried in MRS with no ไครโอโพรเทกแทนต์, with the pre-freezing being carried out in liquid nitrogen;
[0031] รูป 9 shows bright field microscopic images of an empty capsule freeze-dried in MRS without ไครโอโพรเทกแทนต์, with the freezing being carried out in an ethanol/dry ice bath; [0032] รูป 10 shows the results of an embodiment of the freezing-drying method of the การประดิษฐ์ using a combination of 5% skimmed milk, 1% กลีเซอรอล and 10% trehalose as cryo-
protectant both as สารละลาย บ่ม for the sequential incubation with increasing concentrations of the ไครโอโพรเทกแทนต์ and as การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง solution. The following samples were employed in this experiment: 1) Free (not encapsulated) Lactobacillus samples freeze-
dried with skim milk/กลีเซอรอล/trehalose (filled rhombes), 2) free Lactobacillus samples
freeze-dried without skim milk/กลีเซอรอล/trehalose (filed squares), 3) encapsulated
Lactobacillus bacteria samples freeze dried using the method of the การประดิษฐ์ with concentration of skim milk, กลีเซอรอล and trehalose as ไครโอโพรเทกแทนต์ in the incubation
solution (crosses) (the increasing concentrations of the ไครโอโพรเทกแทนต์ were achieved by
serially diluting in each incubation step the bacterial growth solution from 100% to 50% to 25% to 12.5% to 6.25% to 3.125% to 0% with cyroprotectant solution (5% skim milk powder, 1% กลีเซอรอล and 10 % trehalose), 4) encapsulated lactobacillus bacteria samples freeze dried without trehalose (filled triangles). The time points at which the samples were rehydrated were 1, 2, 3, 4, 6, 7 and 8 weeks post การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง to assess the การอยู่รอดและเติบโตได้ of bacteria after cryopreservation with or without trehalose at room temperature over a period of
2 months after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. Each data point in รูป 10 represents the average of duplicate freeze-dried samples (each sample tested in quadruplicate) with two exceptions: free bacteria with 10% trehalose at week 6 and encapsulated bacteria with 10% trehalose at week 8. RFU= Relative fluorescent units.
[0033] รูป 11 shows Lactobacillus casei capsules at different points after encapsulation and การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, with รูป 11A showing Lactobacillus casei capsules immediate after encapsulation, รูป 11B showing Lactobacillus casei capsules one day after encapsulation before การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, and รูป 11C showing rehydrated freeze-dried Lactobacillus casei capsules.
[0034] รูป 12 shows the การอยู่รอดและเติบโตได้ comparison of Lactobacillus casei capsules one day before and after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง.
[0035] รูป 13 shows Bifidobacterium infantis longum capsules at different points after encapsulation and การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, with รูป 13A showing Bifidobacterium infantis capsules one day after encapsulation before การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, and รูป 13B showing rehydrated freeze-
dried Bifidobacterium infantis longum capsules.
[0036] รูป 14 shows the การอยู่รอดและเติบโตได้ comparison of Bifidobacterium infantis longum capsules one day before and after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง.

DETAILED DESCRIPTION
[0037] The การประดิษฐ์นี้ provides a method of การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม, โดยที่ this method ประกอบรวมด้วย at least two consecutive incubation steps. The เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are incubated in each of the incubation steps in an สารละลาย บ่ม containing ไครโอโพรเทกแทนต์ over a suitable period of time, โดยที่ the concentration of ไครโอโพรเทกแทนต์ in the สารละลาย บ่ม is increased with each subsequent incubation step. The inventors have found this method provides a protective effect on the (structural) integrity of capsules (the encapsulation material) both before and during the การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง process. In addition, the

6




shelf-life of the capsules with the cells encapsulated therein is extended and the การอยู่รอดและเติบโตได้ of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม is significantly increased (cf. Example Section). On a mechanistic level, while not wishing to be bound by theory, it is believed that subjecting the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม to the at least two consecutive incubation steps of the method of the การประดิษฐ์ avoids capsules from "crumpling".
[0038] The increase of the concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์ (it is noted here that the term "ไครโอโพรเทกแทนต์" as used herein refers to both a single cryoproctant and a ของผสม/combination of two or more ไครโอโพรเทกแทนต์s) in the สารละลาย บ่ม during the consecutive incubation steps can be achieved in various ways. It is, for example, possible, to add to a suspension of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม, for each incubation step a stock solution of the cryo-protectant. For example, if a ไครโอโพรเทกแทนต์ such as DMSO, ฟอร์มาไมด์, N-
เมธิลอะเซทาไมด์ (MA), or propanediol is used, a stock solution of the pure ไครโอโพรเทกแทนต์ (100 % stock solution) might be used and in each incubation step a certain amount of the stock solution is added to

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

[0019] ในด้านสิบ เปิดเผยให้สำหรับวิธีการเตรียมเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มสำหรับการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง ซึ่งประกอบรวมด้วยวิธีที่ incubating เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มในซึ่งประกอบรวมด้วยเขียนอ่านอย่างคร่าว ๆ กลีเซอรอล และคาร์โบไฮเดรต[0020] ในด้านสิบเอ็ด เปิดเผยให้ใช้เป็นองค์ประกอบซึ่งประกอบรวมด้วย skim นม กลีเซอรอล และเป็นคาร์โบไฮเดรตสำหรับเตรียมเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มสำหรับการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง[0021] ในด้านสิบสอง เปิดเผยให้ใช้เป็นส่วนประกอบซึ่งประกอบรวมด้วย skim นม กลีเซอรอล และคาร์โบไฮเดรตแช่แข็งของเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มคำอธิบายของรูปวาด[0022] การประดิษฐ์จะดีกว่าเข้าใจละเอียดเมื่อพิจารณาร่วมกับตัวอย่างไม่จำกัดและมาพร้อมกับภาพวาด ที่โปร่ง:[0023] รูป 1 แสดงสว่างฟิลด์กล้องจุลทรรศน์ภาพของแลคโตบาซิลลัสสรุปเซลล์ acidophilus ตรึงฟอร์มแห้งหลังจากได้รับการรักษาด้วยวิธีการการประดิษฐ์ใช้นมขาดมันเนย 5% และ 1% กลีเซอรอลเป็นไครโอโพรเทกแทนต์ โดยที่ในเซลล์ถูก incubated ในแต่ละขั้นตอนบ่มในโซลูชันการบ่มที่ประกอบด้วยความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของไครโอโพรเทกแทนต์ ความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของไครโอโพรเทกแทนต์จะทำได้ โดย serially diluting ในแต่ละขั้นตอนของการบ่มเชื้อแบคทีเรียเจริญเติบโตโซลูชันจาก 100% 50% 25% ถึง 12.5% เป็น 6.25% 3125% 0% ด้วยโซลูชั่น cyroprotectant (5% นมขาดมันเนยผงและ 1% กลีเซอรอล);4 [0024] รูปที่ 2 แสดงผลของแคปซูลป้องกันแลคโตบาซิลลัส acidophilusแบคทีเรียในระหว่างการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง ใช้การบ่มสารละลายประกอบด้วย skim นมและกลีเซอรอล (skim นม 5% และ 1% กลีเซอรอลในน้ำ) เป็นไครโอโพรเทกแทนต์ ผลการป้องกันการถูกตรวจสอบ โดยการทดสอบการอยู่รอดและเติบโตได้ต่อ rehydration แบคทีเรียกรอบ การอยู่รอดและเติบโตได้ถูกเปรียบเทียบกับสดนึ้เซลล์แบคทีเรียเป็นการอ้างอิง และจะแสดงเป็น%การอยู่รอดและเติบโตได้[0025] รูป 3 แสดงการเปรียบเทียบสองตรึงต่าง ๆ สื่อ/สารละลาย บ่มs (สารละลายบ่ม 1: เดอแมน Rogosa และ Sharpe (นาง) กลางประกอบด้วย DMSO ไครโอโพรเทกแทนต์ สารละลายบ่ม 2:5% skim นม และกลีเซอรอล 1% ในน้ำ) เกี่ยวกับการอยู่รอดของแบคทีเรีย acidophilus แลคโตบาซิลลัสในระหว่างการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง [0026] รูปที่ 4 แสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สว่างฟิลด์ของแคปซูลว่างซึ่งได้ผลิตภัณฑ์ใหม่หลังจากการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง สื่อตรึงใช้ skim นมกับกลีเซอรอล 1% ได้ ขั้นตอนการตรึงก่อนการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งถูกดำเนินในไนโตรเจนเหลว [0027] รูปที่ 5 แสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สว่างฟิลด์ของแคปซูลว่างซึ่งได้ผลิตภัณฑ์ใหม่หลังจากการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง สื่อตรึงใช้ skim นมกับกลีเซอรอล 1% ได้ ขั้นตอนการตรึงก่อนการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งถูกดำเนินในการอาบน้ำแข็งเอทานอลรูม [0028] รูปที่ 6 แสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สว่างฟิลด์ของแคปซูลเปล่าอบแห้งในน้ำเกลือฟอสเฟต buffered (PBS) โดยไม่ต้องไครโอโพรเทกแทนต์ขั้นตอนก่อนตรึงที่ทำในห้องน้ำเป็นน้ำแข็งเอทานอลรูม[0029] รูปที่ 7 แสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สว่างฟิลด์ของแคปซูลเปล่าอบแห้งใน PBS กับ 10% DMSO ขั้นตอนก่อนตรึงที่กำลังทำในห้องน้ำเป็นน้ำแข็งเอทานอลรูม [0030] รูป 8 แสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สว่างฟิลด์ของแคปซูลเปล่าอบแห้งในนางกับไครโอโพรเทกแทนต์ไม่ มีจุดเยือกแข็งก่อนที่จะดำเนินการในไนโตรเจนเหลว [0031] รูป 9 แสดงสว่างฟิลด์กล้องจุลทรรศน์รูปแคปซูลเปล่าอบแห้งในนางไครโอโพรเทกแทนต์ กับถูกตรึงโดยไม่ต้องดำเนินการในน้ำน้ำแข็งเป็นเอทานอลรูม [0032] รูป 10 แสดงผลลัพธ์ของการลื่นการประดิษฐ์ใช้นมขาดมันเนย 5% กลีเซอรอล 1% และ 10% trehalose เป็น cryo - วิธีการอบแห้งแช่แข็งprotectant ทั้งบ่มสารละลายสำหรับบ่มตามลำดับด้วยการเพิ่มความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ และ เป็นโซลูชั่นการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง ตัวอย่างต่อไปนี้ได้รับการว่าจ้างในการทดลองนี้: 1) ฟรี (สรุปไม่) แลคโตบาซิลลัสตัวอย่างแช่แข็ง -แห้ง ด้วยนม skim/กลีเซอรอล/trehalose (เติม rhombes), 2) ฟรีตัวอย่างแลคโตบาซิลลัสอบแห้งไม่ มีน้ำนม skim/กลีเซอรอล/trehalose (ยื่นสี่เหลี่ยม), 3) นึ้ตัวอย่างแบคทีเรียแลคโตบาซิลลัสตรึงแห้งด้วยวิธีการการประดิษฐ์ความเข้มข้นของนม skim กลีเซอรอล และ trehalose เป็นไครโอโพรเทกแทนต์ในการบ่ม โซลูชัน (ตัด) (ความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของไครโอโพรเทกแทนต์ที่สำเร็จโดยserially diluting ในแต่ละขั้นตอนของการบ่มเชื้อแบคทีเรียเจริญเติบโตโซลูชันจาก 100% 50% 25% ถึง 12.5% เป็น 6.25% 3125% 0% ด้วยโซลูชั่น cyroprotectant (5% skim นมผง กลีเซอรอล 1% และ 10% trehalose), 4) นึ้แบคทีเรียแลคโตบาซิลลัสอย่างตรึงแห้ง โดย trehalose (สามเหลี่ยมเต็ม) เวลาถูกสถานที่ถูก rehydrated ตัวอย่าง 1, 2, 3, 4, 6, 7 และ 8 สัปดาห์ลงการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งหาการอยู่รอดและเติบโตได้ของแบคทีเรียหลัง cryopreservation หรือ ไม่ trehalose ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา2 เดือนหลังจากการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง แต่ละจุดข้อมูลในรูปที่ 10 แสดงค่าเฉลี่ยของตัวอย่างกรอบซ้ำ (ตัวอย่างแต่ละทดสอบใน quadruplicate) มีข้อยกเว้นสอง: ฟรีแบคทีเรีย ด้วย trehalose 10% ในสัปดาห์ที่ 6 และแบคทีเรียสรุป ด้วย trehalose 10% ใน 8 สัปดาห์ RFU =หน่วยสัมพัทธ์เรืองแสง[0033] รูปที่ 11 แสดงแลคโตบาซิลลัส casei แคปซูลแตกต่างจุดหลัง encapsulation และการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง มีรูป 11A แสดงแลคโตบาซิลลัส casei แคปซูลทันทีหลังจากการ encapsulation รูป 11B แสดงแลคโตบาซิลลัส casei แคปซูลหลังจาก encapsulation ก่อนการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง และรูป 11C แสดง rehydrated กรอบแลคโตบาซิลลัส casei ในยาแคปซูล[0034] รูป 12 shows the การอยู่รอดและเติบโตได้ comparison of Lactobacillus casei capsules one day before and after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง.[0035] รูป 13 shows Bifidobacterium infantis longum capsules at different points after encapsulation and การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, with รูป 13A showing Bifidobacterium infantis capsules one day after encapsulation before การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง, and รูป 13B showing rehydrated freeze-dried Bifidobacterium infantis longum capsules.[0036] รูป 14 shows the การอยู่รอดและเติบโตได้ comparison of Bifidobacterium infantis longum capsules one day before and after การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง.DETAILED DESCRIPTION[0037] The การประดิษฐ์นี้ provides a method of การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม, โดยที่ this method ประกอบรวมด้วย at least two consecutive incubation steps. The เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม are incubated in each of the incubation steps in an สารละลาย บ่ม containing ไครโอโพรเทกแทนต์ over a suitable period of time, โดยที่ the concentration of ไครโอโพรเทกแทนต์ in the สารละลาย บ่ม is increased with each subsequent incubation step. The inventors have found this method provides a protective effect on the (structural) integrity of capsules (the encapsulation material) both before and during the การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง process. In addition, the6 shelf-life of the capsules with the cells encapsulated therein is extended and the การอยู่รอดและเติบโตได้ of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม is significantly increased (cf. Example Section). On a mechanistic level, while not wishing to be bound by theory, it is believed that subjecting the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม to the at least two consecutive incubation steps of the method of the การประดิษฐ์ avoids capsules from "crumpling".[0038] The increase of the concentration of the ไครโอโพรเทกแทนต์ (it is noted here that the term "ไครโอโพรเทกแทนต์" as used herein refers to both a single cryoproctant and a ของผสม/combination of two or more ไครโอโพรเทกแทนต์s) in the สารละลาย บ่ม during the consecutive incubation steps can be achieved in various ways. It is, for example, possible, to add to a suspension of the เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม, for each incubation step a stock solution of the cryo-protectant. For example, if a ไครโอโพรเทกแทนต์ such as DMSO, ฟอร์มาไมด์, N-เมธิลอะเซทาไมด์ (MA), or propanediol is used, a stock solution of the pure ไครโอโพรเทกแทนต์ (100 % stock solution) might be used and in each incubation step a certain amount of the stock solution is added to

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

[0019] ในแง่มุมที่สิบเปิดเผยให้สำหรับวิธีการของการเตรียมเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มสำหรับการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งวิธีการซึ่งประกอบรวมด้วยบ่มเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มในองค์ประกอบ ซึ่งประกอบรวมด้วยนมพร่องมันเนย, กลีเซอรอลและคาร์โบไฮเดรต.
[0020] ในลักษณะที่สิบเอ็ดเปิดเผยให้สำหรับการใช้งานขององค์ประกอบซึ่งประกอบรวมด้วยนมพร่องมันเนย, กลีเซอรอลและคาร์โบไฮเดรตสำหรับการเตรียมเซลล์ที่ ได้รับการห่อหุ้มสำหรับการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง.
[0021] ในแง่มุมที่สิบสอง, การเปิดเผยข้อมูลให้สำหรับการใช้งานขององค์ประกอบซึ่งประกอบรวมด้วยนมพร่องมันเนยที่กลีเซอรอลและคาร์โบไฮเดรตสำหรับการแช่แข็งของที่เซลล์ ที่ได้รับการห่อหุ้ม. รายละเอียดของภาพวาด[0022] ในการประดิษฐ์จะต้องมีความเข้าใจที่ดีขึ้นมีการอ้างอิงถึงคำอธิบายรายละเอียดเมื่อพิจารณาร่วมกับตัวอย่างที่ไม่ จำกัด และภาพวาดประกอบซึ่งใน: [0023] รูป 1 แสดงให้เห็นภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามสดใสของเซลล์ acidophilus Lactobacillus ห่อหุ้มในการแช่แข็งรูปแบบแห้งหลังจากที่ได้รับการรักษาด้วยวิธีการของการประดิษฐ์โดยใช้ 5% ผงนมไขมันต่ำและ 1% กลีเซอรอลเป็นไครโอโพรเทกแทนต์, โดยที่ ในเซลล์ถูกบ่มในแต่ละขั้นตอนการบ่มในสารละลายที่มีความเข้มข้นของการบ่มที่เพิ่มขึ้นของไครโอโพรเทกแทนต์ ความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของไครโอโพรเทกแทนต์จะประสบความสำเร็จโดยลำดับเจือจางในแต่ละขั้นตอนการบ่มการแก้ปัญหาการเจริญเติบโตของแบคทีเรียจาก 100% ถึง 50% ถึง 25% ถึง 12.5% ​​มาอยู่ที่ 6.25% เป็น 3.125% ถึง 0% กับ cyroprotectant วิธีการแก้ปัญหา (5% ผงนมไขมันต่ำและ 1% กลีเซอรอล); 4 [0024] รูปที่ 2 แสดงผลการป้องกันของแคปซูลใน acidophilus Lactobacillus แบคทีเรียในระหว่างการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งโดยใช้สารละลายบ่มที่มีนมพร่องมันเนยและกลี เซอรอล (5% นมพร่องมันเนย 1% และกลีเซอรอลในน้ำ) เป็นไครโอโพรเทกแทนต์ ผลการป้องกันที่ถูกตรวจสอบโดยการอยู่รอดและเติบโตได้ต่อไปนี้การทดสอบการคืนของแบคทีเรียที่แห้ง การอยู่รอดและเติบโตได้เป็นเมื่อเทียบกับการห่อหุ้มสดเซลล์แบคทีเรียเป็นข้อมูลอ้างอิงและจะแสดงใน% การอยู่รอดและเติบโตได้. [0025] รูปที่ 3 แสดงการเปรียบเทียบของทั้งสองแช่แข็งสื่อที่แตกต่างกัน / สารละลายบ่มฯ (สารละลายบ่มที่ 1: เดผู้ชาย, Rogosa และชาร์ป (MRS) ขนาดกลางที่มี DMSO เป็นไครโอโพรเทกแทนต์, สารละลายบ่ม 2: 5% นมพร่องมันเนย 1% และกลีเซอรอลในน้ำ) ในเรื่องเกี่ยวกับความอยู่รอดของเชื้อแบคทีเรีย * Lactobacillus acidophilus ในระหว่างการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง; [0026] รูปที่ 4 แสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามที่สดใสของแคปซูลที่ว่างเปล่าซึ่งได้รับความชุ่มชื้นอีกครั้งหลังจากการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง กลางแช่แข็งที่ใช้เป็นนมพร่องมันเนย 1% กลีเซอรอล ขั้นตอนการแช่แข็งก่อนที่จะมีการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งได้ดำเนินการในไนโตรเจนเหลว. [0027] รูปที่ 5 แสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามที่สดใสของแคปซูลที่ว่างเปล่าซึ่งได้รับความชุ่มชื้นอีกครั้งหลังจากการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง กลางแช่แข็งที่ใช้เป็นนมพร่องมันเนย 1% กลีเซอรอล ขั้นตอนการแช่แข็งก่อนที่จะมีการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งได้ดำเนินการในเอทานอล / อาบน้ำน้ำแข็งแห้ง. [0028] รูปที่ 6 แสดงให้เห็นภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามที่สดใสของแคปซูลแห้งในที่ว่างเปล่าฟอสเฟตน้ำเกลือบัฟเฟอร์ (PBS) โดยไคร โอโพรเทกแทนต์กับขั้นตอนก่อนการแช่แข็งดำเนินการในเอทานอล / อาบน้ำน้ำแข็งแห้ง[0029] รูปที่ 7 แสดงให้เห็นภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามที่สดใสของแคปซูลเปล่าแห้งในพีบีเอส 10% DMSO กับก่อน ขั้นตอน -freezing ถูกดำเนินการในเอทานอล / อาบน้ำน้ำแข็งแห้ง; [0030] รูปที่ 8 แสดงภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์สนามที่สดใสของแคปซูลเปล่าแห้งใน MRS ที่ไม่มีไครโอโพรเทกแทนต์ที่มีก่อนการแช่แข็งที่ถูกนำมาใช้ในไนโตรเจนเหลว; [0031] รูปที่ 9 แสดงสดใส สนามภาพกล้องจุลทรรศน์แคปซูลเปล่าแห้งใน MRS โดยไม่มีไครโอโพรเทกแทนต์ด้วยการแช่แข็งที่มีการดำเนินการในเอทานอล / อาบน้ำน้ำแข็งแห้ง; [0032] รูปที่ 10 แสดงให้เห็นถึงผลของการเป็นศูนย์รวมของวิธีการแช่แข็งแห้งของการประดิษฐ์โดยใช้การรวมกันของ 5% นมไขมันต่ำ, 1% กลีเซอรอลและ 10% ในขณะที่ทรีฮาโล cryo- ที่protectant ทั้งสารละลายบ่มสำหรับ บ่มลำดับที่มีความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของไครโอโพรเทกแทนต์และในขณะที่การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งวิธีการแก้ปัญหา ตัวอย่างต่อไปนี้ถูกใช้ในการทดลองนี้: 1) ฟรี (ไม่ห่อหุ้ม) ตัวอย่างแลคโตบาซิลลัส freeze- แห้งกับนมพร่องมันเนย / กลีเซอรอล / ทรีฮาโล (rhombes เต็ม) 2) ตัวอย่างแลคโตบาซิลลัสฟรีแห้งโดยไม่ต้องนมพร่องมันเนย/ กลีเซอ รอล / ทรีฮาโล (สี่เหลี่ยมยื่น) 3) ห่อหุ้มแลคโตบาซิลลัสตัวอย่างแช่แข็งแห้งโดยใช้แบคทีเรียวิธีการของการประดิษฐ์ที่มีความเข้มข้นของนมพร่องมันเนย, กลีเซอรอลและทรีฮาโลเป็นไครโอโพรเทกแทนต์ในการบ่มการแก้ปัญหา (กากบาท) (ความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของไครโอโพรเทกแทนต์ประสบความสำเร็จโดยลำดับเจือจางในแต่ละขั้นตอนการบ่มการแก้ปัญหาการเจริญเติบโตของแบคทีเรียจาก100% ถึง 50% ถึง 25% ถึง 12.5% ​​มาอยู่ที่ 6.25% เป็น 3.125% ถึง 0% กับการแก้ปัญหา cyroprotectant (5% นมผงพร่องมันเนย 1% กลีเซอรอลและ 10% ทรีฮาโล) 4) การแช่แข็งห่อหุ้มตัวอย่างแบคทีเรียแลคโตบาซิลลัสแห้งโดยไม่ต้องทรีฮาโล (สามเหลี่ยมเต็ม) จุดเวลาที่กลุ่มตัวอย่างได้รับการคืนรูป 1, 2, 3, 4, 6, 7 และ 8 สัปดาห์ที่ผ่านมาโพสต์การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งเพื่อประเมินการอยู่รอดและเติบโตได้ของเชื้อแบคทีเรียหลังจากเก็บรักษาที่มีหรือไม่มีทรีฮาโลที่ อุณหภูมิห้องในช่วงระยะเวลาของ2 เดือนหลังจากการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง แต่ละจุดข้อมูลในรูปที่ 10 แสดงให้เห็นถึงค่าเฉลี่ยของกลุ่มตัวอย่างที่ซ้ำกันแห้ง (แต่ละตัวอย่างการทดสอบใน quadruplicate) ยกเว้นสอง: แบคทีเรียฟรีกับ 10% ทรีฮาโลในสัปดาห์ที่ 6 และแบคทีเรียที่ห่อหุ้มด้วยทรีฮาโล 10% ในสัปดาห์ที่ 8 RFU = เรืองแสงสัมพัทธ์ หน่วย. [0033] รูปที่ 11 แสดงให้เห็นแคปซูล casei แลคโตบาซิลลัสที่จุดที่แตกต่างกันหลังจากที่ห่อหุ้มและการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งที่มีรูป 11A แสดง Lactobacillus casei แคปซูลทันทีหลังจากที่ห่อหุ้ม, รูป 11B แสดงแคปซูล Lactobacillus casei วันหนึ่งหลังจากที่ห่อหุ้มก่อนการทำแห้ง แบบแช่เยือกแข็งและรูป 11C แสดง rehydrated แห้งแลคโตบาซิลลัสแคปซูล casei. [0034] รูปที่ 12 แสดงให้เห็นถึงการอยู่รอดและเติบโตได้เปรียบเทียบแลคโตบาซิลลัสแคปซูล casei หนึ่งวันก่อนและหลังการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. [0035 ] รูปที่ 13 แสดงให้เห็น Bifidobacterium longum แคปซูล infantis ที่จุดที่แตกต่างกันหลังจากที่ห่อหุ้มและการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งที่มีรูป 13A แสดง Bifidobacterium แคปซูล infantis วันหนึ่งหลังจากที่ห่อหุ้มก่อนการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งและรูป 13B แสดง rehydrated freeze- แห้ง Bifidobacterium infantis แคปซูล longum. [0036] รูปที่ 14 แสดงให้เห็นถึงการอยู่รอดและเติบโตได้เปรียบเทียบ Bifidobacterium แคปซูล infantis longum หนึ่งวันก่อนและหลังการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็ง. คำอธิบายรายละเอียด[0037] ในการประดิษฐ์นี้มีวิธีการของ การทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้ม, โดยที่วิธีการนี้ประกอบรวมด้วยอย่างน้อยสองขั้นตอนการบ่มติดต่อกัน เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มจะบ่มในแต่ละขั้นตอนการบ่มในสารละลายบ่มที่มีไครโอโพรเทกแทนต์ในช่วงระยะเวลาที่เหมาะสมของเวลาโดยที่ความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทน ต์ในสารละลายบ่มจะเพิ่มขึ้นด้วยขั้นตอนการบ่มที่ตามมาในแต่ละ นักประดิษฐ์ได้พบวิธีนี้ให้ผลในการป้องกัน (โครงสร้าง) ความสมบูรณ์ของแคปซูล (วัสดุห่อหุ้ม) ทั้งก่อนและระหว่างการทำแห้งแบบแช่เยือกแข็งกระบวนการ นอกจากนี้6 อายุการเก็บรักษาของแคปซูลที่มีการห่อหุ้มเซลล์นั้นจะขยายและการอยู่รอดและเติบโตได้ของเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มจะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (cf ตัวอย่างมาตรา) ในระดับกลไกในขณะที่ไม่ประสงค์ที่จะผูกพันตามทฤษฎีเชื่อว่าหนอนบ่อนไส้เซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มเพื่ออย่างน้อยสองขั้นตอนการบ่มติดต่อกันของวิธีการประดิษฐ์ที่หลีกเลี่ยงแคปซูลจาก "ขยำ". [ 0038] การเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของไครโอโพรเทกแทนต์ (มันเป็นข้อสังเกตที่นี่ว่าคำว่า "ไครโอโพรเทกแทนต์" ที่ใช้ในที่นี้หมายถึงทั้ง cryoproctant เดียวและของผสม / การรวมกันของสองคนหรือมากกว่าไครโอโพรเทกแทนต์ s) ในสารละลายบ่มในระหว่างขั้นตอนการบ่มติดต่อกันสามารถทำได้ในรูปแบบต่างๆ มันเป็นเช่นที่เป็นไปได้ที่จะเพิ่มการระงับของเซลล์ที่ได้รับการห่อหุ้มสำหรับแต่ละขั้นตอนการบ่มโซลูชั่นที่หุ้นของฝั่ง-protectant ตัวอย่างเช่นถ้าไครโอโพรเทกแทนต์เช่น DMSO, ฟอร์มาไมด์, N-เมธิลอะเซทาไมด์(MA) หรือโพรเพนจะใช้วิธีการแก้ปัญหาสต็อกของบริสุทธิ์ ไครโอโพรเทกแทนต์ (สารละลายหุ้น 100%) อาจจะใช้ในแต่ละขั้นตอนการบ่มจำนวนหนึ่งของการแก้ปัญหาหุ้นจะถูกเพิ่ม