2.3. Phagocytosis and colocalizatio

2.3. Phagocytosis and colocalization experiments
For analysis of phagocytosis index (PI) and colocalization of
spirochetes and RBs with F-actin and lysosomes, coverslips
with differentiated macrophages were transferred to medium
without 1% pen/strep. In PI studies, B. burgdorferi B31 strain
was used while colocalization experiments were performed
with fluorescent B. burgdorferi GCB726 strain. Cells were kept
on ice for 20 min prior addition of the bacteria to synchronize
phagocytosis. Either 50 ml of B. burgdorferi
spirochetes or 2 h induced RBs in RPMI medium without antibiotics
with a multiplicity of infection (MOI) of 40 were added
to cells. For PI analysis cells were incubated for 2 h at 37 C.
For colocalization studies, cells were incubated for 2 h, 8 h, or
24 h. After each time point, cells were washed twice with PBS
and fixed with 4% paraformaldehyde/PBS for 20 min RT. Cells
were immunolabeled using the previously published protocol
[24]. For PI analysis cells were immunolabeled with monoclonal
mouse anti-B. burgdorferi OspA antibody (Santa Cruz
Biotechnology, Dallas, USA) and with the secondary goat antimouse
antibody conjugated with Alexa 488 (Invitrogen, Massachusetts,
USA). For colocalization analysis with Lamp2, cells
were immunolabeled similarly except rabbit anti-Lamp2 primary
antibody and Alexa 555 or 594 were used. To study
colocalization with F-actin cells were stained with Phalloidin-
Tetramethylrhodamine B isothiocyanate (Santa Cruz Biotechnology)
1:1000 for 15 min. To inhibit phagocytosis in the
colocalization experiments, macrophages were stimulated with
spirochetes and RBs in the presence of 10 mM cytochalasin D
(Sigma) that was added to the cells 30 min prior the bacteria.
Cytochalasin D inhibits phagocytosis by disrupting actin polymerization.
To prevent phagosome-lysosome fusion, 30 mM
nocodazole was used to inhibit lysosomal pathway for B.
burgdorferi and Lamp2 colocalization analysis. To allow
phagocytosis nocodazole was added to the cells 30 min after the
bacteria addition because nocodazole might inhibit phagocytosis
in some amount. In both inhibition experiments, cells were
fixed after 2 h incubation and immunolabeled/stained as
explained above. As a last step, coverslips were mounted using
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 การการทดลองที่ phagocytosis และ colocalizationสำหรับการวิเคราะห์ของ phagocytosis index (PI) และ colocalization ของspirochetes และ RBs กับแอกติ น F และ lysosomes, coverslipsกับแมโครฟาจแตกต่างถ่ายโอนปานกลางโดยปากกา 1% / อักเสบ ในการศึกษาปี่ B. burgdorferi B31 สายพันธุ์ใช้การดำเนินการทดลอง colocalizationมี burgdorferi B. ฟลูออเรสเซนต์สายพันธุ์ GCB726 เซลล์ที่ถูกเก็บไว้บนน้ำแข็งสำหรับ 20 นาทีก่อนหน้าของแบคทีเรียการซิงโครไนส์phagocytosis ทั้ง 50 มล.ของ B. burgdorferispirochetes หรือ 2 h เกิด RBs ใน RPMI ปานกลางโดยไม่ใช้ยาปฏิชีวนะมีหลายหลากของการติดเชื้อ (MOI) 40 เพิ่มเซลล์ สำหรับ PI วิเคราะห์ เซลล์ได้รับการกก 2 ชม.ที่ 37 cสำหรับการศึกษา colocalization เซลล์ได้รับการกก 2 ชม. 8 ชั่วโมง หรือ24 ชม หลังจากแต่ละจุดเวลา เซลล์ถูกล้าง ด้วย PBS สองครั้งและยึด ด้วย 4% paraformaldehyde/PBS สำหรับเซลล์ rt. 20 นาทีimmunolabeled ใช้โพรโทคอลเผยแพร่ก่อนหน้านี้[24] . PI สำหรับวิเคราะห์เซลล์ถูก immunolabeled กับโมโนป้องกันเมาส์-b burgdorferi OspA แอนติบอดี (ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ ดัลลาส สหรัฐอเมริกา) และ มี antimouse แพะรองแอนติบอดีผันกับ Alexa 488 (Invitrogen แมซซาซูเสท์สหรัฐอเมริกา) สำหรับการวิ colocalization ด้วย Lamp2 เซลล์ถูก immunolabeled ในทำนองเดียวกันยกเว้นหลัก Lamp2 ป้องกันกระต่ายใช้แอนติบอดี และ Alexa 555 หรือ 594 ในการศึกษาcolocalization เซลล์แอกติน F ถูกย้อม ด้วย Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate (ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ)1: 1000 15 นาที การยับยั้ง phagocytosis ในการการทดลอง colocalization แมโครฟาจที่ถูกกระตุ้นด้วยspirochetes และ RBs ใน 10 มม. cytochalasin D(Sigma) ที่มีเพิ่มการได้ล่วงหน้า 30 นาทีเซลล์แบคทีเรียCytochalasin D ยับยั้ง phagocytosis โดยรบกวน polymerization แอกตินเพื่อป้องกันการหลอม phagosome-ไลโซโซม 30 มม.ใช้ nocodazole เพื่อยับยั้ง lysosomal pathway สำหรับ bburgdorferi และ Lamp2 colocalization การวิเคราะห์ การอนุญาตให้phagocytosis nocodazole ถูกเซลล์ 30 นาทีหลังจากการนอกจากนี้เชื้อแบคทีเรียเนื่องจาก nocodazole อาจยับยั้ง phagocytosisในบางยอด ในการทดลองทั้งการยับยั้ง เซลล์ได้แก้ไขหลังจากบ่ม 2 ชม.และ immunolabeled/ย้อม สีเป็นอธิบายข้างต้น เป็นขั้นตอนสุดท้าย coverslips ติดตั้งใช้ยืดทอง Antifade เอเจนต์ ด้วย DAPI (ชีวิตเทคโนโลยี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 Phagocytosis และ colocalization ทดลอง
สำหรับการวิเคราะห์ของดัชนี phagocytosis (PI) และ colocalization ของ
spirochetes และ RBS กับ F-โปรตีนและ lysosomes, coverslips
มีขนาดใหญ่ที่แตกต่างถูกย้ายไปกลาง
โดยไม่ต้อง 1% ปากกา / อักเสบ ในการศึกษา PI บี burgdorferi B31 สายพันธุ์
ถูกนำมาใช้ในขณะที่การทดลอง colocalization ได้ดำเนินการ
กับเรืองแสงสายพันธุ์บี burgdorferi GCB726 เซลล์ที่ถูกเก็บไว้
บนน้ำแข็งเป็นเวลา 20 นาทีนอกจากนี้ก่อนของแบคทีเรียในการประสาน
phagocytosis ทั้ง 50 มล. ของ B. burgdorferi
spirochetes หรือ 2 ชั่วโมงเหนี่ยวนำให้เกิด RBS ในสื่อ RPMI โดยไม่ต้องใช้ยาปฏิชีวนะ
ที่มีความหลายหลากของการติดเชื้อ (กระทรวงมหาดไทย) 40 ถูกเพิ่ม
ไปยังเซลล์ สำหรับเซลล์วิเคราะห์ PI ถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส.
สำหรับการศึกษา colocalization เซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมง, 8 ชั่วโมงหรือ
24 ชั่วโมง หลังจากจุดในแต่ละครั้งเซลล์ถูกล้างครั้งที่สองกับพีบีเอส
และการแก้ไขด้วย 4% paraformaldehyde / พีบีเอส 20 นาที RT เซลล์
ถูก immunolabeled ใช้โปรโตคอลเผยแพร่ก่อนหน้านี้
[24] สำหรับเซลล์วิเคราะห์ PI ถูก immunolabeled กับโมโนโคลนอล
เมาส์ต่อต้าน-B burgdorferi OSPA แอนติบอดี (Santa Cruz
เทคโนโลยีชีวภาพ, ดัลลัส, สหรัฐอเมริกา) และมีแพะ antimouse รอง
แอนติบอดีผันกับ Alexa 488 (Invitrogen, Massachusetts,
USA) สำหรับการวิเคราะห์ colocalization กับ Lamp2 เซลล์
ถูก immunolabeled ในทำนองเดียวกันยกเว้นกระต่ายป้องกัน Lamp2 หลัก
แอนติบอดีและ Alexa 555 หรือ 594 ถูกนำมาใช้ เพื่อศึกษา
colocalization กับเซลล์ F-โปรตีนถูกย้อมด้วยสี Phalloidin-
Tetramethylrhodamine B isothiocyanate (Santa Cruz เทคโนโลยีชีวภาพ)
1: 1000 เป็นเวลา 15 นาที ในการยับยั้งเซลล์ทำลายใน
การทดลอง colocalization, ขนาดใหญ่ที่ถูกกระตุ้นด้วย
spirochetes และ RBS ในการปรากฏตัวของ 10 มิลลิ cytochalasin D
(ซิกม่า) ที่ถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์ 30 นาทีก่อนที่แบคทีเรีย.
cytochalasin D ยับยั้งเซลล์ทำลายรบกวนพอลิเมอโปรตีน.
เพื่อป้องกันไม่ให้ phagosome ฟิวชั่น -lysosome, 30 มิลลิเมตร
nocodazole ถูกใช้ในการยับยั้งการเดิน lysosomal สำหรับ B.
burgdorferi และการวิเคราะห์ colocalization Lamp2 เพื่อช่วยให้
เซลล์ทำลาย nocodazole ถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์ 30 นาทีหลังจากที่
นอกจากแบคทีเรียเพราะ nocodazole อาจยับยั้งเซลล์ทำลาย
ในเงินบางส่วน ทั้งในการทดลองการยับยั้งเซลล์ถูก
คงที่หลังจาก 2 ชั่วโมงและบ่ม immunolabeled / ย้อมสีเป็น
ที่อธิบายข้างต้น ในฐานะที่เป็นขั้นตอนสุดท้าย coverslips ถูกติดตั้งโดยใช้
ยืดทอง Antifade Reagent กับ DAPI (ไลฟ์เทคโนโลยี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 ฟาโกไซโตซิส และ colocalization การทดลองการวิเคราะห์ดัชนีฟาโกไซโทซิส ( PI ) และ colocalization ของสไปโรคีท RBS กับและและ f-actin lysosomes coverslipsมีความ macrophages ถูกย้ายกลางโดยที่ 1 ปากกา / Strep . ในปี่การศึกษา พ. burgdorferi B31 เมื่อยคือใช้ในขณะที่ colocalization ทดลองกับหลอด B burgdorferi gcb726 สายพันธุ์ เซลล์ที่ถูกเก็บไว้บนน้ำแข็ง 20 นาทีก่อนเติมแบคทีเรียเช่นฟาโกไซโตซิส . 50 มิลลิลิตร burgdorferi Bสไปโรคีทหรือ 2 H จาก RBS ใน RPMI ขนาดกลางไม่มียาปฏิชีวนะด้วยความหลายหลากของการติดเชื้อ ( MOI ) 40 เพิ่มเซลล์ สำหรับเซลล์การวิเคราะห์ปี่ถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมงสำหรับ colocalization การศึกษาเซลล์ถูกบ่ม 2 ชั่วโมง , 8 ชั่วโมง , หรือ24 ชั่วโมง หลังจากแต่ละจุดเวลาที่เซลล์มีการล้างสองครั้งกับช่องและแก้ไขด้วย 4% พาราฟอร์มาลดิไฮด์ / พีบีเอส 20 นาทีเซลล์ RT .เป็น immunolabeled ใช้เผยแพร่ก่อนหน้านี้ โปรโตคอล[ 24 ] สำหรับเซลล์การวิเคราะห์ปี่เป็น immunolabeled กับโมโนโคลนอลเมาส์ anti-b. burgdorferi ospa แอนติบอดี ( ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ , ดัลลัส , สหรัฐอเมริกา ) และมี antimouse แพะ มัธยมศึกษาแอนติบอดีและ Alexa 488 ( Invitrogen , Massachusetts ,สหรัฐอเมริกา ) สำหรับการวิเคราะห์ colocalization lamp2 เซลล์เป็น immunolabeled ในทํานองเดียวกันยกเว้นกระต่าย anti-lamp2 ปฐมภูมิแอนติบอดีและ Alexa 555 หรือคุณใช้ เพื่อศึกษาcolocalization กับ f-actin เซลล์ถูกย้อมด้วยสี phalloidin -tetramethylrhodamine B ไอโซไทโอไซยาเนต ( Santa Cruz เทคโนโลยีชีวภาพ )000 เป็นเวลา 15 นาที เพื่อยับยั้ง phagocytosis ในcolocalization การทดลอง , macrophages ถูกกระตุ้นด้วยสไปโรคีท และ RBS ในการแสดงตนของ 10 มิลลิโมลาร์ ดี( Sigma ) ที่ถูกเพิ่มไปยังเซลล์ 30 นาทีก่อนที่แบคทีเรียcytochalasin D ยับยั้ง phagocytosis โดยรบกวน actin polymerization .เพื่อป้องกันไม่ให้ฟาโกโซมเคโรโระฟิวชั่น , 30 มม.nocodazole ใช้ขัดขวางทางเดิน lysosomal สำหรับ Bburgdorferi และการวิเคราะห์ colocalization lamp2 . เพื่อให้ฟาโกไซโตซิส nocodazole ถูกเพิ่มไปยังเซลล์ 30 นาทีหลังเพราะ nocodazole อาจยับยั้ง phagocytosis และแบคทีเรียในบางจํานวน ในการยับยั้งเซลล์มีทั้งการทดลองถาวรหลังจาก 2 ชั่วโมงและบ่มเพาะ immunolabeled / ย้อมเป็นที่อธิบายไว้ข้างต้น เป็นขั้นตอนสุดท้าย coverslips ติดใช้ขยายเวลาใช้ antifade ทองกับ dapi ( เทคโนโลยีกับชีวิต )