2.6. Bacterial kill curvesBacterial

2.6. Bacterial kill curves
Bacterial inactivation was determined using the bacterium
A. salmonicida as host, at a Multiplicity of infection (MOI) of 100. For
each assay, two control samples were included: the bacterial control
(BC) and the phage control (PC). While the bacterial control was not inoculated
with phages, the phage controls were inoculated with phages
but not with bacteria. Controls and test samples were incubated exactly
in the same conditions, with 3 replicates being performed per sample.
Aliquots of test samples and controls were collected after 0, 2, 4, 6, 8,
10, 12 and 24 h of incubation. In all assays the phage titre was determined
in duplicate through the double agar layer method after an incubation
period of 18 h at 25 °C. Bacterial concentration was determined
in duplicate in TSA medium (Liofilchem, Italy) after an incubation period
of 24 h at 25 °C. Three independent experiments were performed for
each condition.
2.7. Prophage detection in host bacteria after phage therapy
In order to evaluate the occurrence of lysogenic conversion (evaluate
if the tested phage has the ability to incorporate its own genome
in the bacterial genome), the mitomycin C test was applied, according
to Silva et al. (2014a), Silva et al. (2014b). The absence of a clear zone
after the exposure to mytomycin C was interpreted as an indicator of
the absence of prophages in the bacterial genomes. Three independent
assays were performed.
2.8. Determination of frequencies of spontaneous phage-bacterial mutants
Spontaneous A. salmonicida mutants resistant to bacteriophages were
isolated by plating on double-layer agar with the phage (109 PFU/mL per
plate), according to Filippov et al. (2011). To calculate the mutation frequencies,
mean numbers of mutants in 1 mL of culture (prepared from
the culture with phages) were divided by mean total numbers of live
bacterial cells (prepared from the culture without phages) (Filippov
et al., 2011).
2.9. In vivo experiments with S. senegalensis juveniles
S. senegalensis juveniles (~30 mm total length) were selected as
biological models to test the efficacy of phage therapy against
A. salmonicida infections. All juveniles used in this experiment were purchased
at Safiestela Sustainable Aquafarming Investments, Lda. (Group
Sea8), a Senegalese sole hatchery in Póvoa do Varzim (Portugal). This
hatchery enforces a bio-security protocol to prevent disease in its facilities,
with emphasis to furunculosis. All fishes were transported to the
laboratory by the research team in a controlled temperature container,
with an oxygen saturated atmosphere, and quarantined to ensure that
solely healthy fishes were selected for the experimental trials (fish
were surveyed daily and no abnormal behavior or disease signal was recorded
during this period).
2.9.1. Determination of LD50 of A. salmonicida infection on S. senegalensis
Bacteria were grown overnight in TSB supplemented with 1.5%
NaCL, at 25 °C. Bacterial cells were centrifuged and washed twice with
PBS. The bacterial suspension was adjusted to about 109 CFU mL−1
with PBS.
Determination of Lethal Dose (LD50) of A. salmonicida infection on
S. senegalensis was performed in order to establish the concentration
of A. salmonicida able to cause death in about 50% of juvenile fish in
72 h. A fresh culture of A. salmonicida was produced and then resuspended
in PBS in order to reduce the introduction of organic matter in
the tanks. The control tank was inoculated with PBS without any addition
of bacteria. Bacterial suspension was added to the water and the juvenile
fish of the four tanks employed were maintained under optimal
growth conditions. Fish mortality was determined by visual inspection
every 12 h. Three independent assays were performed in different
dates.
2.9.2. Phage therapy in S. senegalensis juveniles
In these experiments 4 groups of juvenile fish were used. Each group
included 3 samples of 10 juveniles each (a total 4 × 3 × 10 = 120 juveniles
per experiment). Samples of the first group were infected with
A. salmonicida and treated with AS-A phage (test group: fish +
bacterium + phage−), samples of the second group were infected
with the bacteria but not treated with the phage (bacterium control:
fish + bacterium), samples of the third group were not infected with
bacteria but phages were added (phage control: Fish + Phage) and
samples of the fourth group received neither bacteria nor phages (fish
control: fish). All 3 samples of each group were maintained in an independent
tank, each one with an aerator and sterile synthetic seawater
(4 L) (prepared by mixing Tropic Marin ProReef salt (Tropic Marine,
Germany) with freshwater purified by a reverse osmosis unit), temperature
was maintained at 22 ± 1.5 °C, pH 8.0 ± 0.2, salinity 35, and dissolved
oxygen above 5.5 mg L−1
, during the entire trial. A fresh culture
of A. salmonicida was added to the test group and bacterium control to
obtain a final concentration of 108 CFU mL−1
. Immediately after bacterial
addition, the phage suspension was added to the test group
and phage control to attain a final concentration of 1010 CFU mL−1
(MOI 100).
In each experiment, A. salmonicida was incubated in sterile synthetic
seawater at a concentration of 108 CFU mL−1
, under the same conditions
as the phage therapy assays described above, in order to determine
the number of autochthonous bacteria present in juvenile fish at
the beginning of the experiences and also to verify the behavior of the
bacteria in the absence of fish and phages (control bacteria: saline
water + bacteria). Water samples were collected at 1, 6, 12, 24, 48,
and 72 h, for bacterial and phage quantification. Serial dilutions were
performed and plated in TSA in duplicate and plates were incubated at
30 °C for 24 h. Fish mortality was determined by visual inspection
every 12 h. This procedure was repeated three times (three independent
assays) in different days

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6. แบคทีเรียฆ่าโค้งกำหนดยกเลิกการเรียกแบคทีเรียแบคทีเรียใช้Salmonicida A. เป็นโฮสต์ ที่มากมายหลายหลากของเชื้อ (อย) 100 สำหรับมีตัวควบคุมสองตัวอย่างวิเคราะห์แต่ละ รวม: ควบคุมแบคทีเรีย(BC) การควบคุม phage (PC) ในขณะที่การควบคุมแบคทีเรียไม่ inoculatedมี phages ควบคุม phage ถูก inoculated กับ phagesแต่ไม่ มีแบคทีเรีย ควบคุมและทดสอบตัวอย่างที่ incubated ว่าในเงื่อนไขเดียวกัน 3 เหมือนกับกำลังดำเนินการต่ออย่างนี้Aliquots ของตัวอย่างทดสอบและควบคุมถูกเก็บรวบรวมหลังจาก 0, 2, 4, 6, 810, 12 และ 24 h ของคณะทันตแพทยศาสตร์ ในทั้งหมด assays กำหนด phage titreสำเนาโดยวิธี agar สองชั้นหลังจากการบ่มระยะ h 18 ที่ 25 องศาเซลเซียส กำหนดความเข้มข้นของแบคทีเรียสำเนาใน TSA (Liofilchem อิตาลี) หลังจากระยะการฟักตัวของ 24 ชมที่ 25 องศาเซลเซียส ดำเนินการทดลองอิสระ 3เงื่อนไขแต่ละเงื่อนไข2.7 ตรวจ prophage ในแบคทีเรียโฮสต์หลังจากบำบัด phageการประเมินการเกิดแปลง lysogenic (ประเมินถ้า phage ทดสอบความสามารถในการรวมกลุ่มของตัวเองในการเชื้อแบคทีเรียจีโนม), การทดสอบ mitomycin C ใช้ ตามการ Silva et al. (2014a), Silva et al. (2014b) การขาดงานของโซนชัดเจนหลังจากสัมผัสกับ mytomycin C ถูกแปลเป็นตัวบ่งชี้การขาดงานของ prophages ใน genomes แบคทีเรีย อิสระ 3assays ดำเนินการ2.8 การกำหนดความถี่ของ phage แบคทีเรียสายพันธุ์ที่อยู่มีสายพันธุ์ A. salmonicida อยู่ทนต่อ bacteriophagesแยกต่างหาก โดยชุบบนชั้นสอง agar มี phage (109 PFU/mL ต่อแผ่น), ตาม Filippov et al. (2011) การคำนวณความถี่ของการกลายพันธุ์หมาย เลขของสายพันธุ์ใน 1 mL ของวัฒนธรรม (เตรียมจากวัฒนธรรมกับ phages) ถูกหาร ด้วยเลขหมายถึงผลรวมของสดเซลล์แบคทีเรีย (เตรียมจากวัฒนธรรมโดย phages) (Filippovร้อยเอ็ด al., 2011)2.9 การทดลองกับ S. senegalensis juveniles ในสัตว์ทดลองS. senegalensis juveniles (~ 30 มม.ยาวรวม) ถูกเลือกให้เป็นรูปแบบชีวภาพเพื่อทดสอบประสิทธิภาพของ phage บำบัดกับการติดเชื้อ A. salmonicida ซื้อ juveniles ทั้งหมดที่ใช้ในการทดลองนี้ที่ Safiestela ลงทุนอย่างยั่งยืน Aquafarming, Lda (กลุ่มSea8), ใกล้โรงเพาะแต่เพียงผู้เดียว Senegalese ใน Póvoa ทำ Varzim (โปรตุเกส) นี้โรงเพาะบังคับใช้โพรโทคอลการรักษาความปลอดภัยทางชีวภาพเพื่อป้องกันโรคในการอำนวยความสะดวกโดยเน้นการ furunculosis ปลาทั้งหมดถูกขนส่งไปห้องปฏิบัติการ โดยทีมงานวิจัยในคอนเทนเนอร์ควบคุมอุณหภูมิด้วยการออกซิเจนอิ่มตัวบรรยากาศ และตรวจสอบเพื่อให้แน่ใจว่าเลือกเพียงสุขภาพปลาสำหรับปลาการทดลองทดลองได้สำรวจพฤติกรรมประจำวัน และไม่มีความผิดปกติ หรือโรคสัญญาณบันทึกช่วงนี้)2.9.1. กำหนดของ LD50 A. salmonicida เชื้อบน S. senegalensisแบคทีเรียเติบโตข้ามคืนใน TSB เสริม ด้วย 1.5%NaCL ที่ 25 องศาเซลเซียส เซลล์แบคทีเรีย centrifuged และล้างสองครั้งด้วยPBS มีการปรับปรุงการระงับเชื้อแบคทีเรียไปประมาณ 109 CFU mL−1ด้วย PBSกำหนดยุทธภัณฑ์ยา (LD50) ของเชื้อ A. salmonicida บนSenegalensis s ได้มีดำเนินการเพื่อสร้างความเข้มข้นของ A. salmonicida สามารถทำตายประมาณ 50% ของปลาสลบ72 h วัฒนธรรมของ A. salmonicida สดผลิตแล้ว resuspendedใน PBS เพื่อแนะนำเรื่องเกษตรอินทรีย์ในการลดรถถัง ถังควบคุมถูก inoculated กับ PBS โดยเพิ่มใด ๆของแบคทีเรีย ระงับเชื้อแบคทีเรียมีเพิ่มน้ำและเยาวชนปลาของรถถัง 4 จ้างถูกรักษาภายใต้ดีที่สุดสภาพการเจริญเติบโต ปลาตายถูกกำหนด โดยตรวจสอบภาพh ทุก 12 ดำเนิน assays สามอิสระในต่างที่ต้องการ2.9.2. phage บำบัดใน S. senegalensis juvenilesในการทดลองนี้ ได้ใช้กลุ่ม 4 ปลาสลบ แต่ละกลุ่มรวมตัวอย่าง 10 juveniles 3 (มีทั้งหมด 4 × 3 × 10 = 120 juvenilesต่อทดลอง) ตัวอย่างของกลุ่มแรกได้ติดเชื้อA. salmonicida และรับ AS A phage (กลุ่มทดสอบ: ปลา +แบคทีเรีย + phage−), ตัวอย่างของกลุ่มที่สองมีการติดเชื้อมีแบคทีเรีย แต่ไม่รับการ phage (ควบคุมแบคทีเรีย:ปลา + แบคทีเรีย), ตัวอย่างของกลุ่มที่สามไม่ติดเชื้อเพิ่มแบคทีเรียแต่ phages (phage ควบคุม: ปลา + Phage) และตัวอย่างของกลุ่มสี่รับไม่มีแบคทีเรียหรือ phages ปลาควบคุม: ปลา) ตัวอย่างที่ 3 ทั้งหมดของแต่ละกลุ่มได้รักษาในอิสระถัง แต่ละคนด้วยการใช้น้ำทะเลสังเคราะห์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ(4 ลิตร) (เตรียม โดยผสมเกลือ (Tropic ทะเล Tropic Marin ProReefเยอรมนี) กับน้ำจืดบริสุทธิ์ โดยหน่วยออสโมซิสผันกลับ), อุณหภูมิถูกเก็บรักษาที่ 22 ± 1.5 ° C ค่า pH 8.0 ± 0.2 เค็ม 35 และละลายออกซิเจนข้าง 5.5 mg L−1ในระหว่างการทดลองทั้งหมด วัฒนธรรมสดของ A. salmonicida ถูกเพิ่มการทดสอบแบคทีเรียและกลุ่มควบคุมได้รับความเข้มข้นสุดท้ายของ 108 CFU mL−1. ทันทีหลังจากแบคทีเรียนอกจากนี้ ระงับ phage ถูกเพิ่มลงในกลุ่มการทดสอบและควบคุม phage บรรลุสมาธิขั้นสุดท้ายของ 1010 CFU mL−1(อย 100)ในการทดลองแต่ละ A. salmonicida เป็น incubated ในหนังสังเคราะห์กอซน้ำทะเลที่ความเข้มข้น 108 CFU mL−1ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันเป็น assays บำบัด phage ที่อธิบายไว้ข้างต้น การกำหนดจำนวนแบคทีเรียในปลาสลบที่ autochthonousจุดเริ่มต้น ของประสบการณ์ และ การตรวจสอบลักษณะการทำงานของการเชื้อแบคทีเรียของปลาและ phages (ควบคุมแบคทีเรีย: salineน้ำ + แบคทีเรีย) มีเก็บตัวอย่างน้ำที่ 1, 6, 12, 24, 48และ h 72 สำหรับนับแบคทีเรียและ phage Dilutions ประจำได้มี incubated TSA ทำ และชุบในซ้ำและแผ่นที่30 ° C ใน 24 h. ปลาตายถูกกำหนด โดยตรวจสอบภาพh ทุก 12 ขั้นตอนนี้ถูกซ้ำสามครั้ง (สามอิสระassays) ในวันต่าง ๆ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 เส้นโค้งฆ่าแบคทีเรียยับยั้งแบคทีเรียได้รับการพิจารณาโดยใช้แบคทีเรียเอ salmonicida เป็นเจ้าภาพที่หลายหลากของการติดเชื้อ (กระทรวงมหาดไทย) 100 สำหรับการทดสอบแต่ละสองตัวอย่างการควบคุมถูกรวม: การควบคุมแบคทีเรีย(BC) และการควบคุมการทำลายจุลินทรีย์ (PC) ในขณะที่การควบคุมแบคทีเรียไม่ได้รับเชื้อมี phages ตัวควบคุมถูกทำลายจุลินทรีย์เชื้อด้วย phages แต่ไม่ได้มีเชื้อแบคทีเรีย ปุ่มควบคุมและทดสอบตัวอย่างถูกบ่มว่าในเงื่อนไขเดียวกันที่มี 3 ซ้ำการดำเนินการต่อตัวอย่าง. aliquots ของตัวอย่างทดสอบและการควบคุมหลังจากที่ถูกเก็บรวบรวม 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 และ 24 ชั่วโมงของการบ่ม ในการตรวจทั้งหมด titre ทำลายจุลินทรีย์ที่ถูกกำหนดในที่ซ้ำกันผ่านวิธีการชั้นวุ้นคู่หลังจากบ่มระยะเวลา 18 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ความเข้มข้นของแบคทีเรียที่ถูกกำหนดในที่ซ้ำกันในกลาง TSA (Liofilchem, อิตาลี) หลังจากระยะฟักตัวของ24 ชั่วโมงที่ 25 ° C สามทดลองที่เป็นอิสระได้ดำเนินการสำหรับแต่ละเงื่อนไข. 2.7 การตรวจหาแบคทีเรียใน prophage โฮสต์หลังการรักษาทำลายจุลินทรีย์ในการประเมินการเกิดขึ้นของการแปลงlysogenic (การประเมินถ้าทำลายจุลินทรีย์ที่ผ่านการทดสอบมีความสามารถในการรวมจีโนมของตัวเองในจีโนมของเชื้อแบคทีเรีย) ทดสอบ mitomycin C ถูกนำไปใช้ตามที่จะซิลวา, et al (2014a), ซิลวา, et al (2014b) กรณีที่ไม่มีโซนชัดเจนหลังจากการสัมผัสกับ mytomycin C ถูกตีความว่าเป็นตัวบ่งชี้ของการขาดงานของprophages ในจีโนมของเชื้อแบคทีเรีย สามอิสระตรวจได้ดำเนินการ. 2.8 การกำหนดความถี่ของการกลายพันธุ์ทำลายจุลินทรีย์แบคทีเรียที่เกิดขึ้นเองโดยธรรมชาติเอ salmonicida กลายพันธุ์ที่ทนต่อแบคทีเรียที่ถูกแยกออกโดยชุบวุ้นในสองชั้นที่มีการทำลายจุลินทรีย์(ที่ 109 PFU / มิลลิลิตรต่อแผ่น) ตาม Filippov et al, (2011) ในการคำนวณความถี่การกลายพันธุ์ตัวเลขเฉลี่ยของการกลายพันธุ์ใน 1 มิลลิลิตรของวัฒนธรรม (จัดทำขึ้นจากวัฒนธรรมphages) ที่ถูกแบ่งโดยตัวเลขรวมเฉลี่ยของสดเซลล์แบคทีเรีย(จัดทำขึ้นจากการเพาะเลี้ยงโดยไม่ต้อง phages) (Filippov et al., 2011) 2.9 ในการทดลองกับร่างกายหนุ่มสาวเอสนีกาเลนซิเอส หนุ่มสาวซีนีกาเลน (~ 30 มิลลิเมตรความยาวทั้งหมด) ได้รับเลือกเป็นแบบจำลองทางชีวภาพในการทดสอบประสิทธิภาพของการรักษาด้วยการทำลายจุลินทรีย์กับเอ salmonicida การติดเชื้อ หนุ่มสาวทั้งหมดที่ใช้ในการทดลองนี้กำลังซื้อที่ Safiestela ยั่งยืน Aquafarming ลงทุน Lda (กลุ่มSea8) ซึ่งเป็นโรงเพาะฟัก แต่เพียงผู้เดียวในเซเนกัลPóvoaทำวาร์ซิม (โปรตุเกส) นี้โรงเพาะฟักบังคับใช้โปรโตคอลการรักษาความปลอดภัยทางชีวภาพเพื่อป้องกันไม่ให้เกิดโรคในสิ่งอำนวยความสะดวกที่มีความสำคัญที่จะกระดูก ปลาทั้งหมดถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการโดยทีมงานวิจัยในภาชนะควบคุมอุณหภูมิด้วยบรรยากาศอิ่มตัวออกซิเจนและกักกันเพื่อให้แน่ใจว่าปลามีสุขภาพดีแต่เพียงผู้เดียวที่ถูกเลือกสำหรับการทดลองการทดลอง (ปลาที่ถูกสัมภาษณ์ทุกวันและไม่มีพฤติกรรมที่ผิดปกติหรือโรคสัญญาณเป็นบันทึกไว้ในช่วงเวลานี้). 2.9.1 การกำหนด LD50 ของการติดเชื้อ A. salmonicida ในเอสซีนีกาเลนแบคทีเรียเติบโตค้างคืนในTSB เสริมด้วย 1.5% โซเดียมคลอไรด์, ที่ 25 ° C เซลล์แบคทีเรียถูกปั่นและล้างครั้งที่สองกับพีบีเอส ระงับเชื้อแบคทีเรียมีการปรับประมาณ 109 CFU mL-1 กับพีบีเอส. การกำหนด Lethal Dose (LD50) ของการติดเชื้อ A. salmonicida ในเอส ซีนีกาเลนได้ดำเนินการเพื่อสร้างความเข้มข้นของเอ salmonicida สามารถที่จะทำให้เกิดการตายในประมาณ 50% ของเด็กและเยาวชนในปลา 72 ชั่วโมง วัฒนธรรมใหม่ของเอ salmonicida ถูกผลิตและ resuspended แล้วในพีบีเอสเพื่อลดการเปิดตัวของสารอินทรีย์ในถัง ถังควบคุมเชื้อด้วยพีบีเอสโดยไม่ต้องเติมใด ๆของเชื้อแบคทีเรีย ระงับแบคทีเรียถูกบันทึกลงไปในน้ำและเยาวชนปลาในสี่ถังลูกจ้างได้รับการดูแลที่ดีที่สุดภายใต้สภาวะการเจริญเติบโต การตายของปลาถูกกำหนดโดยการตรวจสอบภาพทุก 12 ชั่วโมง สามการวิเคราะห์อิสระได้ดำเนินการที่แตกต่างกันในวันที่. 2.9.2 การรักษาด้วยการทำลายจุลินทรีย์ในหนุ่มสาวเอสซีนีกาเลนในการทดลองเหล่านี้ 4 กลุ่มเด็กและเยาวชนของปลาถูกนำมาใช้ แต่ละกลุ่มรวม 3 ตัวอย่างจาก 10 หนุ่มสาวแต่ละคน (รวม 4 × 3 × 10 = 120 เยาวชนต่อการทดลอง) ตัวอย่างของกลุ่มแรกที่มีการติดเชื้อเอ salmonicida และรับการรักษาด้วย AS-A ฟาจ (กลุ่มการทดสอบ: ปลา + แบคทีเรีย + phage-) ตัวอย่างของกลุ่มที่สองมีการติดเชื้อที่มีเชื้อแบคทีเรียแต่ไม่ได้รับการรักษาด้วยฟาจ (การควบคุมแบคทีเรีย: ปลา + แบคทีเรีย) ตัวอย่างของกลุ่มที่สาม ไม่ได้ติดเชื้อแบคทีเรียแต่ phages ถูกเพิ่ม (ควบคุม phage: ปลา + Phage) และตัวอย่างของกลุ่มที่สี่ไม่ได้รับเชื้อแบคทีเรียหรือphages (ปลาควบคุมปลา) ทั้งหมด 3 ตัวอย่างของแต่ละกลุ่มได้รับการเก็บรักษาไว้ในที่เป็นอิสระถังแต่ละคนที่มีเครื่องฟอกอากาศและน้ำทะเลสังเคราะห์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อ(4 ลิตร) (จัดทำขึ้นโดยการผสมเกลือ Tropic Marin ProReef (Tropic ทะเลเยอรมนี) กับน้ำจืดบริสุทธิ์โดยหน่วยออสโมซิกลับ) อุณหภูมิไว้ที่22 ± 1.5 องศาเซลเซียสพีเอช 8.0 ± 0.2 ความเค็ม 35 และละลายออกซิเจนข้างต้น5.5 มก. L-1 ในระหว่างการพิจารณาคดีทั้งหมด วัฒนธรรมสดของเอ salmonicida ถูกบันทึกอยู่ในกลุ่มการทดสอบและการควบคุมแบคทีเรียที่จะได้รับความเข้มข้นสุดท้าย108 CFU mL-1 ทันทีหลังจากที่แบคทีเรียนอกจากนี้การระงับการทำลายจุลินทรีย์ถูกบันทึกอยู่ในกลุ่มการทดสอบและการควบคุมการทำลายจุลินทรีย์ที่จะบรรลุความเข้มข้นสุดท้ายของ1010 CFU mL-1 (MOI 100). ในการทดลองแต่ละ A. salmonicida ถูกบ่มในสังเคราะห์ผ่านการฆ่าเชื้อน้ำทะเลที่มีความเข้มข้นของ108 CFU mL-1 ภายใต้เงื่อนไขเดียวกันในขณะที่การตรวจรักษาด้วยการทำลายจุลินทรีย์อธิบายไว้ข้างต้นเพื่อตรวจสอบจำนวนแบคทีเรียautochthonous อยู่ในปลาเด็กและเยาวชนที่จุดเริ่มต้นของประสบการณ์และการตรวจสอบพฤติกรรมของแบคทีเรียในกรณีที่ไม่มีปลาและ phages (การควบคุมแบคทีเรีย: น้ำเกลือน้ำ+ แบคทีเรีย) เก็บตัวอย่างน้ำที่ 1, 6, 12, 24, 48, และ 72 ชั่วโมงสำหรับปริมาณแบคทีเรียและทำลายจุลินทรีย์ เจือจางอนุกรมถูกดำเนินการและชุบ TSA ในแผ่นที่ซ้ำกันและได้รับการบ่มที่อุณหภูมิ30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง การตายของปลาถูกกำหนดโดยการตรวจสอบภาพทุก 12 ชั่วโมง ขั้นตอนนี้ซ้ำสามครั้ง (สามอิสระตรวจ) ในวันที่แตกต่างกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 แบคทีเรียแบคทีเรียฆ่าเส้นโค้ง
เมื่อใช้วิเคราะห์แบคทีเรีย
. salmonicida เป็นโฮสต์ที่หลายหลากของการติดเชื้อ ( MOI ) 100 สำหรับแต่ละ (
2 การควบคุมจำนวนรวม :
ควบคุมแบคทีเรีย ( BC ) และควบคุมเฟจ ( PC ) ในขณะที่การควบคุมแบคทีเรียไม่ใส่
กับฟาจ , ฟาจในการควบคุมเชื้อกับ
แต่ไม่ใช่กับแบคทีเรียการควบคุมและตัวอย่างทดสอบโดยตรง
ในเงื่อนไขเดียวกัน มี 3 ซ้ำถูกดำเนินการต่อตัวอย่าง
เฉยๆของตัวอย่างทดสอบและการควบคุมภายหลังการเก็บ 0 , 2 , 4 , 6 , 8 ,
10 , 12 และ 24 ชั่วโมงของการบ่ม ในสามารถถูกกำหนดว่า titre
ในซ้ำผ่านคู่วุ้นชั้นวิธีหลังจากบ่ม
ระยะเวลา 18 ชั่วโมง อุณหภูมิ 25 องศาแบคทีเรียความเข้มข้นตั้งใจ
ในซ้ำใน TSA ขนาดกลาง ( liofilchem , อิตาลี ) หลังจากระยะฟักตัว
24 H 25 ° C สามอิสระทดลองสำหรับ

แต่ละเงื่อนไข ปี การตรวจหาแบคทีเรียใน prophage โฮสต์หลังจากที่ฟาบำบัด
เพื่อประเมินการเกิดการแปลงไลโซจีนิก ( ประเมิน
ถ้าทดสอบว่ามีความสามารถในการรวม
จีโนมของตนเองในจีโนมของแบคทีเรีย ) , , C แบบประยุกต์ ตาม
กับซิลวา et al . ( 2014a ) , ซิลวา et al . ( 2014b ) ขาด
ใสหลังจากการเปิดรับ mytomycin C ถูกตีความเป็นตัวบ่งชี้ของการขาด prophages
ในจีโนมแบคทีเรีย 3 ) มีการใช้อิสระ
.
2.8 . การหาความถี่ของเฟจแบคทีเรียสายพันธุ์ธรรมชาติธรรมชาติ
Asalmonicida กลายพันธุ์ ป้องกันแบคทีริโอฟาดจ์ถูก
ที่ชุบบน Layer วุ้นกับฟา ( 109 พีเอฟยู / มิลลิลิตร /
จาน ) ตาม filippov et al . ( 2011 ) เพื่อหาการกลายพันธุ์ของ
หมายถึงตัวเลขของการกลายพันธุ์ใน 1 มิลลิลิตรของวัฒนธรรม ( ที่เตรียมจาก
วัฒนธรรมกับฟาจ ) แบ่งโดยรวมหมายเลขของชีวิต
เซลล์แบคทีเรีย ( ที่เตรียมจากวัฒนธรรมโดยฟาจ ) ( filippov
et al . , 2011 ) .
2.9 . โดยการทดลองกับเยาวชน
S . S . เซเนกัลเซเนกัลและ ~ 30 มม. ความยาวรวม ) ได้รับเลือกเป็นแบบทดสอบประสิทธิภาพทางชีวภาพ

a salmonicida ฟาบำบัดต่อเชื้อ และทั้งหมดที่ใช้ในการทดลองซื้อ
ที่ safiestela ยั่งยืน aquafarming การลงทุนlda . ( กลุ่ม
sea8 ) , เซเนกัลในโรงเพาะฟัก แต่เพียงผู้เดียว P ó VOA ทำวาร์ซิม ( โปรตุเกส ) โรงเพาะฟักนี้ ทางชีวภาพความปลอดภัย
บังคับใช้พิธีสารเพื่อป้องกันโรค ในเครื่องของมัน
เน้นเพื่อการกำจัดสารหนู . ปลาทั้งหมดถูกส่งไปยัง
ปฏิบัติการ โดยทีมวิจัยในการควบคุมอุณหภูมิคอนเทนเนอร์
กับออกซิเจนอิ่มตัว บรรยากาศ และกักกันไว้เพื่อให้แน่ใจว่า
แต่เพียงผู้เดียว สุขภาพปลาถูกเลือกสำหรับการทดลองการทดลอง ( ปลา
สํารวจทุกวัน และไม่มีพฤติกรรมที่ผิดปกติ หรือ โรค สัญญาณที่ถูกบันทึก
ช่วงนี้ ) .
: . การกำหนด ld50 . salmonicida การติดเชื้อ S . เซเนกัล
แบคทีเรียเติบโตค้างคืนใน TSB ที่เติม NaCl 1.5%
ที่ 25 ° C ) ที่ระดับเซลล์แบคทีเรียและล้างสองครั้งกับ
PBSระงับเชื้อแบคทีเรียปรับประมาณ 109 CFU ml − 1
กับ PBS .
กำหนดขนาดที่ทำให้ตายได้ ( ld50 ) ของ salmonicida การติดเชื้อบน
S . เซเนกัลในการปฏิบัติเพื่อสร้างความเข้มข้น
. salmonicida สามารถทำให้เสียชีวิตได้ประมาณ 50% ของเยาวชนปลา
72 ชั่วโมง วัฒนธรรมใหม่ของ . salmonicida ผลิตแล้ว resuspended
ใน PBS เพื่อลดการแนะนำของสารอินทรีย์ใน
รถถัง การควบคุมรถถังเป็นเชื้อกับ PBS โดยนอกจากนี้
ของแบคทีเรีย bacterial suspension ที่ถูกเพิ่มเข้าไปในน้ำและปลาเยาวชน
ของสี่ถังใช้ เก็บรักษาภายใต้สภาวะการเติบโตที่ดีที่สุด

อัตราการตายของปลาถูกกำหนดโดย
ตรวจสอบทุก 12 ชั่วโมง3 ) อิสระแสดงในช่องต่าง ๆ
.
2.9.2 . ฟาบำบัดใน S . เซเนกัลเยาวชน
ในการทดลองเหล่านี้ 4 กลุ่มของเยาวชนที่ปลาใช้ แต่ละกลุ่ม
รวม 3 ตัวอย่าง 10 เยาวชนแต่ละ ( รวม 4 × 3 × 10
= 120 เยาวชนต่อการทดลอง ) ตัวอย่างของกลุ่มที่ติดเชื้อและรักษาด้วย
. salmonicida as-a เฟจ ( กลุ่มปลา
ทดสอบแบคทีเรียเฟจ− ) ตัวอย่างของกลุ่มที่ติดเชื้อ
กับแบคทีเรีย แต่ไม่ถือกับว่า ( การควบคุม :
ปลาแบคทีเรียแบคทีเรีย ) ตัวอย่างของกลุ่มที่ไม่ติดเชื้อแบคทีเรีย แต่พบว่าฟา
เพิ่ม ( ควบคุมปลา : ฟาฟา ) และ
ตัวอย่างของกลุ่มที่ได้รับทั้ง แบคทีเรีย หรือ ฟาจ ( ปลา
ควบคุมปลา )