Mutations that improve fluorescent

Mutations that improve fluorescent proteins as imaging probes

Because of the unique β-barrel fold of fluorescent proteins, mutations of residues throughout the entire protein have the potential to significantly change their fluorescent properties. As is highlighted in the poster, the most striking result of such mutations is the wide range of different emission colors that is currently available, which greatly increases the usefulness of these proteins as molecular probes. However, most single mutations have a negative impact on the tight packing of the FP β-barrel and, therefore, result in greater environmental sensitivity and reduced brightness. Although some of these defects can be compensated for by additional mutations, derivative FPs are often less bright and/or more sensitive to the environment compared with the original protein. This phenomenon has been especially evident during the search for truly monomeric versions of the tetrameric red fluorescent protein of the coral Discosoma sp. (DsRed). Although several such monomeric variants have been generated, they are significantly less bright that the original DsRed (Shaner et al., 2004; Shaner et al., 2008).

To be able to use jellyfish-derived GFPs in mammalian systems, several properties of the original GFP had to be modified and such modifications are now found in all of the commonly used variants (see ‘Critical mutations’ in the poster). First, the maturation of the fluorescence was optimized for use at 37°C. Maturation of the wild-type GFP chromophore is efficient at temperatures lower than 28°C but increasing the temperature to 37°C substantially reduces the maturation rate and decreases fluorescence (Patterson et al., 1997). A single mutation of F64L (Cormack et al., 1996) results in a dramatically improved maturation of fluorescence at 37°C. Although this mutation is present in most of the popular varieties of FPs derived from A. victoria, mutations of additional residues have since been found to improve protein folding and the efficiency of chromophore formation (Tsien, 1998). Other important mutations include S30R for a faster folding rate (Pedelacq et al., 2006), Q69M, which improves photostability and resistance to chloride and low pH (Griesbeck et al., 2001), S72A, which enhances folding and stability (Cubitt et al., 1998), S147P for faster maturation (Kimata et al., 1997), N149K for improved folding rate (Cubitt et al., 1998), V163A, which reduces hydrophobicity and enhances folding (Crameri et al., 1996), and I167T for reduced thermosensitivity (Heim et al., 1994).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การกลายพันธุ์ที่ปรับปรุงโปรตีนเรืองแสงในขณะที่ยานสำรวจถ่ายภาพ

เพราะพับβ-ถังที่ไม่ซ้ำกันของโปรตีนเรืองแสง, การกลายพันธุ์ของสารตกค้างตลอดโปรตีนทั้งมีศักยภาพในการอย่างมีนัยสำคัญเปลี่ยนคุณสมบัติเรืองแสงของพวกเขา ที่เป็นไฮไลต์ในโปสเตอร์ที่ผลที่โดดเด่นที่สุดของการกลายพันธุ์ดังกล่าวเป็นช่วงกว้างของสีที่แตกต่างกันการปล่อยที่มีอยู่ในปัจจุบันซึ่งเพิ่มขึ้นอย่างมากประโยชน์ของโปรตีนเหล่านี้เป็นเครื่องตรวจระดับโมเลกุล แต่การกลายพันธุ์เดียวส่วนใหญ่จะมีผลกระทบต่อการบรรจุแน่นของ FP β-บาร์เรลและมีผลให้ความไวต่อสิ่งแวดล้อมมากขึ้นและความสว่างที่ลดลงแม้ว่าบางส่วนของข้อบกพร่องเหล่านี้สามารถได้รับการชดเชยจากการกลายพันธุ์เพิ่มเติมเฟรมต่อวินาทีอนุพันธ์มักจะไม่สดใสและ / หรือความไวต่อสภาพแวดล้อมเมื่อเทียบกับโปรตีนที่เป็นต้นฉบับ ปรากฏการณ์นี้ได้รับการเห็นได้ชัดโดยเฉพาะอย่างยิ่งในระหว่างการค้นหาสำหรับเวอร์ชัน monomeric อย่างแท้จริงของ tetrameric โปรตีนเรืองแสงสีแดงของเอสพี Discosoma ปะการัง (dsred)แม้ว่าหลายสายพันธุ์ monomeric ดังกล่าวได้รับการสร้างพวกเขาอย่างมีนัยสำคัญน้อยสดใสที่ dsred เดิม. (Shaner et al, 2004;.. Shaner et al, 2008)

เพื่อให้สามารถใช้ gfps แมงกะพรุนมาในระบบการเลี้ยงลูกด้วยนมคุณสมบัติหลาย ๆ อย่างของ GFP เดิมจะต้องมีการปรับเปลี่ยนและการปรับเปลี่ยนดังกล่าวจะพบว่าขณะนี้ในทุกสายพันธุ์ที่ใช้กันทั่วไป (ดู 'การกลายพันธุ์ที่สำคัญในโปสเตอร์) แรกสุกของการเรืองแสงถูกปรับให้เหมาะสมสำหรับการใช้งานที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสสุกของป่าชนิด gfp chromophore มีประสิทธิภาพที่อุณหภูมิต่ำกว่า 28 องศาเซลเซียส แต่อุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นถึง 37 ° c อย่างมากจะช่วยลดอัตราการเจริญเติบโตและลดการเรืองแสง (แพตอัล., 1997) การกลายพันธุ์เดียวของ f64l (แมคค์และคณะ. 1996) ส่งผลให้การเจริญเติบโตดีขึ้นอย่างมากของการเรืองแสงที่ 37 องศาเซลเซียสแม้ว่าการกลายพันธุ์นี้อยู่ในส่วนของสายพันธุ์ที่นิยมของเฟรมต่อวินาทีได้มาจาก victoria การกลายพันธุ์ของสารตกค้างเพิ่มเติมได้ตั้งแต่ถูกพบในการปรับปรุงการพับโปรตีนและประสิทธิภาพของการสร้าง chromophore (Tsien, 1998) การกลายพันธุ์ที่สำคัญอื่น ๆ รวมถึง s30r สำหรับอัตราการพับเร็ว (pedelacq และคณะ. 2006), q69m,ที่ช่วยเพิ่ม photostability และความต้านทานต่อคลอไรด์และพีเอชต่ำ (Griesbeck et al,., 2001), s72a ซึ่งช่วยเพิ่มการพับและความมั่นคง (คิวบิตต์และอัล., 1998), s147p ให้สุกเร็ว (kimata et al,., 1997), n149k เพื่อ การปรับปรุงอัตราการพับเก็บได้ (คิวบิตต์และคณะ. 1998) v163a, ซึ่งจะช่วยลดและเพิ่ม hydrophobicity พับ (crameri และคณะ. 1996)และการลดลง i167t thermosensitivity (เฮย์มเอตอัล. 1994)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กลายพันธุ์ที่ปรับปรุงโปรตีนเรืองแสงเป็นภาพคลิปปากตะเข้

เพราะพับβ-กระบอกเฉพาะของโปรตีนเรืองแสง ของตกค้างตลอดทั้งโปรตีนที่กลายพันธุ์อาจเปลี่ยนคุณสมบัติเรืองแสง เป็นเน้นในโปสเตอร์ ผลโดดเด่นที่สุดของการกลายพันธุ์ดังกล่าวเป็นช่วงกว้างของสีปล่อยก๊าซต่าง ๆ ที่มีอยู่ ที่มากเพิ่มประโยชน์ของโปรตีนเหล่านี้เป็นคลิปปากตะเข้โมเลกุล อย่างไรก็ตาม กลายพันธุ์เดียวมากที่สุดมีค่าลบผลกระทบบนบรรจุแน่น FP β-กระบอก และ ดังนั้น ทำให้ความไวต่อสิ่งแวดล้อมมากขึ้น และลดความสว่าง แม้ว่าบางส่วนของข้อบกพร่องเหล่านี้สามารถจะชดเชย โดยการกลายพันธุ์เพิ่มเติม แบบ FPs จะมักน้อยสดใส หรืออ่อนไหวกับสิ่งแวดล้อมเทียบกับโปรตีนดั้งเดิม ปรากฏการณ์นี้ได้ชัดโดยเฉพาะอย่างยิ่งในระหว่างการค้นหาอย่างแท้จริง monomeric รุ่น tetrameric โปรตีนเรืองแสงสีแดงของ sp. Discosoma โครอล (DsRed) ถึงแม้ว่ามีการสร้างตัวแปรต่าง ๆ เช่น monomeric มีความสว่างน้อยลงอย่างมีนัยสำคัญที่ DsRed ต้นฉบับ (Shaner et al., 2004 Shaner et al., 2008)

สามารถใช้แมงกะพรุนมา GFPs ในระบบ mammalian คุณสมบัติต่าง ๆ ของ GFP เดิมได้ปรับเปลี่ยน และปรับเปลี่ยนดังกล่าวนี้พบในทั้งหมดของตัวแปรที่ใช้ทั่วไป (ดู 'กลายพันธุ์สำคัญ' ในโปสเตอร์ที่) ครั้งแรก พ่อแม่ของ fluorescence ที่ถูกเหมาะกับการใช้ที่ 37 องศาเซลเซียส พ่อแม่ของ chromophore GFP ป่าชนิดมีประสิทธิภาพที่อุณหภูมิต่ำกว่า 28 องศา C แต่เพิ่มอุณหภูมิ 37° c มากลดอัตราพ่อแม่ และลด fluorescence (Patterson และ al., 1997) การกลายพันธุ์หนึ่งของ F64L (Cormack et al., 1996) ผลลัพธ์ในพ่อแม่ที่ดีขึ้นอย่างมากของ fluorescence ที่ 37 องศาเซลเซียส แม้ว่าการกลายพันธุ์นี้เป็นพันธุ์ยอดนิยมของ FPs ที่ได้มาจากอ.วิคตอเรียอยู่ กลายพันธุ์เพิ่มเติมตกตั้งแต่พบปรับปรุงพับโปรตีนและประสิทธิภาพของ chromophore ก่อ (Tsien, 1998) กลายพันธุ์ที่สำคัญอื่น ๆ รวม S30R สำหรับพับเร็วอัตรา (Pedelacq และ al., 2006), Q69M ซึ่งปรับปรุง photostability และทนต่อคลอไรด์และ pH ต่ำ (Griesbeck et al., 2001), S72A ซึ่งช่วยพับและเสถียรภาพ (Cubitt et al., 1998), S147P สำหรับเร็วพ่อแม่ (Kimata และ al., 1997), N149K สำหรับปรับปรุงพับอัตรา (Cubitt et al., 1998), V163A ซึ่งลด hydrophobicity และช่วยพับ (Crameri et al., 1996), และ I167T สำหรับ thermosensitivity ลดลง (Heim et al., 1994)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัสซึ่งจะช่วยเพิ่มโปรตีนเรืองแสงเป็นการถ่าย ภาพ การ สอบถาม

เพราะของแบบพับเก็บเฉพาะ - บาร์เรลที่โดดเด่นของเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัสโปรตีนเรืองแสงของสารตกค้างตลอดทั่วทั้งพื้นที่โปรตีนทั้งหมดที่มี ศักยภาพ ที่จะมีการเปลี่ยนคุณสมบัติของฟลูออเรสเซนต์ของพวกเขา ตามที่เป็นอยู่ถูกไฮไลท์ให้เด่นชัดขึ้นในโปสเตอร์ส่งผลให้ความโดดเด่นอย่างสูงสุดของเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัสดังกล่าวมีความหลากหลายของสีสันที่แตกต่างกันไปการมีอยู่ในปัจจุบันซึ่งเป็นการเพิ่มประโยชน์ของโปรตีนเหล่านี้เป็นการสอบถามโมเลกุล แต่ถึงอย่างไรก็ตามยังเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัสเดียวมากที่สุดได้รับผลกระทบในด้านลบที่อยู่ในบรรจุ ภัณฑ์ จำกัดของ FP เฉพาะแกนม้วนผมและส่งผลให้ในระดับความไวต่อสิ่งแวดล้อมมากขึ้นและลดความสว่างแม้ว่าจะมีข้อบกพร่องบางส่วนเหล่านี้จะสามารถได้รับการชดเชยโดยเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัสเพิ่มเติม FPS ดัดแปลงมาจากมักมีน้อยความสว่างสดใสและ/หรือมากกว่าที่สำคัญใน สภาพแวดล้อม ที่เมื่อเทียบกับโปรตีนจากเดิมได้ ปรากฎการณ์นี้ได้รับการโดยเฉพาะเห็นได้ชัดในระหว่างการค้นหาสำหรับรุ่น monomeric อย่างแท้จริงของโปรตีนเรืองแสงสีแดง tetrameric ของแนวปะการังที่ discosoma sp . ( dsred )แม้ว่าจะแตกต่าง monomeric ดังกล่าวหลายแห่งได้ถูกสร้างขึ้นก็จะน้อยลงความสว่างสดใสที่เดิม dsred ( shaner et al . 2004 shaner et al . 2008 )

สามารถใช้ gfps แมงกะพรุนมาในระบบเกี่ยวกับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมคุณสมบัติต่างๆของ gfp เดิมจะต้องได้รับการแก้ไขนั้นได้รับการแก้ไขและจะได้พบในเวอร์ชันใช้งานทั่วไป(ดูได้จากบท'ที่มีความสำคัญเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัส'ในโปสเตอร์)ทั้งหมดในขณะนี้ เป็นครั้งแรกที่ฝึกตนของคุณสมบัติฟลูเรซ - เซ็นซที่เป็นการปรับแต่งสำหรับการใช้งานที่ 37 ° Cฝึกตนของป่า - พิมพ์ gfp chromophore มี ประสิทธิภาพ ในที่ที่มี อุณหภูมิ สูงเกินกว่า 28 ° C แต่การเพิ่ม อุณหภูมิ ที่ 37 ° C ส่วนสำคัญที่ช่วยลดอัตราดอกเบี้ยและฝึกตนจะลดลงคุณสมบัติฟลูเรซ - เซ็นซ(แพตเตอร์สัน et al ., 1997 ) หนึ่งเดียวคือมันของ F 64 L ( cormack et al . 1996 )ผลลัพธ์ในฝึกตนที่ได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นในคุณสมบัติฟลูเรซ - เซ็นซ C 37 °แม้ว่าคือมันนี้จะอยู่ในความหลากหลายได้รับความนิยมของ FPS ที่ได้รับมาจากวิกตอเรีย A .มากที่สุดในเรื่องสารเคมีตกค้างเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัสเพิ่มเติมพบว่ามีการเพิ่มโปรตีนพับได้และมี ประสิทธิภาพ ในการจัดตั้งการจัดตั้ง chromophore ( tsien 1998 )นับตั้งแต่ ฉับไว.พลังอำนาจที่สำคัญอื่นๆรวมถึง s 30 R สำหรับอัตราแบบพับเก็บได้เร็วขึ้น( pedelacq et al . 2006 ) Q 69 ม.ซึ่งจะช่วยเพิ่ม ประสิทธิภาพ และความทนทานต่อการ photostability คลอไรด์และ pH ต่ำ( griesbeck et al ., 2001 ), S 72 ,ซึ่งช่วยปรับปรุง เสถียรภาพ และพับ( cubitt et al ., 1998 ), S 147 P สำหรับฝึกตนได้เร็วขึ้น( kimata et al ., 1997 ), N 149 K สำหรับการพับได้( cubitt et al ., 1998 ), V 163 ,ซึ่งช่วยลด hydrophobicity และช่วยเพิ่มพับได้( crameri et al ., 1996 )และ ฉัน 167 T สำหรับ thermosensitivity ลดลง(จำพวก et al . 1994 )