AbstractThis study investigates whe

Abstract

This study investigates whether antigenic evolution within H1N1 swine influenza viruses can compromise vaccine efficacy and, specifically, whether the A/New Jersey/8/76 strain in the commercial swine influenza vaccines needs to be updated. Pigs were vaccinated twice intramuscularly with experimental monovalent vaccines derived from different H1N1 strains (A/New Jersey/8/76, Sw/Belgium/1/83 or Sw/Belgium/1/98) or with a commercial bivalent vaccine based on A/New Jersey/8/76 (H1N1) and A/Port Chalmers/1/73 (H3N2). Experimental and commercial vaccines contained a different adjuvant. Two weeks after the second vaccination, all pigs were challenged intratracheally with Sw/Belgium/1/98. Mean pre-challenge haemagglutination inhibition (HI) antibody titres against the challenge virus were lower for the experimental A/New Jersey/8/76 vaccine than for the other vaccines. The reduction in mean virus titres in the lungs was highly significant for the latter vaccines, including the commercial New Jersey-derived vaccine, but not for the experimental A/New Jersey/8/76 vaccine. Clinical signs after challenge were negligible in all vaccinates. Post-challenge levels of interferon-α and tumor necrosis factor-α in bronchoalveolar lavage fluids were reduced in the vaccinates, while levels of interleukin-1 and neutrophils were less consistent. Though the A/New Jersey/8/76 strain is less effective in preventing infection by Sw/Belgium/1/98 than the homologous virus or than Sw/Belgium/1/83, all strains can protect completely if antibody titres against the challenge virus are sufficiently high. Apart from the vaccine strain, adjuvant and antigenic dose may play a crucial role in vaccine efficacy.







Keywords
H1N1 swine influenza virus;
Vaccines;
Antigenic evolution;
Protection;
Cytokines
. Pigs

A total of 44 pigs were bought from an influenza virus-seronegative farm at the age of 4 weeks. They were divided at random into five groups of eight and one group of four pigs and housed in isolation units with HEPA-filtered air. Water and feed were provided ad libitum.

2.2. Viruses

The A/New Jersey/8/76 virus was received from the WHO Influenza Centre, Munchen, Germany. The Sw/Belgium/1/83 and Sw/Belgium/1/98 viruses were obtained from outbreaks of swine influenza on farms in Belgium during 1983 and 1998, respectively. Both viruses were characterized as avian-like H1N1 swine influenza viruses in cross haemagglutination inhibition (HI) tests. All viruses were propagated and titrated in 10-day-old embryonated chicken eggs, using standard methods. Viruses used for HI tests and for vaccine preparation were at the 4th egg passage, the Sw/Belgium/1/98 challenge virus was at the 3rd egg passage.

2.3. Vaccines

Monovalent whole-virus vaccines containing A/New Jersey/8/76, Sw/Belgium/1/83 or Sw/Belgium/1/98 were prepared from egg allantoic fluid and inactivated with β-propiolactone. The vaccines were prepared by Intervet NV (Boxmeer, The Netherlands) and diluted in phosphate-buffered saline (PBS) to give 320 HA units (HAU) per 0.8 ml. Each vaccine dose contained 0.8 ml antigen and 1.2 ml adjuvant consisting of an oil-in-water emulsion plus vitamin E (Microsol Diluvac Forte®, Intervet NV).

The commercial vaccine is a bivalent split-virus product containing A/New Jersey/8/76 (H1N1) and A/Port Chalmers/1/73 (H3N2) in an oil-in-water adjuvant (Gripovac®, Merial SA, Lyon, France). The manufacturer uses a serological method to determine the minimal antigenic content. Each vaccine dose contains at least 1.7 HI units (HIU) of the A/New Jersey/8/76 strain. One HIU is defined as the quantity needed to obtain an HI antibody titre of 1 log10 after two vaccinations of pigs.

2.4. Vaccination and challenge protocols

Two groups of four and eight pigs were not vaccinated and served as uninoculated control and challenge control groups, respectively. Three groups of eight pigs were vaccinated with one of the three experimental vaccines containing either A/New Jersey/8/76 or Sw/Belgium/1/83 or Sw/Belgium/1/98. Another group of eight pigs was vaccinated with the commercial vaccine. Pigs were given a first vaccination at the age of 4 weeks and a booster vaccination at 8 weeks. The vaccines were administered in 2 ml doses by deep intramuscular injection into the neck.

Two weeks after the second vaccination, all except the 4 uninoculated control pigs were challenged intratracheally with 7.5 log10 EID50 of the Sw/Belgium/1/98 isolate in 8 ml PBS. The pigs were held in vertical position with their neck extended. A needle was inserted right through the skin cranial to the sternum and the inoculum was injected. Rectal temperatures and signs of respiratory disease were recorded daily from 3 days before challenge until euthanasia. Body temperatures ≥40 °C were considered as fever. The four uninoculated control pigs were euthanatized 24 h after the challenge. In the other groups, four out of eight pigs were euthanatized at 24 h and the remaining four at 72 h.

2.5. Serology

Blood samples of all pigs were collected at the time of the first and second vaccinations and immediately before challenge. The sera were adsorbed onto chicken erythrocytes to remove non-specific inhibitors of haemagglutination. Sera were examined in HI tests against the A/New Jersey/8/76, Sw/Belgium/1/83 and Sw/Belgium/1/98 viruses. HI tests were performed according to standard procedures [21].

2.6. Virus titrations of lung tissue

Samples from the upper part of the diaphragmatic lobe of the left lung were used for titrations in 10-day-old embryonated chicken eggs, according to standard procedures [21]. The eggs were inoculated with 0.2 ml of 10-fold dilutions of 20% lung tissue suspensions (four eggs per dilution) by the allantoic route. After 72 h incubation at 37 °C, the allantoic fluid was tested for haemagglutinating activity, using 0.5% chicken erythrocyte suspensions.

2.7. Lung inflammatory parameters

The right lung of pigs euthanatized at 24 h after the challenge was lavaged with 200 ml of phosphate-buffered saline. Bronchoalveolar lavage (BAL) cells were separated by centrifugation at 400×g, and cytospin preparations were stained with DiffQuik (Baxter, Düdingen, Switzerland) to determine the percentage of neutrophils.



Cell-free BAL fluids were concentrated 10 times by dialysis against 20% polyethylene glycol (molecular weight 20 000), cleared of residual virus by ultracentrifugation at 100 000×g and stored at −70 °C until use in cytokine bioassays [22]. Interferon-α (IFN-α) activity was determined in a cytopathic effect reduction assay by use of MDBK cells and vesicular stomatitis virus. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) was assayed as cytotoxic activity in PK (15) subclone 15 cells in the presence of actinomycin D. Interleukin-1 (IL-1) was measured as proliferative activity in D10 (N4) M cells in the presence of concanavalin A and recombinant human IL-2. Percentage of proliferation was determined by the thiazolyl blue (MTT) conversion procedure. Rabbit antisera against recombinant porcine IFN-α (gift from C. La Bonnardière, Jouy en Josas, INRA, France) and against recombinant human TNF-α (Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium) and monoclonal rat anti-mouse IL-1 receptor type 1 antibodies (BD Pharmingen, Heidelberg, Germany) were used to demonstrate specificity of the bioassay results. Laboratory standards were run in each bioassay and used for correction of titres of samples. Samples were tested in three (IFN-α, TNF-α) or two (IL-1; duplicates of samples) independent bioassays, and geometric mean titres of the corrected values were calculated.

2.8. Statistical analysis

Log-transformed results (HI antibody titres, virus titres) were subjected to analysis of variance and comparisons between unvaccinated control pigs and the different vaccine groups were analyzed by Student's t-test. Rectal temperatures were analyzed as untransformed data. Spearman rank correlation tests were used to compare geometric mean cytokine responses per animal and virus titres. Samples which tested negative for virus were given a numeric value of 1.0 log10 EID50 per g lung (detection limit 1.1 log10). Samples which tested negative for cytokines were given a value of 10 U (IFN-α, detection limit 20 U) or 20 U/ml BAL fluid (TNF-α and IL-1, detection limit 40 U).

3. Results

3.1. Serological response to vaccination

All pigs were negative for influenza virus antibodies at the start of the experiment, and the 12 unvaccinated pigs were seronegative at all times examined.

After one vaccination, all pigs had antibodies against the homologous H1N1 strain in the vaccine, but heterologous antibody titres were either considerably lower or undetectable. The geometric mean HI antibody titre against Sw/Belgium/1/98 was only 4 in the New Jersey/76 and Sw/Belgium/83 groups, 29 in the Sw/Belgium/98 group, and 17 in the commercial vaccine group.

Two weeks after the second vaccination, at the time of challenge, all pigs had developed cross-reactive HI antibodies. Mean HI titres in the four vaccinated groups are shown in Fig. 1. The three experimental vaccines induced comparable antibody titres against the homologous virus, with mean HI titres of 305 in the New Jersey/76 group, 235 in the Sw/Belgium/83 group and 197 in the Sw/Belgium/98 group. The antibody response against the homologous virus was considerably higher than that against the Sw/Belgium/1/98 challenge virus in both the New Jersey/76 and Sw/Belgium/83 groups. However, the ratio homologous:challenge virus antibody titre was 19:1 in the New Jersey/76 group, but only 2.6:1 in the Sw/Belgium/83 group. Antibody levels to the challenge virus were significantly lower in the New Jersey/76 group (mean HI titre 16) than in the Sw/Belgium/83 (mean HI titre 91) or Sw/Belgium/98 (mean HI titre 197) groups (P

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บทคัดย่อThis study investigates whether antigenic evolution within H1N1 swine influenza viruses can compromise vaccine efficacy and, specifically, whether the A/New Jersey/8/76 strain in the commercial swine influenza vaccines needs to be updated. Pigs were vaccinated twice intramuscularly with experimental monovalent vaccines derived from different H1N1 strains (A/New Jersey/8/76, Sw/Belgium/1/83 or Sw/Belgium/1/98) or with a commercial bivalent vaccine based on A/New Jersey/8/76 (H1N1) and A/Port Chalmers/1/73 (H3N2). Experimental and commercial vaccines contained a different adjuvant. Two weeks after the second vaccination, all pigs were challenged intratracheally with Sw/Belgium/1/98. Mean pre-challenge haemagglutination inhibition (HI) antibody titres against the challenge virus were lower for the experimental A/New Jersey/8/76 vaccine than for the other vaccines. The reduction in mean virus titres in the lungs was highly significant for the latter vaccines, including the commercial New Jersey-derived vaccine, but not for the experimental A/New Jersey/8/76 vaccine. Clinical signs after challenge were negligible in all vaccinates. Post-challenge levels of interferon-α and tumor necrosis factor-α in bronchoalveolar lavage fluids were reduced in the vaccinates, while levels of interleukin-1 and neutrophils were less consistent. Though the A/New Jersey/8/76 strain is less effective in preventing infection by Sw/Belgium/1/98 than the homologous virus or than Sw/Belgium/1/83, all strains can protect completely if antibody titres against the challenge virus are sufficiently high. Apart from the vaccine strain, adjuvant and antigenic dose may play a crucial role in vaccine efficacy.คำสำคัญไวรัส H1N1 สุกรไข้หวัดใหญ่ รู้ วิวัฒนาการ antigenic ป้องกัน Cytokines. สุกรจำนวนสุกรที่ 44 ได้ซื้อจากฟาร์ม seronegative ไวรัสไข้หวัดใหญ่อายุ 4 สัปดาห์ พวกเขาถูกสุ่มแบ่งกลุ่ม 5 กลุ่มหนึ่ง และแปดของสี่สุกร และในหน่วยแยกด้วย HEPA กรองอากาศ น้ำและอาหารได้ ad libitum2.2. ไวรัสไวรัส A/New นิ วเจอร์ซีย์/8/76 ได้รับจากการที่ไข้หวัดใหญ่ มิวนิคเซนเตอร์ เยอรมนี Sw/เบลเยียม/1/83 และไวรัส Sw/เบลเยียม/1/98 ได้รับจากการแพร่ระบาดของไข้หวัดใหญ่ของสุกรในฟาร์มในเบลเยียมในปี 1983 และปี 1998 ตามลำดับ ไวรัสทั้งสองมีลักษณะเป็นเหมือนนก H1N1 สุกรไข้หวัดใหญ่ไวรัสในระหว่างทดสอบ haemagglutination ยับยั้ง (HI) ไวรัสทั้งหมดถูกเผยแพร่ และ titrated ในไข่ไก่อายุ 10 วัน embryonated ใช้วิธีการมาตรฐาน ใช้ สำหรับทดสอบ HI และ การเตรียมวัคซีนไวรัสได้ที่เส้นทาง 4 ไข่ ถูกไวรัสท้าทาย Sw/เบลเยียม/1/98 ที่กาลไข่ 32.3 การรู้ค่าวัคซีนไวรัสทั้ง monovalent ประกอบด้วย A/New นิ วเจอร์ซีย์/8/76, Sw/เบลเยียม/1/83 หรือ Sw/เบลเยียม/1/98 ถูกเตรียมจากไข่ allantoic fluid และยกเลิก ด้วยβ-propiolactone รู้มีโดย NV Intervet (Boxmeer ประเทศเนเธอร์แลนด์) และผสมใน buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS) ให้หน่วยฮา 320 (HAU) ต่อ 0.8 ml ยาวัคซีนแต่ละอยู่ตรวจหา 0.8 ml และประเมิน 1.2 ml ประกอบด้วยเป็นอิมัลชันน้ำในน้ำมันและวิตามินอี (Microsol Diluvac Forte ® Intervet NV)วัคซีนพาณิชย์เป็นผลิตภัณฑ์แยกไวรัส bivalent ประกอบด้วย A/New นิ วเจอร์ซีย์/8/76 (H1N1) และ A/Port Chalmers/1/73 (H3N2) ในการประเมินน้ำมันในน้ำ (Gripovac ® Merial SA ลียง ฝรั่งเศส) ผู้ผลิตใช้วิธีสภาวะเพื่อกำหนดเนื้อหา antigenic น้อยที่สุด ยาวัคซีนแต่ละประกอบด้วยน้อย 1.7 HI หน่วย (ฮิว) ของสายพันธุ์ A/New นิ วเจอร์ซีย์/8/76 ฮิวหนึ่งถูกกำหนดเป็นปริมาณที่ต้องการรับมี titre แอนติบอดี HI ของ 1 log10 หลังสองวัคซีนสุกร2.4 การโปรโตคอลฉีดวัคซีนและความท้าทายกลุ่มสองสี่ และแปดสุกรได้ไม่ฉีด และทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม uninoculated และท้าทายกลุ่มควบคุม ตามลำดับ กลุ่ม 8 สุกรที่ฉีดกับค่าวัคซีนทดลองสามประกอบด้วย A/New นิ วเจอร์ซีย์/8/76 หรือ Sw/เบลเยียม/1/83 หรือ Sw/เบลเยียม/1/98 กลุ่มอื่นของสุกรแปดถูกฉีด ด้วยวัคซีนพาณิชย์ สุกรที่ได้รับวัคซีนครั้งแรกอายุ 4 สัปดาห์และวัคซีน booster ใน 8 สัปดาห์ รู้ถูกจัดการในปริมาณ 2 มล. โดยฉีดบาดทะยักจากลึกเข้าไปในคอTwo weeks after the second vaccination, all except the 4 uninoculated control pigs were challenged intratracheally with 7.5 log10 EID50 of the Sw/Belgium/1/98 isolate in 8 ml PBS. The pigs were held in vertical position with their neck extended. A needle was inserted right through the skin cranial to the sternum and the inoculum was injected. Rectal temperatures and signs of respiratory disease were recorded daily from 3 days before challenge until euthanasia. Body temperatures ≥40 °C were considered as fever. The four uninoculated control pigs were euthanatized 24 h after the challenge. In the other groups, four out of eight pigs were euthanatized at 24 h and the remaining four at 72 h.2.5. SerologyBlood samples of all pigs were collected at the time of the first and second vaccinations and immediately before challenge. The sera were adsorbed onto chicken erythrocytes to remove non-specific inhibitors of haemagglutination. Sera were examined in HI tests against the A/New Jersey/8/76, Sw/Belgium/1/83 and Sw/Belgium/1/98 viruses. HI tests were performed according to standard procedures [21].2.6. Virus titrations of lung tissueSamples from the upper part of the diaphragmatic lobe of the left lung were used for titrations in 10-day-old embryonated chicken eggs, according to standard procedures [21]. The eggs were inoculated with 0.2 ml of 10-fold dilutions of 20% lung tissue suspensions (four eggs per dilution) by the allantoic route. After 72 h incubation at 37 °C, the allantoic fluid was tested for haemagglutinating activity, using 0.5% chicken erythrocyte suspensions.2.7. Lung inflammatory parametersThe right lung of pigs euthanatized at 24 h after the challenge was lavaged with 200 ml of phosphate-buffered saline. Bronchoalveolar lavage (BAL) cells were separated by centrifugation at 400×g, and cytospin preparations were stained with DiffQuik (Baxter, Düdingen, Switzerland) to determine the percentage of neutrophils.Cell-free BAL fluids were concentrated 10 times by dialysis against 20% polyethylene glycol (molecular weight 20 000), cleared of residual virus by ultracentrifugation at 100 000×g and stored at −70 °C until use in cytokine bioassays [22]. Interferon-α (IFN-α) activity was determined in a cytopathic effect reduction assay by use of MDBK cells and vesicular stomatitis virus. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) was assayed as cytotoxic activity in PK (15) subclone 15 cells in the presence of actinomycin D. Interleukin-1 (IL-1) was measured as proliferative activity in D10 (N4) M cells in the presence of concanavalin A and recombinant human IL-2. Percentage of proliferation was determined by the thiazolyl blue (MTT) conversion procedure. Rabbit antisera against recombinant porcine IFN-α (gift from C. La Bonnardière, Jouy en Josas, INRA, France) and against recombinant human TNF-α (Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium) and monoclonal rat anti-mouse IL-1 receptor type 1 antibodies (BD Pharmingen, Heidelberg, Germany) were used to demonstrate specificity of the bioassay results. Laboratory standards were run in each bioassay and used for correction of titres of samples. Samples were tested in three (IFN-α, TNF-α) or two (IL-1; duplicates of samples) independent bioassays, and geometric mean titres of the corrected values were calculated.2.8. Statistical analysisLog-transformed results (HI antibody titres, virus titres) were subjected to analysis of variance and comparisons between unvaccinated control pigs and the different vaccine groups were analyzed by Student's t-test. Rectal temperatures were analyzed as untransformed data. Spearman rank correlation tests were used to compare geometric mean cytokine responses per animal and virus titres. Samples which tested negative for virus were given a numeric value of 1.0 log10 EID50 per g lung (detection limit 1.1 log10). Samples which tested negative for cytokines were given a value of 10 U (IFN-α, detection limit 20 U) or 20 U/ml BAL fluid (TNF-α and IL-1, detection limit 40 U).3. Results3.1. Serological response to vaccinationAll pigs were negative for influenza virus antibodies at the start of the experiment, and the 12 unvaccinated pigs were seronegative at all times examined.After one vaccination, all pigs had antibodies against the homologous H1N1 strain in the vaccine, but heterologous antibody titres were either considerably lower or undetectable. The geometric mean HI antibody titre against Sw/Belgium/1/98 was only 4 in the New Jersey/76 and Sw/Belgium/83 groups, 29 in the Sw/Belgium/98 group, and 17 in the commercial vaccine group.Two weeks after the second vaccination, at the time of challenge, all pigs had developed cross-reactive HI antibodies. Mean HI titres in the four vaccinated groups are shown in Fig. 1. The three experimental vaccines induced comparable antibody titres against the homologous virus, with mean HI titres of 305 in the New Jersey/76 group, 235 in the Sw/Belgium/83 group and 197 in the Sw/Belgium/98 group. The antibody response against the homologous virus was considerably higher than that against the Sw/Belgium/1/98 challenge virus in both the New Jersey/76 and Sw/Belgium/83 groups. However, the ratio homologous:challenge virus antibody titre was 19:1 in the New Jersey/76 group, but only 2.6:1 in the Sw/Belgium/83 group. Antibody levels to the challenge virus were significantly lower in the New Jersey/76 group (mean HI titre 16) than in the Sw/Belgium/83 (mean HI titre 91) or Sw/Belgium/98 (mean HI titre 197) groups (P<0.05).Mean geometric HI antibody titres to homologous and heterologous influenza ...Fig. 1. Mean geometric HI antibody titres to homologo

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บทคัดย่อการศึกษาครั้งนี้ไม่ว่าจะสำรวจวิวัฒนาการแอนติเจนภายใน H1N1 ไวรัสไข้หวัดหมูสามารถประนีประนอมประสิทธิภาพวัคซีนและโดยเฉพาะไม่ว่าจะเป็น A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76 ความเครียดในการฉีดวัคซีนไข้หวัดหมูในเชิงพาณิชย์ต้องมีการปรับปรุง สุกรที่ได้รับการฉีดวัคซีนครั้งที่สองเข้ากล้ามเนื้อด้วยการฉีดวัคซีน monovalent การทดลองที่ได้มาจากสายพันธุ์ H1N1 ที่แตกต่างกัน (A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76, Sw / เบลเยี่ยม / 1/83 หรือ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98) หรือวัคซีน bivalent เชิงพาณิชย์บนพื้นฐานของ A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76 (H1N1) และ / พอร์ตบิล / 1/73 (H3N2) วัคซีนทดลองและเชิงพาณิชย์ประกอบด้วยเสริมที่แตกต่างกัน สองสัปดาห์หลังจากการฉีดวัคซีนที่สองหมูทั้งหมดถูกท้าทาย intratracheally กับ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 หมายถึงการยับยั้ง haemagglutination ก่อนท้าทาย (ฮาวาย) แอนติบอดีไตเตอร์กับไวรัสท้าทายต่ำสำหรับการทดลอง A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76 วัคซีนกว่าวัคซีนอื่น ๆ การลดลงในไตเตอร์ไวรัสเฉลี่ยในปอดเป็นไปได้มากที่สำคัญสำหรับการฉีดวัคซีนหลังรวมทั้งการฉีดวัคซีนในเชิงพาณิชย์นิวเจอร์ซีย์มา แต่ไม่ได้สำหรับการทดลอง A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76 วัคซีน อาการทางคลินิกหลังจากที่มีความท้าทายสำคัญในการฉีดวัคซีนให้ทั้งหมด ระดับท้าทายโพสต์ของ interferon-αและเนื้องอกเนื้อร้ายปัจจัยαในของเหลวล้างหลอดลมลดลงในการฉีดวัคซีนในขณะที่ระดับของ interleukin-1 และนิวโทรฟิมีความสอดคล้องน้อย แม้ว่า A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76 สายพันธุ์ที่มีประสิทธิภาพน้อยลงในการป้องกันการติดเชื้อโดย Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 กว่าไวรัสคล้ายคลึงกันหรือกว่า Sw / เบลเยี่ยม / 1/83, ทุกสายพันธุ์สามารถป้องกันอย่างสมบูรณ์หากไตเตอร์แอนติบอดีกับความท้าทาย ไวรัสที่สูงพอสมควร นอกเหนือจากสายพันธุ์วัคซีนเสริมและยาแอนติเจนอาจมีบทบาทสำคัญในการรับรู้ความสามารถของวัคซีน. คำเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่สายพันธุ์ H1N1 สุกร; วัคซีน; วิวัฒนาการแอนติเจน; คุ้มครอง; Cytokines สุกรทั้งหมด 44 หมูที่ซื้อมาจากฟาร์มไวรัสไข้หวัดใหญ่น้ำเหลืองที่อายุ 4 สัปดาห์ที่ผ่านมา พวกเขาถูกแบ่งโดยการสุ่มออกเป็นห้ากลุ่มแปดและเป็นหนึ่งในกลุ่มสี่หมูและตั้งอยู่ในหน่วยแยกกับอากาศ HEPA กรอง น้ำและอาหารมีให้โฆษณา libitum. 2.2 ไวรัสA / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76 ไวรัสได้รับจากองค์การอนามัยไข้หวัดใหญ่ศูนย์ Munchen เยอรมนี Sw / เบลเยี่ยม / 1/83 และ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 ไวรัสที่ได้รับจากการระบาดของไข้หวัดหมูในฟาร์มในเบลเยียมในช่วงปี 1983 และปี 1998 ตามลำดับ ไวรัสทั้งสองมีลักษณะเป็นนกเหมือน H1N1 ไวรัสไข้หวัดหมูในการยับยั้ง haemagglutination ข้าม (ฮาวาย) การทดสอบ ไวรัสทั้งหมดได้รับการแพร่กระจายและการปรับขนาดใน 10 วันเก่าไข่ไก่ embryonated โดยใช้วิธีการมาตรฐาน ไวรัสที่ใช้สำหรับการทดสอบ HI และสำหรับการเตรียมวัคซีนอยู่ที่ทางเดินไข่ 4 ที่ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 ไวรัสความท้าทายอยู่ที่ทางเดินไข่ 3. 2.3 วัคซีนmonovalent วัคซีนทั้งไวรัสที่มี A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76, Sw / เบลเยี่ยม / 1/83 หรือ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 ที่เตรียมจากไข่ allantoic ของเหลวและการใช้งานที่มีβ-propiolactone วัคซีนที่ถูกจัดทำขึ้นโดย Intervet เนวาดา (Boxmeer, เนเธอร์แลนด์) และเจือจางในน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) เพื่อให้หน่วย HA 320 (HAU) ละ 0.8 มล. ปริมาณวัคซีนแต่ละคนที่มีอยู่ 0.8 มล. แอนติเจนและ 1.2 มล. เสริมประกอบด้วยอิมัลชันน้ำมันในน้ำรวมทั้งวิตามินอี (Microsol Diluvac Forte®, Intervet เนวาดา). วัคซีนในเชิงพาณิชย์เป็นผลิตภัณฑ์ที่แยกเชื้อไวรัสที่มี bivalent A / นิวเจอร์ซีย์ / 8 / 76 (H1N1) และ / พอร์ตบิล / 1/73 (H3N2) ในแบบเสริมน้ำมันในน้ำ (Gripovac®, Merial SA, ลียง, ฝรั่งเศส) ผู้ผลิตใช้วิธีการทางภูมิคุ้มกันในการกำหนดเนื้อหาแอนติเจนน้อยที่สุด ปริมาณวัคซีนแต่ละคนมีอย่างน้อย 1.7 หน่วยฮาวาย (Hiu) ของ A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76 ความเครียด หนึ่ง Hiu ถูกกำหนดให้เป็นปริมาณที่จำเป็นในการได้รับการ titre แอนติบอดี HI 1 log10 หลังจากที่สองการฉีดวัคซีนของสุกร. 2.4 การฉีดวัคซีนและโปรโตคอลท้าทายสองกลุ่มสี่แปดสุกรที่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีนและทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม uninoculated และกลุ่มควบคุมความท้าทายตามลำดับ สามกลุ่มแปดหมูถูกฉีดวัคซีนกับหนึ่งในสามของการทดลองวัคซีนที่มีทั้ง A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76 หรือ Sw / เบลเยี่ยม / 1/83 หรือ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 กลุ่มแปดหมูอีกด้วยการฉีดวัคซีนวัคซีนในเชิงพาณิชย์ สุกรที่ได้รับการฉีดวัคซีนครั้งแรกที่อายุ 4 สัปดาห์และฉีดวัคซีนกระตุ้นที่ 8 สัปดาห์ วัคซีนที่ได้รับยาใน 2 มิลลิลิตรปริมาณโดยการฉีดเข้ากล้ามลึกลงไปในลำคอ. สองสัปดาห์หลังจากการฉีดวัคซีนที่สองทั้งหมดยกเว้น 4 หมูควบคุม uninoculated ถูกท้าทาย intratracheally 7.5 log10 EID50 ของ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 แยก 8 มล. พีบีเอส สุกรถูกจัดขึ้นในตำแหน่งแนวตั้งที่มีคอของพวกเขาขยาย เข็มถูกแทรกขวาผ่านกะโหลกผิวเพื่อกระดูกและหัวเชื้อที่ถูกฉีด อุณหภูมิทางทวารหนักและสัญญาณของโรคทางเดินหายใจที่ถูกบันทึกไว้ทุกวันตั้งแต่ 3 วันก่อนที่จะท้าทายจนนาเซีย อุณหภูมิร่างกาย≥40° C ได้รับการพิจารณาเป็นไข้ สี่หมูควบคุม uninoculated ถูก euthanatized 24 ชั่วโมงหลังจากที่ท้าทาย ในกลุ่มอื่น ๆ ที่สี่แปดหมู euthanatized เวลา 24 ชั่วโมงและที่เหลืออีกสี่ที่ 72 ชม. 2.5 เซรุ่มวิทยาตัวอย่างเลือดของสุกรทั้งหมดถูกเก็บในขณะที่การฉีดวัคซีนครั้งแรกและครั้งที่สองและทันทีก่อนที่จะท้าทาย ซีรั่มที่ถูกดูดซับบนเม็ดเลือดแดงไก่ที่จะเอาสารยับยั้งไม่เฉพาะเจาะจงของ haemagglutination ซีรั่มมีการตรวจสอบในการทดสอบกับ HI A / นิวเจอร์ซีย์ / 8/76, Sw / เบลเยี่ยม / 1/83 และ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 ไวรัส การทดสอบ HI ได้ดำเนินการตามขั้นตอนมาตรฐาน [21]. 2.6 ไทเทรตไวรัสของเนื้อเยื่อปอดตัวอย่างจากส่วนบนของกลีบกระบังลมของปอดซ้ายถูกนำมาใช้สำหรับการไตเตรทใน 10 วันเก่าไข่ไก่ embryonated ตามขั้นตอนมาตรฐาน [21] ไข่ที่ได้รับเชื้อด้วย 0.2 มิลลิลิตรเจือจาง 10 เท่าจาก 20% แขวนลอยเนื้อเยื่อปอด (สี่ฟองต่อการลดสัดส่วน) โดยเส้นทาง allantoic หลังจากบ่ม 72 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, ของเหลว allantoic ได้รับการทดสอบว่าเป็นกิจกรรมที่ haemagglutinating ใช้ไก่ 0.5% แขวนลอยเม็ดเลือดแดง. 2.7 ปอดอักเสบพารามิเตอร์ปอดขวาของสุกร euthanatized เวลา 24 ชั่วโมงหลังจากได้รับการท้าทาย lavaged กับ 200 มิลลิลิตรเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ล้างหลอดลม (BAL) เซลล์ที่ถูกแยกจากกันโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 400 ×กรัมและการเตรียมการ cytospin ถูกย้อมด้วยสี DiffQuik (แบ็กซ์เตอร์ดูดิงเกนวิตเซอร์แลนด์) เพื่อตรวจสอบอัตราร้อยละของนิวโทรฟิ. ของเหลว BAL มือถือฟรีมีความเข้มข้น 10 ครั้งโดยการฟอกเลือดกับ 20% เอทิลีนไกลคอล (น้ำหนักโมเลกุล 20 000) ล้างของเชื้อไวรัสที่ตกค้างโดย ultracentrifugation ที่ 100 × 000 กรัมและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -70 องศาเซลเซียสจนถึงการใช้งานใน bioassays ไซโตไคน์ [22] interferon-α (IFN-α) กิจกรรมที่ถูกกำหนดในการทดสอบการลดผล cytopathic โดยการใช้เซลล์ MDBK และไวรัสปากตุ่ม เนื้องอกเนื้อร้ายปัจจัยα (TNF-α) ได้รับการวิเคราะห์เป็นกิจกรรมพิษใน PK (15) 15 subclone เซลล์ในการปรากฏตัวของ actinomycin ดี Interleukin-1 (IL-1) วัดเป็นกิจกรรมในการเจริญ D10 (N4) เซลล์ M ในการปรากฏตัวของ concanavalin และ recombinant มนุษย์ IL-2 ร้อยละของการแพร่กระจายได้รับการกำหนดโดย thiazolyl สีฟ้า (MTT) ขั้นตอนการแปลง antisera กระต่ายกับหมู recombinant IFN-α (ของขวัญจากซีลาBonnardière, Jouy en Josas, INRA ฝรั่งเศส) และต่อมนุษย์ recombinant TNF-α (INNOGENETICS, Zwijnaarde, เบลเยียม) และโมโนโคลนอลหนูต่อต้านเมาส์ IL-1 ประเภทรับ 1 แอนติบอดี (BD PharMingen ไฮเดลเบิร์ก, เยอรมนี) ถูกนำมาใช้เพื่อแสดงให้เห็นถึงความจำเพาะของผลการทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพ มาตรฐานห้องปฏิบัติการได้รับการทำงานในแต่ละชีวภาพและใช้สำหรับการแก้ไขของไตเตอร์ของกลุ่มตัวอย่าง ตัวอย่างการทดสอบในสาม (IFN-α, TNF-α) หรือสอง (IL-1; ซ้ำกันของกลุ่มตัวอย่าง). bioassays อิสระและไตเตอร์เฉลี่ยเรขาคณิตของค่าการแก้ไขจะถูกคำนวณ2.8 การวิเคราะห์ทางสถิติผลการเปลี่ยนเข้าสู่ระบบ (ฮาวายไตเตอร์แอนติบอดีไตเตอร์ไวรัส) ถูกยัดเยียดให้การวิเคราะห์ความแปรปรวนและการเปรียบเทียบระหว่างการควบคุมสุกรวัคซีนวัคซีนและกลุ่มที่แตกต่างกันนำมาวิเคราะห์โดยนักศึกษา t-test อุณหภูมิทางทวารหนักถูกนำมาวิเคราะห์เป็นข้อมูล untransformed สเปียร์แมนยศทดสอบความสัมพันธ์ที่ถูกใช้ในการเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยของการตอบสนองทางเรขาคณิตไซโตไคน์ต่อสัตว์และไตเตอร์ไวรัส ตัวอย่างที่ผ่านการทดสอบเชิงลบสำหรับไวรัสที่ได้รับค่าตัวเลข 1.0 log10 EID50 ต่อกรัมปอด (การตรวจสอบวงเงิน 1.1 log10) ตัวอย่างที่ผ่านการทดสอบเชิงลบสำหรับ cytokines ได้รับค่าของ 10 U (IFN-α จำกัด การตรวจสอบ 20 U) หรือ 20 U / ml ของเหลว BAL (TNF-αและ IL-1, การตรวจสอบวงเงิน 40 U). 3 ผล3.1 การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่จะฉีดวัคซีนสุกรทั้งหมดถูกลบสำหรับภูมิคุ้มกันเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ในช่วงเริ่มต้นของการทดลองและ 12 หมูวัคซีนเป็นน้ำเหลืองตลอดเวลาการตรวจสอบ. หลังจากฉีดวัคซีนสุกรทั้งหมดมีแอนติบอดีต่อสายพันธุ์เดียวกัน H1N1 ในวัคซีน แต่ heterologous แอนติบอดีไตเตอร์ทั้งต่ำหรือตรวจสอบไม่พบ เรขาคณิตเฉลี่ย titre แอนติบอดี HI กับ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 เป็นเพียง 4 ในรัฐนิวเจอร์ซีย์ / 76 และ Sw / เบลเยี่ยม / 83 กลุ่ม 29 ใน Sw / เบลเยี่ยม / 98 กลุ่มและ 17 ในกลุ่มวัคซีนเชิงพาณิชย์. สอง สัปดาห์หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งที่สองในเวลาของความท้าทายสุกรทั้งหมดมีการพัฒนาแอนติบอดี HI ข้ามปฏิกิริยา ไตเตอร์ HI เฉลี่ยในสี่กลุ่มการฉีดวัคซีนจะแสดงในรูป 1. สามวัคซีนทดลองเหนี่ยวนำแอนติบอดีไตเตอร์เปรียบได้กับไวรัสคล้ายคลึงกับไตเตอร์ HI เฉลี่ยของ 305 ในรัฐนิวเจอร์ซีย์ / 76 กลุ่ม 235 ใน Sw / เบลเยี่ยม / 83 กลุ่มและ 197 ใน Sw / เบลเยี่ยม / 98 กลุ่ม การตอบสนองของแอนติบอดีต่อต้านไวรัสคล้ายคลึงกันเป็นอย่างมากสูงกว่ากับ Sw / เบลเยี่ยม / 1/98 ไวรัสความท้าทายทั้งในรัฐนิวเจอร์ซีย์ / 76 และ Sw / เบลเยี่ยม / 83 กลุ่ม อย่างไรก็ตามอัตราส่วนเดียวกัน: ความท้าทายไวรัส titre แอนติบอดีเป็น 19: 1 ในรัฐนิวเจอร์ซีย์ / 76 กลุ่ม แต่เพียง 2.6: 1 ใน Sw / เบลเยี่ยม / 83 กลุ่ม ระดับแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสที่ท้าทายอย่างมีนัยสำคัญลดลงในรัฐนิวเจอร์ซีย์ / 76 กลุ่ม (ค่าเฉลี่ย HI titre 16) กว่าใน Sw / เบลเยี่ยม / 83 (ค่าเฉลี่ย HI titre 91) หรือ Sw / เบลเยี่ยม / 98 (ค่าเฉลี่ย HI titre 197) กลุ่ม ( P <0.05). หมายถึงแอนติบอดีไตเตอร์เรขาคณิต HI ไข้หวัดใหญ่คล้ายคลึงกันและ heterologous ... รูป 1. ไตเตอร์แอนติบอดีเฉลี่ยเรขาคณิต HI เพื่อ homologo

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

นามธรรม

ครั้งนี้ศึกษาถึงวิวัฒนาการของแอนติเจนในวัคซีนในสุกรไข้หวัดใหญ่ไวรัสสามารถประนีประนอมประสิทธิภาพของวัคซีน และโดยเฉพาะ ไม่ว่าจะเป็น / New Jersey / 8 / 76 สายพันธุ์ในสุกรไข้หวัดใหญ่วัคซีนเชิงพาณิชย์ต้องมีการปรับปรุง สุกรวัคซีน 2 ครั้งทางกับกัดมาจากสายพันธุ์ H1N1 วัคซีนทดลองแตกต่างกัน ( / New Jersey / 8 / 76SW / เบลเยียม / 1 / 83 หรือ SW / เบลเยียม / 1 / 98 ) หรือโฆษณาไบแวเลนท์วัคซีนตาม / New Jersey / 8 / 76 ( H1N1 ) และพอร์ต / บิล / 1 / 73 ( h3n2 ) วัคซีนทดลองและเชิงพาณิชย์มีเสริมที่แตกต่างกัน สองสัปดาห์หลังจากฉีดวัคซีนสองหมูถูกท้าทาย intratracheally กับ SW / เบลเยียม / 1 / 98หมายถึงการยับยั้งก่อนท้าทาย haemagglutination ( HI ) แอนติบอดีต่อไวรัส titres ท้าทายลดลงสำหรับทดลอง / New Jersey / 8 / 76 วัคซีนกว่าวัคซีนอื่น ๆ ลด titres หมายถึงไวรัสในปอดสูงที่สำคัญสำหรับวัคซีนหลังรวมทั้งในเชิงพาณิชย์นิวเจอร์ซีย์ได้รับวัคซีน แต่ไม่ใช่สำหรับทดลอง / New Jersey / 8 / 76 ครั้งคลินิกป้ายหลังจากที่ท้าทายเป็นผู้ vaccinates ทั้งหมด . โพสต์ความท้าทายระดับอินเตอร์เฟียรอน - αเนื้องอกเนื้อร้ายปัจจัย - และเสริมการαในของเหลวลดลง ใน vaccinates ในขณะที่ระดับของ interleukin-1 และนิวโทรฟิลสอดคล้องน้อยลงแม้ว่า / New Jersey / 8 / 76 ความเครียดมีประสิทธิภาพน้อยกว่าในการป้องกันการติดเชื้อโดย SW / เบลเยียม / 1 / 98 กว่าโฮโมโลกัส ไวรัส หรือกว่า SW / เบลเยียม / 1 / 83 , ทุกสายพันธุ์สามารถปกป้องอย่างสมบูรณ์ถ้าแอนติบอดีต่อไวรัส titres ท้าทายสูงพอสมควร นอกเหนือจากวัคซีนสายพันธุ์ เสริมการศึกษาปริมาณและอาจมีบทบาทสำคัญในประสิทธิภาพของวัคซีน







คำสำคัญ
.H1N1 สุกรไข้หวัดใหญ่ไวรัส ( ;
;

การวิวัฒนาการของแอนติเจน ; การศึกษา ;

สุกร

รวม 44 หมูซื้อจากไวรัสไข้หวัดใหญ่ seronegative ฟาร์มที่อายุ 4 สัปดาห์ แบ่งโดยการสุ่มออกเป็น 5 กลุ่มกลุ่มหนึ่งสี่แปด และหมู อยู่ในหน่วยแยกกับ HEPA กรองอากาศ น้ำและอาหารได้อย่างเต็มที่ .

. . ไวรัส

A / New Jersey / 8 / 76 ไวรัสไข้หวัดใหญ่ที่ได้รับจากที่ศูนย์เมืองมิวนิก , เยอรมนี SW / เบลเยียม / 1 / 83 และ SW / เบลเยียม / 1 / 98 ไวรัสได้จากการแพร่ระบาดของโรคไข้หวัดสุกรในฟาร์มในเบลเยี่ยมระหว่างปี พ.ศ. 2526 และปีตามลำดับ ทั้ง ไวรัส มีลักษณะเป็นเหมือนนก H1N1 สุกรไวรัสไข้หวัดใหญ่ใน haemagglutination inhibition ( HI ) ข้ามการทดสอบทั้งหมดไวรัสแพร่กระจายในวงจรชีวิตตลอดเวลา 10 วันและอายุไข่ โดยใช้วิธีมาตรฐาน ไวรัสที่ใช้สำหรับการทดสอบสวัสดี และเตรียมวัคซีนที่ผ่านไข่ 4 SW / เบลเยียม / 1 / 98 ไวรัสความท้าทายที่ 3 ไข่เดิน

2.3 วัคซีน

กัดทั้งไวรัสวัคซีนที่มี / New Jersey / 8 / 76SW / เบลเยียม / 1 / 83 หรือ SW / เบลเยียม / 1 / 98 พร้อมไข่ allantoic ของไหลและอนุภาคกับบีตา - โปรพิโอแลคโตน . วัคซีนที่เตรียมจาก intervet NV ( boxmeer , เนเธอร์แลนด์ ) และเจือจางในฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ ( PBS ) ให้ 320 หน่วย ฮา ( ว ) ต่อ 0.8 มิลลิลิตร แต่ละขนาด 0.8 ml บรรจุวัคซีนแอนติเจนและ 12 ml เสริมประกอบด้วยน้ำมันน้ำอิมัลชัน พลัสวิตามินอี ( microsol diluvac ฟอร์เต้® intervet , NV )

วัคซีนเชิงพาณิชย์เป็นไบแวเลนท์แยกไวรัสผลิตภัณฑ์ที่มี / New Jersey / 8 / 76 ( H1N1 ) และพอร์ต / บิล / 1 / 73 ( h3n2 ) ในการเสริมน้ำมันในน้ำ ( gripovac ®ต่างๆ , SA , ลียง , ฝรั่งเศส ) ผู้ผลิตใช้วิธีระบบเพื่อตรวจสอบเนื้อหาของแอนติเจนที่น้อยที่สุดวัคซีนแต่ละขนาดมีอย่างน้อย 1.7 หน่วยครับ ( หิว ) ของ A / New Jersey / 8 / 76 ชนิด หนึ่งหิว หมายถึง ปริมาณความต้องการขอรับสวัสดีแอนติบอดี titre 1 LN 2 หลังการฉีดวัคซีนของสุกร

2.4 . วัคซีนและท้าทายโปรโตคอล

สองกลุ่มสี่และแปดหมูไม่ได้ฉีดวัคซีนและทำหน้าที่เป็นการท้าทายกลุ่มควบคุมและกลุ่มควบคุมตามลำดับกลุ่มแปดสุกรวัคซีนกับหนึ่งในสามของการทดลองวัคซีนที่มีทั้ง / New Jersey / 8 / 76 หรือ SW / เบลเยียม / 1 / 83 หรือ SW / เบลเยียม / 1 / 98 กลุ่มแปดสุกรวัคซีนกับวัคซีนเพื่อการค้า สุกรที่ได้รับการฉีดวัคซีนครั้งแรกเมื่ออายุ 4 สัปดาห์และ booster วัคซีนใน 8 สัปดาห์วัคซีนถูกทดสอบใน 2 ml หลอด โดยฉีดลึกเข้าไปในคอ

สองสัปดาห์หลังจากฉีดวัคซีนสอง ยกเว้นการควบคุม 4 ใส่หมูถูกท้าทาย intratracheally กับ 7.5 LN eid50 ของ SW / เบลเยียม / 1 / 98 แยก 8 ช่องเซลล์ หมูถูกจัดขึ้นในแนวตั้งด้วยคอแบบขยายเข็มแทรกผ่านผิวหนังศีรษะกับกระดูกอก และปริมาณที่ถูกฉีดเข้าไป อุณหภูมิทวารหนักและอาการของโรคทางเดินหายใจที่ถูกบันทึกไว้ทุกวันตั้งแต่ 3 วันก่อน ท้าทาย จนถึงขนาดที่ . ร่างกายที่อุณหภูมิ 40 องศา C ≥ถูกถือว่าเป็นไข้ 4 การควบคุมสุกร euthanatized 24 ชั่วโมงหลังจากการท้าทาย ในกลุ่มอื่น ๆสี่ในแปดสุกร euthanatized ใน 24 ชั่วโมง ส่วนที่เหลืออีก 4 ที่ 72 H .

2.5 เดีย

ตัวอย่างเลือดของสุกร เก็บเวลาของตัวแรกและตัวที่สอง การฉีดวัคซีนและทันทีก่อนที่จะท้าทาย ( ถูกดูดซับบนเม็ดเลือดแดงไก่ เอาเฉพาะสารยับยั้ง haemagglutination . วิธีทดสอบในการทดสอบกับสวัสดี / New Jersey / 8 / 76SW / เบลเยียม / 1 / 83 และ SW / เบลเยียม / 1 / 98 ไวรัส สวัสดีครับ มีการปฏิบัติตามมาตรฐานการทดสอบขั้นตอน [ 21 ] .

2.6 ของไวรัส titrations เนื้อเยื่อปอด

ตัวอย่างจากส่วนบนของกลีบของปอดด้านซ้ายใต้กระบังลมถูกใช้เพื่อ titrations ใน 10 วัน เก่า วงจรชีวิต ไข่ ตามขั้นตอนมาตรฐาน [ 21 ] ไข่ใส่ 02 มล. 10 เท่าวิธีการ 20% เนื้อเยื่อปอดสารแขวนลอย ( 4 ฟองต่อเจือจาง ) โดยเส้นทาง allantoic . หลังจาก 72 ชั่วโมงบ่มที่ 37 ° C , ของเหลว allantoic การทดสอบ haemagglutinating กิจกรรมโดยใช้ 0.5% ไก่เม็ดเลือดแดงสารแขวนลอย

2.7 . ปอดอักเสบค่า

ปอดขวาของสุกร euthanatized เวลา 24 ชั่วโมงหลังจากที่ท้าทายคือ lavaged 200 มิลลิลิตร ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือเสริมการ ( บาล ) เซลล์ที่แยกได้จาก 3 × 400 กรัม และการเตรียม cytospin ถูกย้อมด้วยสี diffquik ( แบ็กซ์เตอร์ , D ü dingen , สวิตเซอร์แลนด์ ) เพื่อหาค่าร้อยละของนิวโทรฟิล .



มือถือฟรี บัล ของเหลวมีความเข้มข้น 10 ครั้ง โดยฟอกไตกับ 20% polyethylene glycol ( น้ำหนักโมเลกุล 20   000 ) ,ล้างไวรัสตกค้าง โดย ultracentrifugation ที่ 100   000 ×กรัม และ 70 องศา C อุณหภูมิ−ไปจนถึงใช้ในไซโตไคน์ละเอียด [ 22 ] รอน - α ( IFN - α ) กิจกรรมที่กำหนดใน cytopathic ผลการทดสอบโดยการใช้เซลล์ mdbk ี่ซึ่งเป็นตุ่มพอง stomatitis และไวรัส เนื้องอกเนื้อร้ายปัจจัย - α ( TNF - α ) ซีรั่มเป็นพิษต่อเซลล์มะเร็งใน PK ( 15 ) subclone 15 เซลล์ในตนของถ.พ. Dinterleukin-1 ( 1 ) วัดเป็นกิจกรรม proliferative ใน D10 ( N4 ) เซลล์ในตนของถูกและ recombinant มนุษย์ 2 . เปอร์เซ็นต์การงอกถูกกำหนดโดย thiazolyl สีฟ้า ( MTT ) ขั้นตอนการแปลง กระต่ายกับยีนแอนติเอชไอวี - เลือดหมูα ( ของขวัญจาก ลา bonnardi è re jouy ทีมนักวิจัยของ josas , en , ฝรั่งเศส ) และต่อ TNF - มนุษย์α ( อินโนเจเนติกคอม ,