Pathogen isolation and elicitor pre

Pathogen isolation and elicitor preparation. Root rot
and leaf blight causing pathogen M. phaseolina was
isolated from infected greengram roots (cv. Co5 ) and
allowed to grow on Richard's solution for one week at
room temperature. Mycelial mats were collected and
cell wall was isolated according to a published prodedure
(Anderson-Prouty and Albersheim 1975). 1 g of
cell walls was suspended in 100 ml distilled water and
autoclaved at 121°C for 20 min. The filtrate was centrifuged
and concentrated to 10% of its original volume in
a rotavapor (Büchi, Switzerland) followed by freeze
drying.
Callus culture and suspension-cultured cells.
Greengram seeds were surface sterilized in 70% ethanol
and allowed for 3 days to grow in a 250 ml
Erlenmeyer conical flask containing sucrose-Na2Fe
EDTA agar medium (1% sucrose, 27.8 mg 1–1 FeSO4
· 7H2O, 37.3 mg 1–1 Na2 EDTA and 0.6% agar). After
4 days of incubation primordial leaves were collected
and leaf bits from primordial leaves were aseptically
transferred to test tubes containing MS medium
(Murashige and Skoog 1962) supplemented with
3.0 mg 1–1 NAA and 0.5 mg 1–1 BAP. Leaf bits were
incubated at 20 ± 2°C and allowed for callus formation
under continuous light for 3 weeks.
After callus formation approximately 0.5 g of cell
clusters were transferred with sterile forceps into
250 ml Erlenmeyer conical flasks containing 50 ml of
PC-L2 broth (Phillips and Collins 1979) supplemented
with 3.0 mg l–1 BAP and 0.2 mg l–1 NAA. Subculture of
suspension-cultured cells was repeated 3–4 times.
After one week of incubation of 3–4 cycle of subculture,
suspension-cultured cells in the conical flasks
were treated with 1 ml of the elicitor at a concentration
of 10 μg ml–1. For control treatment 1 ml of sterile
distilled water was mock-inoculated. Samples were
collected at periodic intervals for enzyme extraction.
Greengram seeds were allowed to grow for one
month in earthen pots. Trifoliate leaves along with
petioles were collected and surface sterilized by immersing
in a beaker containing 10% sodium hypochlorite
solution for 3 min followed by five rinses in sterile
distilled water. After sterilization leaves were transferred
to sterile Petri dishes containing moistened cotton.
Three-day-old 10 mm mycelial discs of M. phaseolina
grown on potato dextrose agar medium were
placed over trifoliate leaves (1 disc/leaf). Enzyme was
extracted at periodic intervals from both inoculated and
mock-inoculated (with agar disc) leaves.
Greengram leaf tissues or suspension-cultured cells
were homogenized in 0.01 M sodium phosphate buffer,
pH 6.0. We used 2 ml buffer/g fresh weight. The homogenates
were filtered through four layers of muslin
cloth, and the filtrates were centrifuged at 6000 rpm at
4°C for 20 min. The supernatant served as enzyme
source.
Peroxidase activity was determined according to
Langcake and Wickins (1975) and Srivastava (1987).
1.5 ml of 0.05 M pyrogallol and 100 μl of enzyme
extract were filled into spectrophotometer sample
cuvettes. Reference cuvettes contained 100 μl inactivated
(by boiling) enzyme extract and 1.5 ml of 0.05 M
pyrogallol. To initiate the reaction 100 μl of 1 per cent
hydrogen peroxide (v/v) was added to the sample cuvette,
and the changes in absorbance were recorded at
30 s intervals. The peroxidase activity was expressed as
change in absorbance at 420 nm.
Native PAGE. Peroxidase isozymes were analyzed by a
published procedure (Pan et al. 1991). For native anionic
PAGE, polyacrylamide resolving gels (8%, 1.5 mm
thick) were prepared by mixing 5.3 ml of 30% acrylamide
(acrylamide/bis acrylamide; 30 : 0.8), 5.0 ml
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 ml of 10% ammonium
persulfate (freshly prepared), 9.3 ml of distilled water,
and 10 μl TEMED. The stacking gel contained 1.3 ml
30% acrylamide, 2.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), 50 μl
10% ammonium persulfate (freshly prepared) and
6.1 ml distilled water. After degassing for 10 min, 10 μl
TEMED were added, and the gel was poured between
glass plates. The non-denaturing gels were run for 8 h
at 10°C, 30 mA in a Hoefer vertical electrophoresis
unit. Gels were stained for peroxidase in 0.02 M acetate
buffer at pH 4.5 containing 0.05% benzidine and
0.03% H2O2. After staining, the gels were immersed in
7% acetic acid for 3 min and then washed with distilled
water (Nadolny and Sequeira 1980).
Peroxidase purification. Peroxidase isozymes were
purified by fractionating the crude enzyme extract over
a Sephadex G-25 column (1.5 cm × 30 cm) (Pharmacia
LKB, Sweden) using 0.01 M sodium phosphate buffer
(pH 6.0) as elution buffer. Five ml fractions were

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การศึกษาการแยกและ elicitor เตรียมการ Root rotและก่อให้เกิดการศึกษาม. phaseolina โรคใบแยกต่างหากจากรากติดไวรัส greengram (พันธุ์ Co5) และสามารถเจริญเติบโตของริชาร์ดโซลูชันสำหรับหนึ่งสัปดาห์ที่ที่อุณหภูมิห้อง Mycelial เสื่อถูกเก็บรวบรวม และผนังเซลล์ถูกแยกตามตอนเผยแพร่(Prouty แอนเดอร์สันและ Albersheim 1975) g 1 ของผนังเซลล์ถูกหยุดชั่วคราวในน้ำกลั่น 100 มล และautoclaved ที่ 121° C สำหรับ 20 นาที สารกรองมี centrifugedและเข้มข้นเป็น 10% ของปริมาณเดิมในตรึงเป็น rotavapor (บือ สวิตเซอร์แลนด์) ตามด้วยแห้งวัฒนธรรมของแคลลัสและเซลล์แขวนอ่างเมล็ด Greengram มีผิว sterilized ในเอทานอล 70%และสามารถใช้ได้ 3 วันจะเติบโตใน 250 mlErlenmeyer หนาวทรงกรวยที่ประกอบด้วยซูโครส Na2FeEDTA agar ปานกลาง (1% ซูโครส 27.8 มิลลิกรัม 1 – 1 FeSO4· 7H2O, 1 – 1 มิลลิกรัม 37.3 Na2 EDTA และ 0.6% agar) หลังจากวันที่ 4 ของคณะทันตแพทยศาสตร์ primordial ใบไม้ถูกเก็บรวบรวมและบิตใบจากใบ primordial asepticallyโอนย้ายการทดสอบท่อที่ประกอบด้วยขนาดกลาง MS(Murashige และ Skoog 1962) ที่เสริมด้วย3.0 มิลลิกรัม 1 – 1 NAA และ 0.5 มิลลิกรัม 1-1 BAP. ใบไม้บิตได้incubated ที่ 20 ± 2° C และได้ก่อให้ภายใต้แสงต่อเนื่อง 3 สัปดาห์หลังจากให้กำเนิดประมาณ 0.5 g ของเซลล์คลัสเตอร์มีการถ่ายโอน ด้วยคีมใส่ลงใน250 ml Erlenmeyer นำทรงกรวยประกอบด้วย 50 ml ของPC-L2 ซุป (ไขควงและคอลลินส์ 1979) เสริมมี 3.0 มิลลิกรัม BAP l – 1 และ 0.2 มิลลิกรัม NAA l-1 วัฒนธรรมของเซลล์ระงับอ่างถูกทำซ้ำ 3 – 4 ครั้งหลังจากหนึ่งสัปดาห์ของการฟักตัว 3 – 4 รอบของวัฒนธรรมเซลล์ระงับอ่างในน้ำทรงกรวยได้รับการรักษา ด้วย 1 ml ของ elicitor ที่เข้มข้นml μg 10-1 สำหรับการควบคุมบำบัด 1 มล.ผ่านการฆ่าเชื้อน้ำกลั่นมี mock inoculated ตัวอย่างดีรวบรวมในช่วงเวลาประจำงวดในการสกัดเอนไซม์เมล็ด Greengram ได้รับอนุญาตให้เติบโตอย่างใดอย่างหนึ่งเดือนในหม้อ ใบไม้ trifoliate พร้อมpetioles ได้รวบรวม และผิว sterilized โดยแช่ในบีกเกอร์ที่ประกอบด้วย 10% โซเดียมไฮโปโซลูชั่น 3 นาทีตาม ด้วย rinses 5 ในกอซน้ำกลั่น หลังจากที่มีการถ่ายโอนใบฆ่าเชื้อกับจาน Petri กอซประกอบด้วยฝ้าย moistenedดิสก์ mycelial สามวันอายุ 10 มม. phaseolina เมตรปลูกในมันฝรั่งขึ้น agar ปานกลางได้วางใบไม้ trifoliate (1 แผ่น/ใบ) เอนไซม์ได้สกัดในช่วงงวดจากทั้ง inoculated และinoculated mock (ด้วยแผ่นดิสก์ agar) ใบGreengram ใบเนื้อเยื่อหรือเซลล์ระงับอ่างมี homogenized เป็นกลุ่มใน 0.01 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์pH 6.0 เราใช้น้ำหนักสดของ บัฟเฟอร์/g 2 ml Homogenatesถูกกรองผ่านสี่เลเยอร์ของมัสลินผ้า และ filtrates มี centrifuged ที่ 6000 รอบต่อนาทีที่4° C สำหรับ 20 นาที Supernatant เป็นเอนไซม์แหล่งที่มากิจกรรม peroxidase กำหนดตามLangcake และ Wickins (1975) และ Srivastava (1987)1.5 ml pyrogallol 0.05 M และ μl 100 ของเอนไซม์สารสกัดเต็มไปเป็นตัวอย่างเครื่องทดสอบกรดด่างcuvettes อ้างอิง μl 100 cuvettes ที่อยู่ที่ยกเลิก(โดยการต้ม) สารสกัดจากเอนไซม์และ 1.5 ml 0.05 เมตรpyrogallol เริ่ม μl ปฏิกิริยา 100 ของร้อยละ 1ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (v/v) ถูกเพิ่ม cuvette อย่างและบันทึกการเปลี่ยนแปลง absorbance ที่ช่วงเวลา 30 s กิจกรรม peroxidase ถูกแสดงเป็นการเปลี่ยนแปลง absorbance ที่ 420 nmเจ้าหน้า Peroxidase isozymes ถูกวิเคราะห์โดยการเผยแพร่ขั้นตอน (Pan et al. 1991) สำหรับย้อมพื้นเมืองหน้า polyacrylamide gels (8%, 1.5 มม.แก้ไขหนา) ถูกเตรียมไว้ โดยผสม 5.3 ml ของอะคริลาไมด์ 30%(อะคริลาไมด์อะคริลา ไมด์/bis; 30:0.8), 5.0 ml1.5 M ตรี-HCl (pH 8.8), 0.1 ml ของแอมโมเนีย 10%(ซึ่งทำ), persulfate 9.3 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นและ 10 μl TEMED เจซ้อนอยู่ 1.3 mlอะคริลาไมด์ 30%, 2.5 ml 0.5 M ตรี-HCl (pH 6.8), 50 μl10% แอมโมเนีย persulfate (สดเตรียมไว้) และน้ำกลั่น ml ขนาด 6.1 หลังจากการ degassing สำหรับ 10 นาที 10 μlเพิ่ม TEMED และเจมี poured ระหว่างแผ่นแก้ว เจ denaturing ไม่ถูกเรียกใช้สำหรับ 8 hที่ 10° C, 30 mA ใน electrophoresis เป็นแนวตั้ง Hoeferหน่วยการ เจมีสีสำหรับ peroxidase ใน 0.02 M acetateบัฟเฟอร์ที่ pH 4.5 มี 0.05% benzidine และ0.03% H2O2 หลังจากย้อมสี เจถูกแช่อยู่ในกรดอะซิติก 7% ใน 3 นาที และจากนั้น ล้างด้วยกลั่นน้ำ (Nadolny และสต 1980)Peroxidase ฟอก มี peroxidase isozymesบริสุทธิ์ โดย fractionating สารสกัดเอนไซม์ดิบมากกว่าคอลัมน์ Sephadex G-25 (1.5 cm × 30 เซนติเมตร) (PharmaciaLKB สวีเดน) ใช้ 0.01 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์(pH 6.0) เป็น elution บัฟเฟอร์ ได้เศษ 5 ml

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแยกเชื้อและการเตรียมการกระตุ้น โรครากเน่าและโรคใบไหม้ที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อ M. phaseolina ถูกแยกได้จากรากgreengram ติดเชื้อ (พันธุ์. CO5) และได้รับอนุญาตให้เติบโตในการแก้ปัญหาของริชาร์ดเป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ที่อุณหภูมิห้อง เสื่อเส้นใยถูกเก็บรวบรวมและผนังเซลล์ที่แยกได้ตามการตีพิมพ์ prodedure (แอนเดอ-Prouty และ Albersheim 1975) 1 กรัมของผนังเซลล์ถูกระงับใน100 มล. น้ำกลั่นและเบาที่121 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที กรองถูกปั่นและเข้มข้นถึง 10% ของปริมาณเดิมใน Rotavapor (Büchiวิตเซอร์แลนด์) ตามด้วยการแช่แข็งอบแห้ง. วัฒนธรรมแคลลัสและเซลล์ระงับเลี้ยง. เมล็ด greengram ถูกพื้นผิวที่ผ่านการฆ่าเชื้อในเอทานอล 70% และได้รับอนุญาตเป็นเวลา 3 วันที่จะเติบโต ใน 250 มลErlenmeyer ขวดรูปกรวยที่มีน้ำตาลซูโครส-Na2Fe EDTA กลางวุ้น (ซูโครส 1%, 27.8 มิลลิกรัม 1-1 FeSO4 · 7H2O, 37.3 มิลลิกรัม 1-1 Na2 EDTA และวุ้น 0.6%) หลังจาก4 วันของการบ่มใบแรกที่ถูกเก็บรวบรวมและบิตใบจากใบแรกได้รับการปลอดเชื้อโอนไปยังหลอดทดลองที่มีสูตรMS (Murashige และ Skoog 1962) เสริมด้วย3.0 มิลลิกรัม 1-1 NAA 0.5 มิลลิกรัม 1-1 BAP บิตใบถูกบ่มที่ 20 ± 2 องศาเซลเซียสและได้รับอนุญาตสำหรับการสร้างแคลลัสภายใต้แสงอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา3 สัปดาห์. หลังจากที่ขบวนแคลลัสประมาณ 0.5 กรัมเซลล์กลุ่มที่ถูกย้ายด้วยคีมผ่านการฆ่าเชื้อลงใน250 มล Erlenmeyer ขวดรูปกรวยที่มี 50 มล. ของน้ำซุปPC-L2 (ฟิลลิปและคอลลิน 1979) เสริมด้วย3.0 มิลลิกรัมต่อลิตร-1 และ BAP 0.2 มิลลิกรัมต่อลิตร-1 NAA วัฒนธรรมของเซลล์ระงับเลี้ยงซ้ำ 3-4 ครั้ง. หลังจากนั้นหนึ่งสัปดาห์ของการบ่ม 3-4 วงจรของวัฒนธรรม, เซลล์ระงับการเพาะเลี้ยงในขวดรูปกรวยได้รับการรักษา 1 มิลลิลิตรกระตุ้นที่ความเข้มข้น 10 ไมโครกรัม ml- 1 สำหรับการรักษาควบคุม 1 มิลลิลิตรผ่านการฆ่าเชื้อน้ำกลั่นเป็นจำลองเชื้อ ตัวอย่างที่เก็บรวบรวมได้ในช่วงระยะการสกัดเอนไซม์. เมล็ด greengram ได้รับอนุญาตที่จะเติบโตเป็นเวลาหนึ่งเดือนในกระถางดินเผา trifoliate ใบพร้อมกับก้านใบถูกเก็บรวบรวมและพื้นผิวที่ผ่านการฆ่าเชื้อโดยการแช่ในบีกเกอร์ที่มีโซเดียมไฮโปคลอไรต์10% วิธีการแก้ปัญหาเป็นเวลา 3 นาทีตามด้วยห้าล้างฆ่าเชื้อในน้ำกลั่น หลังจากที่ใบฆ่าเชื้อที่มีการถ่ายโอนไปผ่านการฆ่าเชื้ออาหารเลี้ยงเชื้อที่มีผ้าฝ้ายชุบ. สามวันเก่า 10 มมแผ่นเส้นใยของ M. phaseolina ปลูกที่สื่อวุ้นเดกซ์โทรสมันฝรั่งถูกวางอยู่เหนือใบ trifoliate (1 แผ่น / ใบ) เอนไซม์ถูกสกัดในช่วงระยะจากทั้งเชื้อและจำลองเชื้อ(ที่มีแผ่นวุ้น) ใบ. greengram เนื้อเยื่อหรือเซลล์ใบระงับการเพาะเลี้ยงที่ถูกปั่นใน0.01 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์, พีเอช 6.0 เราใช้ 2 มิลลิลิตรบัฟเฟอร์ / กรัมน้ำหนักสด homogenates ถูกกรองผ่านสี่ชั้นของมัสลินผ้าและ filtrates ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 6000 รอบต่อนาทีที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที สารละลายเอนไซม์ที่ทำหน้าที่เป็นแหล่งที่มา. กิจกรรมเปอร์ออกซิเดถูกกำหนดตามLangcake และ Wickins (1975) และ Srivastava (1987). 1.5 มล. 0.05 M pyrogallol และ 100 ไมโครลิตรของเอนไซม์สารสกัดถูกเติมลงในspectrophotometer ตัวอย่างcuvettes cuvettes อ้างอิงที่มีอยู่ 100 ไมโครลิตรใช้งาน(โดยการต้ม) สารสกัดจากเอนไซม์และ 1.5 มิลลิลิตร 0.05 M pyrogallol ที่จะเริ่มต้นปฏิกิริยา 100 ไมโครลิตรของร้อยละ 1 ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (v / v) ถูกบันทึกอยู่ใน cuvette ตัวอย่างและการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่ถูกบันทึกไว้ที่30 ช่วงเวลาของ กิจกรรม peroxidase ถูกแสดงการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่420 นาโนเมตร. หน้าพื้นเมือง ไอโซไซม์เปอร์ออกซิเดวิเคราะห์โดยขั้นตอนการตีพิมพ์ (แพน et al. 1991) สำหรับประจุลบพื้นเมืองหน้า, polyacrylamide การแก้ไขเจล (8%, 1.5 มมหนา) ได้จัดทำขึ้นโดยการผสม 5.3 มิลลิลิตรริลาไมด์ 30% (ริลาไมด์ / ทวิริลาไมด์ 30: 0.8) 5.0 มล. 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 0.1 มล. 10% แอมโมเนียมเพอร์ซัลเฟต(ปรุงสดใหม่) 9.3 ml ของน้ำกลั่นและ10 ไมโครลิตร TEMED เจลซ้อนที่มีอยู่ 1.3 มล. ริลาไมด์ 30%, 2.5 มล. 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 50 ไมโครลิตร10% เพอร์ซัลเฟตแอมโมเนียม (ที่ปรุงสดใหม่) และ6.1 มล. น้ำกลั่น หลังจาก Degassing เป็นเวลา 10 นาที, 10 ไมโครลิตรTEMED เสริมและเจลถูกเทระหว่างแผ่นกระจก เจลที่ไม่ denaturing วิ่งเป็นเวลา 8 ชั่วโมงที่10 องศาเซลเซียส 30 mA ในอิแนวตั้ง Hoefer หน่วย เจลมีการย้อมสำหรับ peroxidase ใน 0.02 มอะซิเตตบัฟเฟอร์ที่pH 4.5 ที่มี 0.05% benzidine และ0.03% H2O2 หลังจากการย้อมสีเจลที่ถูกแช่อยู่ใน7% กรดอะซิติกเป็นเวลา 3 นาทีและล้างด้วยน้ำกลั่นน้ำ(นาโดนี่และ Sequeira 1980). การทำให้บริสุทธิ์เปอร์ออกซิเด ไอโซไซม์เปอร์ออกซิเดถูกทำให้บริสุทธิ์โดยกลั่นสารสกัดเอนไซม์มากกว่าSephadex G-25 คอลัมน์ (1.5 ซม. × 30 ซม.) (Pharmacia LKB, สวีเดน) 0.01 M โดยใช้โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์(pH 6.0) เป็นกันชนชะ ห้ามล. เป็นเศษส่วน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแยกเชื้อและการเตรียม elicitor .
รากเน่าโรคใบไหม้และก่อให้เกิดเชื้อโรคชีวภาพเป็นเมตร
ที่แยกได้จาก greengram รากติดเชื้อ ( พันธุ์ co5 ) และได้รับอนุญาตให้เติบโตในริชาร์ด

โซลูชั่นสำหรับหนึ่งสัปดาห์ที่อุณหภูมิห้อง เสื่อเส้นใยคือข้อมูล
ผนังเซลล์ถูกแยกจากการตีพิมพ์ prodedure
( แอนเดอร์สันเพราตี้ และ albersheim 1975 )
1 กรัมผนังเซลล์ถูกระงับในน้ำกลั่น 100 มิลลิลิตร และสังเคราะห์ที่ 121 ° C
20 นาที โดยเป็นระดับ
และเข้มข้น 10% ของปริมาณเดิมในการ rotavapor ( B ü chi , สวิตเซอร์แลนด์ ) ตามด้วย

แห้ง แช่แข็ง และระงับการเพาะเลี้ยงแคลลัสเพาะเซลล์
greengram ฟอกฆ่าเชื้อเมล็ดใน 70% เอทานอล
และอนุญาต 3 วันจะเติบโตใน 250 ml
เออร์เลนเมเยอร์กรวยขวดที่มี sucrose-na2fe
EDTA อาหารวุ้น ( 1 เปอร์เซ็นต์น้ำตาลซูโครส 27.8 mg 1 – 1 feso4
ด้วย 7h2o 37.3 มก. , 1 – 1 N EDTA และ 0.6 เปอร์เซ็นต์วุ้น ) หลังจาก
4 วัน 1 ใบประถมจำนวน
และบิตจากใบใบประถมเป็น aseptically
ย้ายหลอดทดลองที่มี MS
( อาหารสูตร Murashige and Skoog 1962 ) ที่เติม NAA 1 – 1
3.0 มิลลิกรัมต่อลิตรและ 0.5 มก. 1 – 1 บัพบิตใบ
บ่มที่อุณหภูมิ 20 ± 2 ° C และอนุญาต
ลัสภายใต้แสงอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 3 สัปดาห์ หลังจากการสร้างแคลลัส

ประมาณ 0.5 กรัมเซลล์กลุ่มถูกย้ายด้วยคีมเป็นหมันใน
250 ml ขวดกรวยเออร์เลนเมเยอร์ ที่มีปริมาตร 50 มิลลิลิตร
ซุป pc-l2 ( Phillips คอลลินส์ 1979 ) เสริม
กับ 3.0 มก. แอล– 1 BAP และ 0.2 มก. แอล– 1 ล วัฒนธรรมย่อยของ
เพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอยทำซ้ำ 3 – 4 ครั้ง หลังจากหนึ่งสัปดาห์ 1
3 – 4 รอบของวัฒนธรรมย่อยที่เพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอยในกรวย

รักษาด้วยขวด 1 มิลลิลิตรของ elicitor ความเข้มข้น 10 กรัมต่อμ
– 1 ควบคุมการเป็นหมันของ
1 มล. น้ำกลั่นเยาะเย้ยใส่ . จำนวน
เก็บที่เป็นระยะ
สำหรับการสกัดเอนไซม์greengram เมล็ดได้รับอนุญาตที่จะเติบโตเป็นเวลาหนึ่งเดือนในกระถางดิน
. ต่อใบพร้อมกับ
ก้านใบการเก็บรวบรวมและฆ่าเชื้อที่ผิวโดยแช่
ในบีกเกอร์ที่มี 10% โซเดียมไฮโปคลอไรต์
โซลูชันสำหรับ 3 นาทีตามด้วยห้า rinses เป็นหมัน
ในน้ำกลั่น หลังจากฆ่าเชื้อใบโอน
ปลอดเชื้อจานเลี้ยงเชื้อที่มี
ชุบสำลีวันที่สามที่อายุ 10 มม. แผ่นของ เส้นใยชีวภาพ
เติบโตบนอาหาร potato dextrose agar medium )
วางไว้เหนือต่อใบ ( 1 แผ่น / ใบ ) เอนไซม์ คือ สารสกัดที่ได้จากทั้ง ๆเป็นระยะ ๆ

( และเยาะเย้ยใส่หัวเชื้อวุ้นใบดิสก์ ) .
greengram ใบเนื้อเยื่อหรือเซลล์เพาะเลี้ยง
เป็นโฮโมระงับใน 0.01 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 6.0
. เราใช้ 2 ml บัฟเฟอร์ / กรัมน้ำหนักสด .การ homogenates
ถูกกรองผ่านสี่ชั้นของมัสลิน
ผ้า และเป็นระดับที่ 6 , 000 รอบต่อนาที สารละลายที่
4 ° C เป็นเวลา 20 นาที เสิร์ฟ สูง เป็นแหล่งของเอนไซม์ peroxidase
.
กิจกรรมถูกกำหนดตาม
langcake และ wickins ( 1975 ) และ ศรีวัสทวา ( 2530 ) .
1.5 มิลลิลิตร 0.05 M ซึ่งและ 100 μลิตรสารสกัดเอนไซม์ที่เติมลงในวัสดุตัวอย่าง

คิวเวทท .คิวเวทท์อ้างอิงที่มีอยู่ 100 μ L ซึ่ง
( เดือด ) สารสกัดจากเอนไซม์และ 1.5 มิลลิลิตร 0.05 M
ซึ่ง . เพื่อเริ่มต้นปฏิกิริยา 100 μ L 1 ต่อไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ร้อยละ
( v / v ) คือการเพิ่มจำนวนคิวเวตต์ และการเปลี่ยนแปลงในค่า

( บันทึกที่ 30 ของช่วงเวลา โดยมีกิจกรรม แสดงเป็น
เปลี่ยนในการดูดกลืนแสงที่ 420 nm .
พื้นเมืองหน้าไซม์ peroxidase วิเคราะห์โดย
เผยแพร่ขั้นตอน ( แพน et al . 1991 ) สำหรับหน้าแอน
พื้นเมืองแถบแก้ไขเจล ( 8 %
หนา 1.5 มม. ) เตรียมได้โดยการผสม 5.3 ml 30% อะคริลาไมด์
( อะคริลาไมด์ / บิสอะคริลาไมด์ ; 30 : 1 ) , 1.5 M หรือ HCl 5.0 มล
( พีเอช 8.8 ) , 0.1 ml 10 % ammonium persulfate
( เตรียมสด ) 9.3 กรัม , น้ำกลั่น ,
10 μผม temed .