- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
MethodsStrains and culture mediaH.
Methods
Strains and culture media
H. volcanii strains (see Additional file 1: Table S2)
were provided by Thorsten Allers of the University of
Nottingham, UK, and grown in media adapted from previous
studies [47]. Rich medium (Hv-YPC) contained 144 g
NaCl, 21 g MgSO4 × 7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 g
KCl, 12 mM Tris-HCl pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution,
1.0 ml trace element solution, 5.0 g yeast extract,
1.0 g casamino acids, and 1.0 g peptone per liter. Hv-YPC
used to culture GFP biofilms for EPS staining also contained
0.5% glucose.
Hv-Ca medium contained 144 g NaCl, 21 g MgSO4 ×
7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 g KCl, 12 mM Tris-HCl
pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution, 1.0 ml trace element
solution, 5.0 g casamino acids, 0.125 ml 6.4 mg/ml
thiamine solution, and 0.125 ml 0.8 mg/ml biotin solution
per liter.
A basal-salts starvation medium (Hv-starve) contained
all components in Hv-YPC other than complex nutrients
(i.e., yeast extract, casamino acids and peptone). Solid
media contained 18 g of agar per liter. When required,
uracil was provided at 50 μg/ml (ΔpyrE2 strains), thymidine
and hypoxanthine at 40 μg/ml (ΔhdrB strains), tryptophan
at 50 μg/ml (ΔtrpA strains), and novobiocin at 0.30 μg/ml
for antibiotic selection.
Development of GFP-expressing Haloferax volcanii
H1206 strain
Two H. volcanii uracil auxotrophic strains were developed
for constitutive GFP-expression and cell imaging by CLSM
and epifluorescence microscopy (see Additional file 1:
Table S2). The strain H1206(pJAM1020) was based on
selection through novobiocin resistance using a previously
developed vector [59], and a second strain H1206
(pSC409GFP) was based on the gene pyrE2 and uracil
autotrophy [44,46,47]. Plasmid pSC409GFP was constructed
by amplifying the region from pJAM1020
containing red-shifted GFP and P2 promoter for constitutive
expression in haloarchaeal species [59], and
inserting this construct into the shuttle vector pTA409
[101] (see Additional file 1: Tables S2 and S3). Each plasmid
was transformed into the strain H1206 (ΔpyrE2 Δmrr)
using the PEG-based method as previously developed
[49,102,103], and transformants were selected on Hv-
Ca medium without uracil for H1206(pSC409GFP) or
containing novobiocin for H1206(pJAM1020). H. volcanii
H1206 is identical to H26 other than an additional deletion
of the mrr gene, which encodes a restriction endonuclease
that cleaves methylated foreign DNA, allowing transformation
without passage through an Escherichia coli dam
mutant [46]. Growth kinetics of each GFP strain in liquid
Hv-YPC medium were measured by optical density and
were unchanged from the parental strain.
Biofilm growth systems
The media described above were prepared and used to
cultivate H. volcanii biofilms using the experimental
growth methods described below. All biofilms were incubated
at 42°C unless otherwise stated.
Colony biofilms
Colony biofilms as shown in Figure 1B were prepared on
13-mm polycarbonate filters (0.2-μm pore size, Sigma,
St. Louis, MO, Z365041) as previously described [7,23]. Diluted
H. volcanii culture (OD 600 nm = 0.1) was transferred
onto the surface of sterile filters previously placed directly
on the surface of the solid medium with sterile forceps.
After the culture medium penetrated the filter and evaporated,
the plates were inverted and incubated. Filters were
transferred to fresh plates under sterile conditions every
48 h during the growth period.
Static liquid biofilms
SL-biofilms were set up by aliquoting inoculated growth
medium into six-well plates and Petri dishes (as in
Figures 1C, 2K and 4, and see Additional files 3, 4, 5, 6 and
7: Movies 2–6), or chamber slides (Lab-Tek II, with 0.7 cm2
growth area per well; as in the top left panel of Figure 1C
and Figure 2I,J). A borosilicate glass coupon (Biosurfaces
Technologies Corporation, Bozeman, MT, RD 128-GL) or a
piece of coverglass was placed inside the six-well plates (as
in Figure 1C) to provide a biofilm growth surface that could
be visualized directly through microscopy.
Biofilm staining and microscopy preparation
The properties and experimental parameters used for all
dyes in this study are summarized in Additional file 1:
Table S1. The final concentration of each staining solution
was optimized based on either the manufacturer’s
protocol or a previous study. CR staining was performed
using the alkaline CR method [104,105]. Biofilms were
stained and prepared for microscopy as described below
for each growth method.
Colony biofilms
Mature colony biofilms were stained by transferring a
staining solution in Hv-starve medium directly on top of
the colony biofilm and incubating at room temperature
for 60 min. Cross sections of stained colony biofilms(e.g., Figure 1B) were cryo-processed by rapid freezing
on dry ice and cross-sectioned using a Leica CM1850
cryostat microtome as described previously [23]. Then,
the 5-μm transects were placed onto microscope slides
and visualized immediately.
Glass surfaces within SL-biofilms
Staining on glass coupons and coverglass was conducted by
removing the growth substrate from the growth system/
medium, followed by placement in fresh sterile 60-mm Petri
dishes. An Hv-starve staining solution was then gently
transferred (immediately, before the remaining culture
medium on the surface of the glass evaporated) to the surface
of the substrate (i.e. glass coupon), completely covering
the surface. This volume of staining solution remained on
the surface through surface tension during a 60-min staining
period at room temperature in the dark. The staining solution
was then carefully removed and the surface was washed
once with Hv-starve (same volume as used for staining solution).
The substrate was then placed in a new Petri dish and
fresh Hv-starve medium was added until the surface of the
growth surface was submerged by approximately 5 mm.
Chamber slides
Biofilms grown in chamber slides were stained by removing
conditioned medium from the wells through gentle aspiration,
followed by the addition of Hv-starve staining solution
(same volume as medium used to grow biofilm, e.g. 500 μl)
for 60 min at room temperature in the dark. Staining solution
was then removed, the surface was gently washed
once with the addition and subsequent removal of another
equal volume of Hv-starve, and fresh Hv-starve
was added, followed by direct visualization.
Fluorescence microscopy and imaging
Confocal microscopy
An upright Leica Microsystems (Wetzlar, Germany) TCS
SP5 laser-scanning confocal microscope was used (for data
shown in Figure 1D-I) with a 63× water immersion lens
placed directly into the bulk fluid above biofilms grown on
glass coupons or coverglass. Images were acquired
through the Leica Application Suite Advanced Fluorescence
software platform. Three-dimensional reconstructions
of focal plane slices were generated and analyzed
using IMARIS from Bitplane (Zürich, Switzerland;
Figure 1D-H) or Fiji [106]. An Andor spinning disk confocal
system with a Nikon Eclipse Ti microscope (data
shown in Figure 2C,D,E,M) and Nikon A1R Spectral
Confocal Microscope (Additional file 1: Figure S2) were
also used to image live biofilms within chamber slides.
Two-dimensional microscopy
Images were collected using an upright Nikon Eclipse
E800 epifluorescent microscope, also with water immersion
lenses placed directly above cultured biofilms. For biofilms
grown in chamber slides, they were collected
with an inverted Nikon Eclipse TE300 with a SPOT
digital microscope camera (shown in Figures 1A,B, 2B,
F-H and 3A-D, and Additional file 1: Figures S1,S2,S3
and Additional file 2: Movie 1).
Macroscopic imaging
Colonies and SL-biofilms in chamber slides were imaged
using a Zeiss Discovery V20 stereo fluorescence dissecting
microscope with a Zeiss AxioCam camera (Figures 1C and
2A,I-L and Additional file 1: Figure S1). Photographs of live
SL-biofilms in time-lapse studies were taken using a digital
single-lens reflex camera and macro lens, LED light source
and intervalometer mounted within an incubator (Figure 4
and Additional files 3, 4, 5, 6 and 7: Movies 2–6).
Additional imaging details
No autofluorescence signals were detected from H. volcanii
cells or biofilm structures in all excitation channels used in
this study (for excitation wavelengths used for each dye, see
Additional file 1: Table S1). Images collected with black
and white digital cameras were pseudo-colored with the
respective observed fluorescent emission signal.
Measurement of cellular morphology and biofilm structure
Cell lengths and dimensions of biofilm structures were
measured using Fiji as developed by the National Institutes
of Health [106]. Analysis of cell length for planktonic
and biofilm cell populations in Figure 3E included 2,000
cells each from three separate images collected from
three independent replicates under identical conditions.
Mid-exponential phase (OD 600 nm = 0.4 to 0.5) replicate
planktonic cultures of strain H1206(pJAM1020) were
imaged, diluted (to OD 600 nm = 0.1) in fresh medium
(Hv-YPC +0.5% glucose), and 500 μl aliquots were transferred
to replicate chamber-slide wells. Measurements were
generated using the analyze particles function of Fiji [106].
Preparation for macroscopic time-lapse studies and
induction of social motility
Disruption and reformation
SL-biofilms shown in Figure 4, Additional file 3: Movie 2
and Additional file 4: Movie 3 were established by transferring
the liquid culture (OD 600 nm = 1.0) into Petri
dishes and incubating under static conditions for 7 days.
These mature SL-biofilms were then mechanically homogenized
through repetitive pipetting with a serological
pipette to disrupt the layer of attached biofilm
and large loosely attached aggregates. This was followed
by transfer into a conical tube and gentle vortexing. The
homogenized SL-biofilm culture was then transferred
back into the original culture dish and left to incubate
while photographs were collected.Physical agitation
The SL-biofilm in Addition
Strains and culture media
H. volcanii strains (see Additional file 1: Table S2)
were provided by Thorsten Allers of the University of
Nottingham, UK, and grown in media adapted from previous
studies [47]. Rich medium (Hv-YPC) contained 144 g
NaCl, 21 g MgSO4 × 7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 g
KCl, 12 mM Tris-HCl pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution,
1.0 ml trace element solution, 5.0 g yeast extract,
1.0 g casamino acids, and 1.0 g peptone per liter. Hv-YPC
used to culture GFP biofilms for EPS staining also contained
0.5% glucose.
Hv-Ca medium contained 144 g NaCl, 21 g MgSO4 ×
7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 g KCl, 12 mM Tris-HCl
pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 solution, 1.0 ml trace element
solution, 5.0 g casamino acids, 0.125 ml 6.4 mg/ml
thiamine solution, and 0.125 ml 0.8 mg/ml biotin solution
per liter.
A basal-salts starvation medium (Hv-starve) contained
all components in Hv-YPC other than complex nutrients
(i.e., yeast extract, casamino acids and peptone). Solid
media contained 18 g of agar per liter. When required,
uracil was provided at 50 μg/ml (ΔpyrE2 strains), thymidine
and hypoxanthine at 40 μg/ml (ΔhdrB strains), tryptophan
at 50 μg/ml (ΔtrpA strains), and novobiocin at 0.30 μg/ml
for antibiotic selection.
Development of GFP-expressing Haloferax volcanii
H1206 strain
Two H. volcanii uracil auxotrophic strains were developed
for constitutive GFP-expression and cell imaging by CLSM
and epifluorescence microscopy (see Additional file 1:
Table S2). The strain H1206(pJAM1020) was based on
selection through novobiocin resistance using a previously
developed vector [59], and a second strain H1206
(pSC409GFP) was based on the gene pyrE2 and uracil
autotrophy [44,46,47]. Plasmid pSC409GFP was constructed
by amplifying the region from pJAM1020
containing red-shifted GFP and P2 promoter for constitutive
expression in haloarchaeal species [59], and
inserting this construct into the shuttle vector pTA409
[101] (see Additional file 1: Tables S2 and S3). Each plasmid
was transformed into the strain H1206 (ΔpyrE2 Δmrr)
using the PEG-based method as previously developed
[49,102,103], and transformants were selected on Hv-
Ca medium without uracil for H1206(pSC409GFP) or
containing novobiocin for H1206(pJAM1020). H. volcanii
H1206 is identical to H26 other than an additional deletion
of the mrr gene, which encodes a restriction endonuclease
that cleaves methylated foreign DNA, allowing transformation
without passage through an Escherichia coli dam
mutant [46]. Growth kinetics of each GFP strain in liquid
Hv-YPC medium were measured by optical density and
were unchanged from the parental strain.
Biofilm growth systems
The media described above were prepared and used to
cultivate H. volcanii biofilms using the experimental
growth methods described below. All biofilms were incubated
at 42°C unless otherwise stated.
Colony biofilms
Colony biofilms as shown in Figure 1B were prepared on
13-mm polycarbonate filters (0.2-μm pore size, Sigma,
St. Louis, MO, Z365041) as previously described [7,23]. Diluted
H. volcanii culture (OD 600 nm = 0.1) was transferred
onto the surface of sterile filters previously placed directly
on the surface of the solid medium with sterile forceps.
After the culture medium penetrated the filter and evaporated,
the plates were inverted and incubated. Filters were
transferred to fresh plates under sterile conditions every
48 h during the growth period.
Static liquid biofilms
SL-biofilms were set up by aliquoting inoculated growth
medium into six-well plates and Petri dishes (as in
Figures 1C, 2K and 4, and see Additional files 3, 4, 5, 6 and
7: Movies 2–6), or chamber slides (Lab-Tek II, with 0.7 cm2
growth area per well; as in the top left panel of Figure 1C
and Figure 2I,J). A borosilicate glass coupon (Biosurfaces
Technologies Corporation, Bozeman, MT, RD 128-GL) or a
piece of coverglass was placed inside the six-well plates (as
in Figure 1C) to provide a biofilm growth surface that could
be visualized directly through microscopy.
Biofilm staining and microscopy preparation
The properties and experimental parameters used for all
dyes in this study are summarized in Additional file 1:
Table S1. The final concentration of each staining solution
was optimized based on either the manufacturer’s
protocol or a previous study. CR staining was performed
using the alkaline CR method [104,105]. Biofilms were
stained and prepared for microscopy as described below
for each growth method.
Colony biofilms
Mature colony biofilms were stained by transferring a
staining solution in Hv-starve medium directly on top of
the colony biofilm and incubating at room temperature
for 60 min. Cross sections of stained colony biofilms(e.g., Figure 1B) were cryo-processed by rapid freezing
on dry ice and cross-sectioned using a Leica CM1850
cryostat microtome as described previously [23]. Then,
the 5-μm transects were placed onto microscope slides
and visualized immediately.
Glass surfaces within SL-biofilms
Staining on glass coupons and coverglass was conducted by
removing the growth substrate from the growth system/
medium, followed by placement in fresh sterile 60-mm Petri
dishes. An Hv-starve staining solution was then gently
transferred (immediately, before the remaining culture
medium on the surface of the glass evaporated) to the surface
of the substrate (i.e. glass coupon), completely covering
the surface. This volume of staining solution remained on
the surface through surface tension during a 60-min staining
period at room temperature in the dark. The staining solution
was then carefully removed and the surface was washed
once with Hv-starve (same volume as used for staining solution).
The substrate was then placed in a new Petri dish and
fresh Hv-starve medium was added until the surface of the
growth surface was submerged by approximately 5 mm.
Chamber slides
Biofilms grown in chamber slides were stained by removing
conditioned medium from the wells through gentle aspiration,
followed by the addition of Hv-starve staining solution
(same volume as medium used to grow biofilm, e.g. 500 μl)
for 60 min at room temperature in the dark. Staining solution
was then removed, the surface was gently washed
once with the addition and subsequent removal of another
equal volume of Hv-starve, and fresh Hv-starve
was added, followed by direct visualization.
Fluorescence microscopy and imaging
Confocal microscopy
An upright Leica Microsystems (Wetzlar, Germany) TCS
SP5 laser-scanning confocal microscope was used (for data
shown in Figure 1D-I) with a 63× water immersion lens
placed directly into the bulk fluid above biofilms grown on
glass coupons or coverglass. Images were acquired
through the Leica Application Suite Advanced Fluorescence
software platform. Three-dimensional reconstructions
of focal plane slices were generated and analyzed
using IMARIS from Bitplane (Zürich, Switzerland;
Figure 1D-H) or Fiji [106]. An Andor spinning disk confocal
system with a Nikon Eclipse Ti microscope (data
shown in Figure 2C,D,E,M) and Nikon A1R Spectral
Confocal Microscope (Additional file 1: Figure S2) were
also used to image live biofilms within chamber slides.
Two-dimensional microscopy
Images were collected using an upright Nikon Eclipse
E800 epifluorescent microscope, also with water immersion
lenses placed directly above cultured biofilms. For biofilms
grown in chamber slides, they were collected
with an inverted Nikon Eclipse TE300 with a SPOT
digital microscope camera (shown in Figures 1A,B, 2B,
F-H and 3A-D, and Additional file 1: Figures S1,S2,S3
and Additional file 2: Movie 1).
Macroscopic imaging
Colonies and SL-biofilms in chamber slides were imaged
using a Zeiss Discovery V20 stereo fluorescence dissecting
microscope with a Zeiss AxioCam camera (Figures 1C and
2A,I-L and Additional file 1: Figure S1). Photographs of live
SL-biofilms in time-lapse studies were taken using a digital
single-lens reflex camera and macro lens, LED light source
and intervalometer mounted within an incubator (Figure 4
and Additional files 3, 4, 5, 6 and 7: Movies 2–6).
Additional imaging details
No autofluorescence signals were detected from H. volcanii
cells or biofilm structures in all excitation channels used in
this study (for excitation wavelengths used for each dye, see
Additional file 1: Table S1). Images collected with black
and white digital cameras were pseudo-colored with the
respective observed fluorescent emission signal.
Measurement of cellular morphology and biofilm structure
Cell lengths and dimensions of biofilm structures were
measured using Fiji as developed by the National Institutes
of Health [106]. Analysis of cell length for planktonic
and biofilm cell populations in Figure 3E included 2,000
cells each from three separate images collected from
three independent replicates under identical conditions.
Mid-exponential phase (OD 600 nm = 0.4 to 0.5) replicate
planktonic cultures of strain H1206(pJAM1020) were
imaged, diluted (to OD 600 nm = 0.1) in fresh medium
(Hv-YPC +0.5% glucose), and 500 μl aliquots were transferred
to replicate chamber-slide wells. Measurements were
generated using the analyze particles function of Fiji [106].
Preparation for macroscopic time-lapse studies and
induction of social motility
Disruption and reformation
SL-biofilms shown in Figure 4, Additional file 3: Movie 2
and Additional file 4: Movie 3 were established by transferring
the liquid culture (OD 600 nm = 1.0) into Petri
dishes and incubating under static conditions for 7 days.
These mature SL-biofilms were then mechanically homogenized
through repetitive pipetting with a serological
pipette to disrupt the layer of attached biofilm
and large loosely attached aggregates. This was followed
by transfer into a conical tube and gentle vortexing. The
homogenized SL-biofilm culture was then transferred
back into the original culture dish and left to incubate
while photographs were collected.Physical agitation
The SL-biofilm in Addition
0/5000
วิธีการสายพันธุ์และสื่อวัฒนธรรมสายพันธุ์ volcanii H. (ดูเพิ่มเติมแฟ้ม 1: S2 ตาราง)ได้จาก Thorsten Allers ของมหาวิทยาลัยน็อตติงแฮม UK และเติบโตในสื่อที่ดัดแปลงจากก่อนหน้านี้ศึกษา [47] รวยปานกลาง (Hv-YPC) อยู่ 144 gNaCl, 21 g MgSO4 7H2O × 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 gKCl, 12 มม.ทริสเรทติ้ง HCl pH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 โซลูชัน1.0 มล.จุลธาตุโซลูชัน 5.0 g ยีสต์สกัดกรด casamino 1.0 g และ peptone 1.0 กรัมต่อลิตร Hv YPCใช้สำหรับย้อมสี EPS ยัง ประกอบด้วยวัฒนธรรม GFP biofilms0.5% กลูโคสHv Ca กลางอยู่ 144 g NaCl, MgSO4 × 21 กรัม7H2O, 18 g MgCl2 × 6H2O, 4.2 กรัม KCl, 12 มม.ตรี-HClpH 7.5, 3.125 ml 1 M CaCl2 โซลูชัน 1.0 มล.จุลธาตุโซลูชั่น กรด 5.0 g casamino, 0.125 ml 6.4 มิลลิกรัม/มิลลิลิตรโซลูชั่นไทอามีน และโซลูชั่นไบโอติน 0.8 mg/ml 0.125 mlต่อลิตรเกลือโรคความอดอยากสื่อ (อด Hv) อยู่ส่วนประกอบทั้งหมดใน Hv YPC ไม่ใช่สารอาหารที่ซับซ้อน(เช่น สารสกัดจากยีสต์ กรด casamino และ peptone) เป็นของแข็งสื่ออยู่ 18 กรัมของ agar ต่อลิตร เมื่อจำเป็นให้ที่ μg 50 ml (ΔpyrE2 สายพันธุ์), uracil thymidinehypoxanthine ที่ μg 40 ml (สายพันธุ์ ΔhdrB), และทริปโตเฟน50 ml μg (สายพันธุ์ ΔtrpA), และ novobiocin ที่ 0.30 μg/mlสำหรับการเลือกยาปฏิชีวนะพัฒนากำลัง GFP Haloferax volcaniiต้องใช้ H1206มีพัฒนาสายพันธุ์ auxotrophic uracil volcanii H. สองสำหรับนิพจน์ GFP ขึ้นและเซลล์ภาพ โดย CLSMและ epifluorescence microscopy (ดูเพิ่มเติมแฟ้ม 1:ตาราง S2) เป็นไปตามสายพันธุ์ H1206(pJAM1020)เลือก โดยใช้ความต้านทาน novobiocin ที่ก่อนหน้านี้พัฒนา เวกเตอร์ [59] และต้องใช้สอง H1206(pSC409GFP) ขึ้นอยู่กับยีน pyrE2 และ uracilautotrophy [44,46,47] Plasmid pSC409GFP ถูกสร้างขึ้นโดยมือภูมิภาคจาก pJAM1020มีสีแดงเปลี่ยน GFP และ p 2 โปรโมเตอร์สำหรับขึ้นนิพจน์ในชนิด haloarchaeal [59], และแทรกโครงสร้างนี้เป็น pTA409 เวกเตอร์รถ[101] (ดูเพิ่มเติมแฟ้ม 1: ตาราง S2 และ S3) แต่ละ plasmidถูกเปลี่ยนเป็นสายพันธุ์ H1206 (ΔpyrE2 Δmrr)โดยใช้วิธียึดตรึงเป็นก่อนหน้านี้มีพัฒนา[49,102,103], และ transformants ได้ถูกเลือกบน Hv -Ca กลาง โดย uracil สำหรับ H1206(pSC409GFP) หรือประกอบด้วย novobiocin สำหรับ H1206(pJAM1020) H. volcaniiH1206 จะเหมือนกับ H26 ไม่ใช่การลบเพิ่มเติมของยีน mrr ซึ่งจแมป endonuclease จำกัดที่แยกออก methylated DNA ต่างประเทศ ช่วยให้การเปลี่ยนแปลงไม่ มีเส้นทางผ่านมี Escherichia coli เขื่อนmutant [46] จลนพลศาสตร์การเจริญเติบโตของแต่ละสายพันธุ์ GFP ในของเหลวHv YPC กลางถูกวัด โดยความหนาแน่นออปติคอล และไม่เหมือนสายพันธุ์โดยผู้ปกครองระบบ Biofilm เจริญเติบโตเตรียม และใช้สื่อที่อธิบายไว้ข้างต้นH. volcanii biofilms ใช้การทดลองปลูกวิธีการเจริญเติบโตที่อธิบายไว้ด้านล่าง Biofilms ทั้งหมดถูก incubatedที่ 42° C เว้นแต่ระบุไว้เป็นอย่างอื่นBiofilms อาณานิคมBiofilms อาณานิคมดังแสดงในรูปที่ 1B ถูกเตรียมไว้ใน13 มม.โพลีคาร์บอเนตกรอง (0.2-μm รูขุมขนขนาด ซิกSt. Louis, MO, Z365041) อธิบายไว้ว่า ก่อนหน้านี้ [7,23] ข้อยกเว้นH. volcanii วัฒนธรรม (OD 600 nm = 0.1) มีการโอนย้ายบนพื้นผิวของกระบอกกรองวางไว้ก่อนหน้านี้ โดยตรงบนพื้นผิวของสื่อแข็งด้วยคีมกอซหลังจากที่สื่อวัฒนธรรมทะลวงตัว และหาย ไปแผ่นได้กลับ และ incubated ตัวกรองได้โอนย้ายไปที่แผ่นสดภายใต้เงื่อนไขที่ผ่านการฆ่าเชื้อทุกh 48 ช่วงเจริญเติบโตBiofilms คงเหลวSL biofilms ถูกตั้งค่า โดย aliquoting inoculated เจริญเติบโตสื่อดี 6 แผ่นและจาน Petri (ในตัวเลขที่ 1C, 2 K และ 4 และดูเพิ่มเติมไฟล์ 3, 4, 5, 6 และ7: ภาพยนตร์ 2-6), หรือภาพนิ่ง (Tek แล็บ II กับ 0.7 cm2 chamberตั้งเจริญเติบโตต่อด้วย ในแผงควบคุมด้านซ้ายบนสุดของรูป 1Cกรูป 2I, J) คูปองแก้ว borosilicate (Biosurfacesเทคโนโลยีคอร์ปอเรชั่น Bozeman, MT, RD 128-GL) หรือชิ้นส่วนของ coverglass ได้วางอยู่ภายในแผ่น 6 ดีเป็นรูปที่ 1C ใน) เพื่อให้พื้นผิวเติบโต biofilm ที่สามารถจะ visualized โดยตรงผ่าน microscopyเตรียมการย้อมสีและ microscopy Biofilmคุณสมบัติและพารามิเตอร์ที่ทดลองใช้ทั้งหมดสีในการศึกษานี้สามารถสรุปได้ในไฟล์เพิ่มเติม 1:ตาราง S1 ความเข้มข้นสุดท้ายของแต่ละ stainingถูกปรับให้เหมาะสมตามของผู้ผลิตโพรโทคอลหรือการศึกษาก่อนหน้านี้ ย้อมสี CR ทำใช้วิธี CR ด่าง [104,105] Biofilms ได้ทิ้งคราบ และเตรียมพร้อมสำหรับ microscopy อธิบายไว้ด้านล่างสำหรับแต่ละวิธีการเจริญเติบโตBiofilms อาณานิคมBiofilms อาณานิคมผู้ใหญ่มีสี โดยถ่ายโอนเป็นโซลูชันในอด Hv โดยตรงในด้านของการย้อมสีbiofilm อาณานิคมและ incubating ที่อุณหภูมิห้องสำหรับ 60 นาที ส่วนขนของอาณานิคมทิ้งคราบ biofilms (เช่น รูป 1B) ได้ประมวลผล cryo โดยแช่แข็งอย่างรวดเร็วน้ำแข็งแห้ง และ cross-sectioned ใช้ CM1850 ไลcryostat microtome อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] แล้ว5 μm transects ถูกวางลงบนภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์และ visualized ทันทีพื้นผิวแก้วภายใน SL biofilmsย้อมสีบนแก้วคูปองและ coverglass ได้ดำเนินการโดยเอาพื้นผิวเจริญเติบโตจากระบบเจริญเติบโต /ขนาดกลาง,:"ตามตำแหน่งใน Petri 60 มม.ใส่สดด้วยอาหาร เป็น Hv-อดโซลูชันย้อมสีได้แล้วค่อย ๆการโอนย้าย (ทันที ก่อนวัฒนธรรมเหลือกลางบนพื้นผิวของแก้วที่หายไป) เพื่อผิวของพื้นผิว (เช่นแก้วคูปอง), สมบูรณ์ครอบคลุมพื้นผิว ไดรฟ์ข้อมูลนี้ของโซลูชันการย้อมสีที่ยังคงอยู่บนผิวผ่านแรงตึงผิวระหว่าง 60 นาทีย้อมสีรอบระยะเวลาที่อุณหภูมิห้องในมืด โซลูชัน stainingถูกแล้วเอาอย่างระมัดระวัง และมีล้างผิวครั้งกับ Hv-อด (ไดรฟ์ข้อมูลเดียวกันในการแก้ไขปัญหาการย้อมสี)พื้นผิวถูกวางลงในจานเพาะเชื้อใหม่ และเพิ่มสื่อ Hv อดสดจนถึงพื้นผิวของการผิวเจริญเติบโตถูกน้ำท่วม โดยประมาณ 5 มม.ห้องภาพนิ่งBiofilms ปลูกหอภาพนิ่งถูกสีออกกลางอากาศจากบ่อผ่านปณิธานอ่อนโยนตาม ด้วยการเพิ่มอด Hv ย้อมสีโซลูชัน(ไดรฟ์ข้อมูลเดียวกันเป็นสื่อที่ใช้ในการเจริญเติบโต biofilm เช่น 500 μl)ใน 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องในมืด แก้ไขปัญหาการย้อมสีถูก แล้วเอา พื้นผิวถูกเบา ๆ ล้างเมื่อ มีการเพิ่มและเอาออกตามมาอีกปริมาตรเท่าอด Hv และสด Hv-อดมีเพิ่ม ตาม ด้วยการแสดงภาพประกอบเพลงโดยตรงFluorescence microscopy และภาพConfocal microscopy(Wetzlar เยอรมนี) TCS Microsystems ไลการตรงใช้กล้องจุลทรรศน์ confocal สแกนเลเซอร์ (สำหรับข้อมูล SP5แสดงในรูปที่ 1D-ฉัน) ด้วยเลนส์แช่น้ำ 63 ×วางลงน้ำมันจำนวนมากเหนือ biofilms ปลูกในคูปองแก้วหรือ coverglass ภาพที่ได้รับมาผ่านชุดแอพลิเคชันไล Fluorescence ขั้นสูงซอฟต์แวร์แพลตฟอร์ม ศึกษาแบบสามมิติของระนาบโฟกัส ชิ้นถูกสร้างขึ้น และวิเคราะห์ใช้ IMARIS จาก Bitplane (Zürich สวิตเซอร์แลนด์รูปที่ 1 D-H) หรือฟิจิ [106] ไว้ Andor ปั่นบน confocalกล้องจุลทรรศน์ Nikon คราสตี้ (ข้อมูลระบบแสดงในรูปที่ 2C, D, E, M) และ Nikon A1R สเปกตรัมกล้องจุลทรรศน์ confocal (เพิ่มเติมไฟล์ที่ 1: รูป S2) ได้นอกจากนี้ยัง ใช้ biofilms สดภาพในห้องภาพนิ่งMicroscopy สองภาพที่ถูกเก็บรวบรวมใช้คราส Nikon ตรงกล้องจุลทรรศน์ epifluorescent E800 ยัง มีแช่น้ำเลนส์วางอยู่ด้านบนอ่าง biofilms สำหรับ biofilmsพวกเขาเติบโตขึ้นในภาพนิ่งของหอการค้า ถูกรวบรวมไว้มีการ TE300 คราสนิกลับมีจุดกล้องไมโครสโคปแบบดิจิตอล (แสดงในรูป 1A, B, 2BF H และ 3A D และแฟ้มเพิ่มเติม 1: ตัวเลข S1, S2, S3และเพิ่มเติมแฟ้ม 2:1 ภาพยนตร์)ภาพ macroscopicImaged อาณานิคมและ SL-biofilms ในภาพนิ่งของหอการค้าใช้เป็น V20 ค้นหา Zeiss fluorescence สเตอริโอ dissectingกล้องจุลทรรศน์กล้อง Zeiss AxioCam (ตัวเลข 1C และ2A -L และเพิ่มเติมแฟ้ม 1: S1 รูป) รูปถ่ายของสดBiofilms SL ในการหน่วงเวลาการศึกษาถูกนำมาใช้เป็นดิจิตอลกล้องสะท้อนภาพเลนส์เดี่ยวและเลนส์แมโคร แหล่งกำเนิดแสง LEDintervalometer ที่ติดตั้งภายในการบ่มเพาะวิสาหกิจ (รูปที่ 4 และและเพิ่มเติมแฟ้ม 3, 4, 5, 6 และ 7: ภาพยนตร์ 2-6)รายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับภาพสัญญาณ autofluorescence ไม่พบจาก H. volcaniiใช้เซลล์หรือโครงสร้าง biofilm ในทุกสถานีในการกระตุ้นการศึกษานี้ (ความยาวคลื่นในการกระตุ้นใช้สำหรับแต่ละสีย้อม การแฟ้มเพิ่มเติม 1: S1 ตาราง) ภาพรวบรวมกับสีดำและกล้องดิจิตอลสีขาว pseudo-สีมีการปล่อยก๊าซเรืองแสงสังเกตตามสัญญาณวัดโครงสร้างสัณฐานวิทยาและ biofilm โทรศัพท์มือถือความยาวของเซลล์และขนาดของโครงสร้าง biofilmวัดโดยใช้ฟิจิที่พัฒนา โดยสถาบันแห่งชาติสุขภาพ [106] วิเคราะห์ความยาวเซลล์สำหรับ planktonicและประชากรเซลล์ biofilm ใน 3E รูปรวม 2000เซลล์แต่ละจากภาพสามแยกเก็บรวบรวมจากสามอิสระเหมือนกับภายใต้เงื่อนไขเหมือนกันระยะกลางเนน (OD 600 nm = 0.4-0.5) จำลองวัฒนธรรม planktonic ของต้องใช้ H1206(pJAM1020) ได้imaged ผสม (การ OD 600 nm = 0.1) ในสดกลาง(Hv-YPC +0.5% น้ำตาลกลูโคส), และมีการถ่ายโอน 500 μl aliquotsในการจำลองภาพนิ่งหอการค้าบ่อ วัดได้สร้างโดยใช้ฟังก์ชันวิเคราะห์อนุภาคของฟิจิ [106]เตรียมศึกษาการหน่วงเวลา macroscopic และเหนี่ยวนำของสังคม motilityทรัพยและปฏิรูปแสดงในรูปที่ 4 ไฟล์เพิ่มเติม 3 biofilms SL: ภาพยนตร์ 2และเพิ่มเติมแฟ้ม 4:3 ภาพยนตร์ก่อตั้งขึ้น โดยถ่ายโอนวัฒนธรรมของเหลว (OD 600 nm = 1.0) ใน Petriอาหารและ incubating ภายใต้เงื่อนไขคง 7 วันSL-biofilms เหล่านี้เติบโตได้แล้วกลไก homogenized เป็นกลุ่มผ่าน pipetting ซ้ำกับสภาวะการเปตต์รบกวนชั้นของ biofilm แนบและขนาดใหญ่ซึ่งแนบผล นี้ได้ตามโดยโอนเป็นท่อทรงกรวยและ vortexing อ่อนโยน ที่วัฒนธรรม SL biofilm homogenized เป็นกลุ่มแล้วมีการโอนย้ายกลับเป็นซ้ายฟักและวัฒนธรรมจานเดิมในขณะที่ภาพถูกเก็บรวบรวมอาการกังวลต่อทางกายภาพBiofilm SL นอกจากนี้
การแปล กรุณารอสักครู่..
วิธี
สายพันธุ์และวัฒนธรรมสื่อ
เอช volcanii สายพันธุ์ (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1: ตาราง S2)
มีให้โดย Thorsten Allers ของมหาวิทยาลัย
น็อตติงแฮม, สหราชอาณาจักรและเติบโตขึ้นในสื่อที่ดัดแปลงมาจากที่ก่อนหน้านี้
การศึกษา [47] กลางรวย (HV-YPC) มี 144 กรัม
โซเดียมคลอไรด์, 21 กรัม MgSO4 × 7H2O, 18 กรัม MgCl2 × 6H2O 4.2 กรัม
KCl, 12 มิลลิ Tris-HCl พีเอช 7.5, 3.125 มล. 1 แก้ปัญหา M CaCl2,
1.0 ml ติดตามการแก้ปัญหาองค์ประกอบ 5.0 กรัมสารสกัดจากยีสต์,
1.0 กรัมกรดซามิโนและเปปโตน 1.0 กรัมต่อลิตร HV-YPC
ใช้ในการไบโอฟิล์มวัฒนธรรม GFP สำหรับการย้อมสีเป็นกำไรต่อหุ้นยังมี
น้ำตาลกลูโคส 0.5%.
กลาง HV-Ca บรรจุ 144 กรัมโซเดียมคลอไรด์, 21 กรัม MgSO4 ×
7H2O, 18 กรัม MgCl2 × 6H2O 4.2 กรัม KCl, 12 mM Tris-HCl
ค่า pH 7.5 3.125 มล. 1 แก้ปัญหา M CaCl2 1.0 มลธาตุ
แก้ปัญหา 5.0 กรัมกรดซามิ, 0.125 มล 6.4 mg / ml
แก้ปัญหาวิตามินบีและ 0.125 มล 0.8 mg / แก้ปัญหาไบโอตินมิลลิลิตร
ต่อลิตร.
ฐาน-เกลือกลางอดอยาก (HV-อด) มี
ส่วนประกอบทั้งหมดใน HV-YPC อื่น ๆ นอกเหนือจากสารอาหารที่ซับซ้อน
(เช่นสารสกัดจากยีสต์, กรดซามิและเปปโตน) ของแข็ง
สื่อที่มี 18 กรัมของอาหารเลี้ยงเชื้อต่อลิตร เมื่อต้อง
ถูกจัดให้ uracil ที่ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔpyrE2) thymidine
และ hypoxanthine ที่ 40 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔhdrB), โพรไบโอ
ที่ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔtrpA) และ novobiocin ที่ 0.30 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร
สำหรับการเลือกยาปฏิชีวนะ .
การพัฒนา GFP-แสดง Haloferax volcanii
ความเครียด H1206
สอง H. volcanii uracil auxotrophic สายพันธุ์ได้รับการพัฒนา
สำหรับส่วนประกอบแสดงออก GFP และการถ่ายภาพมือถือโดย CLSM
และกล้องจุลทรรศน์ epifluorescence (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1:
ตาราง S2) H1206 ความเครียด (pJAM1020) ก็ขึ้นอยู่กับ
ตัวเลือกผ่านความต้านทาน novobiocin ใช้ก่อนหน้านี้
ได้รับการพัฒนาเวกเตอร์ [59] และสายพันธุ์ที่สอง H1206
(pSC409GFP) ก็ขึ้นอยู่กับยีน pyrE2 และ uracil
autotrophy [44,46,47] พลาสมิด pSC409GFP ถูกสร้างขึ้น
โดยขยายภูมิภาคจาก pJAM1020
มีโปรโมเตอร์แดงขยับ GFP และ P2 เป็นส่วนประกอบสำหรับ
การแสดงออกในรูป haloarchaeal [59] และ
ใส่นี้สร้างเป็นรถรับส่งเวกเตอร์ pTA409
[101] (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1 ตาราง S2 และ S3 ) พลาสมิดแต่ละ
ก็กลายเป็นสายพันธุ์ H1206 (ΔpyrE2Δmrr)
โดยใช้วิธี PEG-based เช่นการพัฒนาก่อนหน้านี้
[49102103] และ transformant ที่ได้รับการคัดเลือกใน Hv-
Ca กลางโดยไม่ต้อง uracil สำหรับ H1206 (pSC409GFP) หรือ
ที่มี novobiocin สำหรับ H1206 (pJAM1020) H. volcanii
H1206 เป็นเหมือน H26 อื่น ๆ นอกเหนือจากการลบเพิ่มเติม
ของยีน MRR ซึ่ง encodes endonuclease ข้อ จำกัด
ที่แข็งกระด้าง methylated ดีเอ็นเอต่างประเทศช่วยให้การเปลี่ยนแปลง
ได้โดยไม่ต้องผ่านทาง Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [46] จลนพลศาสตร์การเจริญเติบโตของแต่ละสายพันธุ์ GFP ในของเหลว
กลาง HV-YPC ถูกวัดโดยความหนาแน่นของแสงและ
มีการเปลี่ยนแปลงไปจากสายพันธุ์ของพ่อแม่.
Biofilm ระบบการเจริญเติบโตของ
สื่ออธิบายไว้ข้างต้นได้รับการเตรียมความพร้อมและใช้ในการ
เพาะปลูก H. volcanii ไบโอฟิล์มโดยใช้การทดลอง
วิธีการเจริญเติบโตอธิบายไว้ด้านล่าง ไบโอฟิล์มทั้งหมดถูกบ่ม
ที่อุณหภูมิ 42 ° C ยกเว้นที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม
อาณานิคมไบโอฟิล์มดังแสดงในรูปที่ 1B ถูกจัดทำขึ้นใน
13 มมฟิลเตอร์โพลีคาร์บอเนต (0.2 ไมครอนขนาดรูขุมขน, Sigma,
เซนต์หลุยส์, MO, Z365041) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 7,23] ปรับลด
เอช วัฒนธรรม volcanii (OD 600 นาโนเมตร = 0.1) ถูกย้าย
ลงบนพื้นผิวของตัวกรองผ่านการฆ่าเชื้อก่อนหน้านี้วางโดยตรง
บนพื้นผิวของสื่อที่เป็นของแข็งที่มีคีมหมัน.
หลังจากอาหารเลี้ยงเชื้อทะลุตัวกรองและระเหย
แผ่นถูกคว่ำและบ่ม กรองถูก
ถ่ายโอนไปยังแผ่นสดภายใต้เงื่อนไขที่ผ่านการฆ่าเชื้อทุก
48 ชั่วโมงในช่วงระยะเวลาการเจริญเติบโต.
ของเหลวคงไบโอฟิล์ม
SL-ไบโอฟิล์มได้รับการจัดตั้งขึ้นโดย aliquoting เชื้อเจริญเติบโตของ
กลางเป็นแผ่นหกดีและจานเลี้ยงเชื้อ (เช่นใน
รูปที่ 1C, 2K และ 4 และ ดูแฟ้มเพิ่มเติม 3, 4, 5, 6 และ
7: ภาพยนตร์ 2-6) หรือภาพนิ่งห้อง (Lab เต็กครั้งที่สอง 0.7 cm2
พื้นที่การเจริญเติบโตต่อกันในขณะที่แผงด้านซ้ายบนของรูป 1C
และรูปที่ 2I, J ) แก้ว borosilicate คูปอง (Biosurfaces
เทคโนโลยีคอร์ปอเรชั่น Bozeman, MT, RD 128-GL) หรือ
ชิ้นส่วนของ coverglass ถูกวางไว้ภายในแผ่นหกดี (เช่น
ในรูปที่ 1C) เพื่อให้พื้นผิวการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์มที่สามารถ
มองเห็นได้โดยตรงผ่านกล้องจุลทรรศน์ .
การย้อมสีและการจัดเตรียม Biofilm กล้องจุลทรรศน์
คุณสมบัติและพารามิเตอร์การทดลองใช้สำหรับทุก
สีย้อมในการศึกษานี้ได้สรุปไว้ในแฟ้มเพิ่มเติม 1:
ตาราง S1 ความเข้มข้นสุดท้ายของการแก้ปัญหาการย้อมสีแต่ละ
ถูกปรับให้เหมาะสมขึ้นอยู่กับอย่างใดอย่างหนึ่งของผู้ผลิต
โปรโตคอลหรือศึกษาก่อนหน้านี้ การย้อมสี CR ถูกดำเนินการ
โดยใช้วิธีการ CR ด่าง [104,105] ไบโอฟิล์มได้รับการ
ย้อมสีและเตรียมพร้อมสำหรับการใช้กล้องจุลทรรศน์ตามที่อธิบายไว้ข้างล่างนี้
สำหรับวิธีการเจริญเติบโตของแต่ละ.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม
ไบโอฟิล์มอาณานิคมผู้ใหญ่มีการย้อมโดยการโอน
การแก้ปัญหาการย้อมสีใน HV-อดกลางตรงด้านบนของ
ไบโอฟิล์มอาณานิคมและการบ่มที่อุณหภูมิห้อง
เป็นเวลา 60 นาที ส่วนครอสของไบโอฟิล์มอาณานิคมเปื้อน (เช่นรูปที่ 1B) ได้รับการ Cryo-ประมวลผลโดยการแช่แข็งอย่างรวดเร็ว
บนน้ำแข็งแห้งและตัดข้ามที่ใช้ Leica CM1850
Cryostat microtome ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] จากนั้น
ตัดขวาง 5 ไมครอนถูกวางลงบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์
และมองเห็นได้ทันที.
แก้วพื้นผิวภายใน SL-ไบโอฟิล์ม
ย้อมสีในคูปองแก้วและ coverglass ได้ดำเนินการโดย
การเอาสารตั้งต้นการเจริญเติบโตจากระบบการเจริญเติบโต /
กลางตามด้วยตำแหน่งในการฆ่าเชื้อสด 60 มม Petri
อาหาร การแก้ปัญหาการย้อมสี HV-อดจากนั้นก็ค่อยๆ
โอน (ทันทีก่อนที่วัฒนธรรมที่เหลืออยู่
กลางบนพื้นผิวของกระจกระเหย) กับพื้นผิว
ของพื้นผิว (เช่นคูปองแก้ว), สมบูรณ์ครอบคลุม
พื้นผิว ปริมาณของการแก้ปัญหาการย้อมสีนี้ยังคงอยู่บน
พื้นผิวที่ผ่านแรงตึงผิวในระหว่างการย้อมสี 60 นาที
ระยะเวลาที่อุณหภูมิห้องในที่มืด การแก้ปัญหาการย้อมสี
จากนั้นก็ลบออกอย่างระมัดระวังและพื้นผิวที่ถูกล้าง
ครั้งเดียวกับ HV-อด (ปริมาณเดียวกันที่ใช้สำหรับการแก้ปัญหาการย้อมสี).
พื้นผิวที่ถูกนำมาวางไว้ในจานเลี้ยงเชื้อใหม่และ
สดกลาง HV-อดถูกเพิ่มเข้ามาจนพื้นผิวของ
พื้นผิวการเจริญเติบโตเป็นที่จมอยู่ใต้น้ำประมาณ 5 มม.
หอการค้าสไลด์
ไบโอฟิล์มสไลด์ปลูกในห้องมีการย้อมโดยการลบ
กลางปรับอากาศจากบ่อผ่านทะเยอทะยานอ่อนโยน
ตามด้วยนอกเหนือจาก HV-อดแก้ปัญหาการย้อมสี
(ปริมาณเดียวกันเป็นสื่อกลางที่ใช้ในการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์มเช่น 500 ไมโครลิตร)
เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องในที่มืด การแก้ปัญหาการย้อมสี
จะถูกลบออกแล้วผิวได้รับการซัก
ครั้งเดียวกับการบวกและลบตามมาอีก
ปริมาณที่เท่ากันของ HV-อดอยากและความสดใหม่ HV-อด
ถูกเพิ่มเข้ามาตามด้วยการสร้างภาพโดยตรง.
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและการถ่ายภาพ
กล้องคอนโฟคอล
ตรง Leica Microsystems (Wetzlar, เยอรมนี) TCS
SP5 เลเซอร์กล้องจุลทรรศน์ confocal ถูกนำมาใช้ (สำหรับข้อมูลที่
แสดงในรูปที่ 1D-I) กับ 63 ×น้ำแช่เลนส์
วางโดยตรงเป็นของเหลวเป็นกลุ่มไบโอฟิล์มดังกล่าวข้างต้นที่ปลูกใน
คูปองแก้วหรือ coverglass ภาพที่ได้มา
ผ่าน Leica Application Suite ขั้นสูงเรืองแสง
แพลตฟอร์มซอฟต์แวร์ ไทปันสามมิติ
ของชิ้นระนาบโฟกัสถูกสร้างและวิเคราะห์
โดยใช้ IMARIS จาก bitplane (ซูริค, สวิตเซอร์;
รูป 1D-H) หรือฟิจิ [106] ดิสก์ปั่น Andor confocal
ระบบด้วยกล้องจุลทรรศน์ Nikon คราส Ti (ข้อมูล
แสดงในรูปที่ 2C, D, E, M) และ Nikon A1R ผี
Confocal กล้องจุลทรรศน์ (แฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S2) ได้รับ
นอกจากนี้ยังใช้ในการไบโอฟิล์มสดภาพสไลด์ภายในห้อง
กล้องจุลทรรศน์สองมิติ
ภาพจะถูกเก็บรวบรวมโดยใช้ตรง Nikon คราส
E800 กล้องจุลทรรศน์ epifluorescent ยังมีการแช่น้ำ
เลนส์วางโดยตรงด้านบนแผ่นชีวะเลี้ยง สำหรับไบโอฟิล์ม
สไลด์ปลูกในห้องที่พวกเขาได้ถูกเก็บรวบรวม
ด้วยฤๅษี Nikon คราส TE300 กับจุด
กล้องไมโครสโคปแบบดิจิตอล (แสดงในรูปที่ 1A, B, 2B,
FH และ 3A-D และแฟ้มเพิ่มเติม 1: ตัวเลข S1, S2 S3
และ แฟ้มเพิ่มเติมที่ 2:. ภาพยนตร์ 1)
การถ่ายภาพด้วยตาเปล่า
อาณานิคมและ SL-ไบโอฟิล์มสไลด์ในห้องถูกถ่ายภาพ
โดยใช้การค้นพบ Zeiss V20 เรืองแสงสเตอริโอผ่า
กล้องจุลทรรศน์ด้วยกล้อง Zeiss AxioCam (ตัวเลข 1C และ
2A, อิลลินอยส์และแฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S1) รูปถ่ายของสด
SL-ไบโอฟิล์มในการศึกษาตามเวลาที่ถูกถ่ายโดยใช้ดิจิตอล
เลนส์เดี่ยวและกล้องสะท้อนเลนส์มาโคร, แหล่งกำเนิดแสง LED
และ intervalometer ติดตั้งภายในศูนย์บ่มเพาะ (รูปที่ 4
และแฟ้มเพิ่มเติม 3, 4, 5, 6 และ 7: . ภาพยนตร์ 2-6)
รายละเอียดการถ่ายภาพเพิ่มเติม
ไม่มีสัญญาณ autofluorescence ถูกตรวจพบจากเอช volcanii
เซลล์หรือโครงสร้างไบโอฟิล์มในทุกช่องทางที่ใช้ในการกระตุ้น
การศึกษานี้ (ความยาวคลื่นกระตุ้นใช้สำหรับย้อมแต่ละดู
แฟ้มเพิ่มเติม 1: ตาราง S1) รูปภาพที่เก็บรวบรวมด้วยสีดำ
กล้องดิจิตอลและสีขาวถูกหลอกสีกับ
แต่ละสังเกตสัญญาณการปล่อยเรืองแสง.
การวัดลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์และโครงสร้างไบโอฟิล์ม
ความยาวของเซลล์และขนาดของโครงสร้างไบโอฟิล์มได้รับการ
วัดโดยใช้ฟิจิเป็นที่พัฒนาโดยสถาบันแห่งชาติ
ของสุขภาพ [106] การวิเคราะห์ความยาวของเซลล์ planktonic
และประชากรเซลล์ไบโอฟิล์มในรูปที่ 3E รวม 2,000
เซลล์แต่ละคนมาจากสามแยกภาพที่เก็บมาจาก
สามซ้ำอิสระภายใต้เงื่อนไขที่เหมือนกัน.
ขั้นตอนกลางชี้แจง (OD 600 นาโนเมตร = 0.4-0.5) ทำซ้ำ
วัฒนธรรม planktonic ความเครียด H1206 ( pJAM1020) ได้รับการ
ถ่ายภาพเจือจาง (เพื่อ OD 600 นาโนเมตร = 0.1) ในสื่อสด
(HV-YPC กลูโคส + 0.5%) และ 500 ไมโครลิตร aliquots ถูกย้าย
ที่จะทำซ้ำบ่อห้องสไลด์ วัดถูก
สร้างขึ้นโดยใช้อนุภาควิเคราะห์การทำงานของฟิจิ [106].
การเตรียมการสำหรับการศึกษาไทม์ด้วยตาเปล่าและ
การชักนำของการเคลื่อนไหวทางสังคม
ขัดข้องและการปฏิรูป
SL-ไบโอฟิล์มที่แสดงในรูปที่ 4 แฟ้มเพิ่มเติมที่ 3: ภาพยนตร์ 2
และแฟ้มเพิ่มเติม 4: ภาพยนตร์ 3 ที่ถูกจัดตั้งขึ้นโดยการโอน
วัฒนธรรมของเหลว (OD 600 นาโนเมตร = 1.0) ลงใน Petri
อาหารและฟักภายใต้เงื่อนไขที่คงที่เป็นเวลา 7 วัน.
เหล่านี้ SL-ไบโอฟิล์มผู้ใหญ่นั้นก็หดหายกลไก
ผ่านปิเปตซ้ำกับทางภูมิคุ้มกัน
ปิเปตจะทำลายชั้นของไบโอฟิล์มที่แนบมา
และ มวลรวมขนาดใหญ่ติดอยู่อย่างอิสระ นี้ตาม
ด้วยการโอนเงินลงในหลอดรูปกรวยและ vortexing อ่อนโยน
หดหายวัฒนธรรม SL-ฟิล์มแล้วโอน
กลับเข้ามาในจานวัฒนธรรมเดิมและที่เหลือในการฟักไข่
ในขณะที่การถ่ายภาพมีความปั่นป่วน collected.Physical
SL-ไบโอฟิล์มในการเติม
สายพันธุ์และวัฒนธรรมสื่อ
เอช volcanii สายพันธุ์ (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1: ตาราง S2)
มีให้โดย Thorsten Allers ของมหาวิทยาลัย
น็อตติงแฮม, สหราชอาณาจักรและเติบโตขึ้นในสื่อที่ดัดแปลงมาจากที่ก่อนหน้านี้
การศึกษา [47] กลางรวย (HV-YPC) มี 144 กรัม
โซเดียมคลอไรด์, 21 กรัม MgSO4 × 7H2O, 18 กรัม MgCl2 × 6H2O 4.2 กรัม
KCl, 12 มิลลิ Tris-HCl พีเอช 7.5, 3.125 มล. 1 แก้ปัญหา M CaCl2,
1.0 ml ติดตามการแก้ปัญหาองค์ประกอบ 5.0 กรัมสารสกัดจากยีสต์,
1.0 กรัมกรดซามิโนและเปปโตน 1.0 กรัมต่อลิตร HV-YPC
ใช้ในการไบโอฟิล์มวัฒนธรรม GFP สำหรับการย้อมสีเป็นกำไรต่อหุ้นยังมี
น้ำตาลกลูโคส 0.5%.
กลาง HV-Ca บรรจุ 144 กรัมโซเดียมคลอไรด์, 21 กรัม MgSO4 ×
7H2O, 18 กรัม MgCl2 × 6H2O 4.2 กรัม KCl, 12 mM Tris-HCl
ค่า pH 7.5 3.125 มล. 1 แก้ปัญหา M CaCl2 1.0 มลธาตุ
แก้ปัญหา 5.0 กรัมกรดซามิ, 0.125 มล 6.4 mg / ml
แก้ปัญหาวิตามินบีและ 0.125 มล 0.8 mg / แก้ปัญหาไบโอตินมิลลิลิตร
ต่อลิตร.
ฐาน-เกลือกลางอดอยาก (HV-อด) มี
ส่วนประกอบทั้งหมดใน HV-YPC อื่น ๆ นอกเหนือจากสารอาหารที่ซับซ้อน
(เช่นสารสกัดจากยีสต์, กรดซามิและเปปโตน) ของแข็ง
สื่อที่มี 18 กรัมของอาหารเลี้ยงเชื้อต่อลิตร เมื่อต้อง
ถูกจัดให้ uracil ที่ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔpyrE2) thymidine
และ hypoxanthine ที่ 40 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔhdrB), โพรไบโอ
ที่ 50 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (สายพันธุ์ΔtrpA) และ novobiocin ที่ 0.30 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร
สำหรับการเลือกยาปฏิชีวนะ .
การพัฒนา GFP-แสดง Haloferax volcanii
ความเครียด H1206
สอง H. volcanii uracil auxotrophic สายพันธุ์ได้รับการพัฒนา
สำหรับส่วนประกอบแสดงออก GFP และการถ่ายภาพมือถือโดย CLSM
และกล้องจุลทรรศน์ epifluorescence (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1:
ตาราง S2) H1206 ความเครียด (pJAM1020) ก็ขึ้นอยู่กับ
ตัวเลือกผ่านความต้านทาน novobiocin ใช้ก่อนหน้านี้
ได้รับการพัฒนาเวกเตอร์ [59] และสายพันธุ์ที่สอง H1206
(pSC409GFP) ก็ขึ้นอยู่กับยีน pyrE2 และ uracil
autotrophy [44,46,47] พลาสมิด pSC409GFP ถูกสร้างขึ้น
โดยขยายภูมิภาคจาก pJAM1020
มีโปรโมเตอร์แดงขยับ GFP และ P2 เป็นส่วนประกอบสำหรับ
การแสดงออกในรูป haloarchaeal [59] และ
ใส่นี้สร้างเป็นรถรับส่งเวกเตอร์ pTA409
[101] (ดูแฟ้มเพิ่มเติม 1 ตาราง S2 และ S3 ) พลาสมิดแต่ละ
ก็กลายเป็นสายพันธุ์ H1206 (ΔpyrE2Δmrr)
โดยใช้วิธี PEG-based เช่นการพัฒนาก่อนหน้านี้
[49102103] และ transformant ที่ได้รับการคัดเลือกใน Hv-
Ca กลางโดยไม่ต้อง uracil สำหรับ H1206 (pSC409GFP) หรือ
ที่มี novobiocin สำหรับ H1206 (pJAM1020) H. volcanii
H1206 เป็นเหมือน H26 อื่น ๆ นอกเหนือจากการลบเพิ่มเติม
ของยีน MRR ซึ่ง encodes endonuclease ข้อ จำกัด
ที่แข็งกระด้าง methylated ดีเอ็นเอต่างประเทศช่วยให้การเปลี่ยนแปลง
ได้โดยไม่ต้องผ่านทาง Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [46] จลนพลศาสตร์การเจริญเติบโตของแต่ละสายพันธุ์ GFP ในของเหลว
กลาง HV-YPC ถูกวัดโดยความหนาแน่นของแสงและ
มีการเปลี่ยนแปลงไปจากสายพันธุ์ของพ่อแม่.
Biofilm ระบบการเจริญเติบโตของ
สื่ออธิบายไว้ข้างต้นได้รับการเตรียมความพร้อมและใช้ในการ
เพาะปลูก H. volcanii ไบโอฟิล์มโดยใช้การทดลอง
วิธีการเจริญเติบโตอธิบายไว้ด้านล่าง ไบโอฟิล์มทั้งหมดถูกบ่ม
ที่อุณหภูมิ 42 ° C ยกเว้นที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม
อาณานิคมไบโอฟิล์มดังแสดงในรูปที่ 1B ถูกจัดทำขึ้นใน
13 มมฟิลเตอร์โพลีคาร์บอเนต (0.2 ไมครอนขนาดรูขุมขน, Sigma,
เซนต์หลุยส์, MO, Z365041) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 7,23] ปรับลด
เอช วัฒนธรรม volcanii (OD 600 นาโนเมตร = 0.1) ถูกย้าย
ลงบนพื้นผิวของตัวกรองผ่านการฆ่าเชื้อก่อนหน้านี้วางโดยตรง
บนพื้นผิวของสื่อที่เป็นของแข็งที่มีคีมหมัน.
หลังจากอาหารเลี้ยงเชื้อทะลุตัวกรองและระเหย
แผ่นถูกคว่ำและบ่ม กรองถูก
ถ่ายโอนไปยังแผ่นสดภายใต้เงื่อนไขที่ผ่านการฆ่าเชื้อทุก
48 ชั่วโมงในช่วงระยะเวลาการเจริญเติบโต.
ของเหลวคงไบโอฟิล์ม
SL-ไบโอฟิล์มได้รับการจัดตั้งขึ้นโดย aliquoting เชื้อเจริญเติบโตของ
กลางเป็นแผ่นหกดีและจานเลี้ยงเชื้อ (เช่นใน
รูปที่ 1C, 2K และ 4 และ ดูแฟ้มเพิ่มเติม 3, 4, 5, 6 และ
7: ภาพยนตร์ 2-6) หรือภาพนิ่งห้อง (Lab เต็กครั้งที่สอง 0.7 cm2
พื้นที่การเจริญเติบโตต่อกันในขณะที่แผงด้านซ้ายบนของรูป 1C
และรูปที่ 2I, J ) แก้ว borosilicate คูปอง (Biosurfaces
เทคโนโลยีคอร์ปอเรชั่น Bozeman, MT, RD 128-GL) หรือ
ชิ้นส่วนของ coverglass ถูกวางไว้ภายในแผ่นหกดี (เช่น
ในรูปที่ 1C) เพื่อให้พื้นผิวการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์มที่สามารถ
มองเห็นได้โดยตรงผ่านกล้องจุลทรรศน์ .
การย้อมสีและการจัดเตรียม Biofilm กล้องจุลทรรศน์
คุณสมบัติและพารามิเตอร์การทดลองใช้สำหรับทุก
สีย้อมในการศึกษานี้ได้สรุปไว้ในแฟ้มเพิ่มเติม 1:
ตาราง S1 ความเข้มข้นสุดท้ายของการแก้ปัญหาการย้อมสีแต่ละ
ถูกปรับให้เหมาะสมขึ้นอยู่กับอย่างใดอย่างหนึ่งของผู้ผลิต
โปรโตคอลหรือศึกษาก่อนหน้านี้ การย้อมสี CR ถูกดำเนินการ
โดยใช้วิธีการ CR ด่าง [104,105] ไบโอฟิล์มได้รับการ
ย้อมสีและเตรียมพร้อมสำหรับการใช้กล้องจุลทรรศน์ตามที่อธิบายไว้ข้างล่างนี้
สำหรับวิธีการเจริญเติบโตของแต่ละ.
อาณานิคมไบโอฟิล์ม
ไบโอฟิล์มอาณานิคมผู้ใหญ่มีการย้อมโดยการโอน
การแก้ปัญหาการย้อมสีใน HV-อดกลางตรงด้านบนของ
ไบโอฟิล์มอาณานิคมและการบ่มที่อุณหภูมิห้อง
เป็นเวลา 60 นาที ส่วนครอสของไบโอฟิล์มอาณานิคมเปื้อน (เช่นรูปที่ 1B) ได้รับการ Cryo-ประมวลผลโดยการแช่แข็งอย่างรวดเร็ว
บนน้ำแข็งแห้งและตัดข้ามที่ใช้ Leica CM1850
Cryostat microtome ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] จากนั้น
ตัดขวาง 5 ไมครอนถูกวางลงบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์
และมองเห็นได้ทันที.
แก้วพื้นผิวภายใน SL-ไบโอฟิล์ม
ย้อมสีในคูปองแก้วและ coverglass ได้ดำเนินการโดย
การเอาสารตั้งต้นการเจริญเติบโตจากระบบการเจริญเติบโต /
กลางตามด้วยตำแหน่งในการฆ่าเชื้อสด 60 มม Petri
อาหาร การแก้ปัญหาการย้อมสี HV-อดจากนั้นก็ค่อยๆ
โอน (ทันทีก่อนที่วัฒนธรรมที่เหลืออยู่
กลางบนพื้นผิวของกระจกระเหย) กับพื้นผิว
ของพื้นผิว (เช่นคูปองแก้ว), สมบูรณ์ครอบคลุม
พื้นผิว ปริมาณของการแก้ปัญหาการย้อมสีนี้ยังคงอยู่บน
พื้นผิวที่ผ่านแรงตึงผิวในระหว่างการย้อมสี 60 นาที
ระยะเวลาที่อุณหภูมิห้องในที่มืด การแก้ปัญหาการย้อมสี
จากนั้นก็ลบออกอย่างระมัดระวังและพื้นผิวที่ถูกล้าง
ครั้งเดียวกับ HV-อด (ปริมาณเดียวกันที่ใช้สำหรับการแก้ปัญหาการย้อมสี).
พื้นผิวที่ถูกนำมาวางไว้ในจานเลี้ยงเชื้อใหม่และ
สดกลาง HV-อดถูกเพิ่มเข้ามาจนพื้นผิวของ
พื้นผิวการเจริญเติบโตเป็นที่จมอยู่ใต้น้ำประมาณ 5 มม.
หอการค้าสไลด์
ไบโอฟิล์มสไลด์ปลูกในห้องมีการย้อมโดยการลบ
กลางปรับอากาศจากบ่อผ่านทะเยอทะยานอ่อนโยน
ตามด้วยนอกเหนือจาก HV-อดแก้ปัญหาการย้อมสี
(ปริมาณเดียวกันเป็นสื่อกลางที่ใช้ในการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์มเช่น 500 ไมโครลิตร)
เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้องในที่มืด การแก้ปัญหาการย้อมสี
จะถูกลบออกแล้วผิวได้รับการซัก
ครั้งเดียวกับการบวกและลบตามมาอีก
ปริมาณที่เท่ากันของ HV-อดอยากและความสดใหม่ HV-อด
ถูกเพิ่มเข้ามาตามด้วยการสร้างภาพโดยตรง.
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและการถ่ายภาพ
กล้องคอนโฟคอล
ตรง Leica Microsystems (Wetzlar, เยอรมนี) TCS
SP5 เลเซอร์กล้องจุลทรรศน์ confocal ถูกนำมาใช้ (สำหรับข้อมูลที่
แสดงในรูปที่ 1D-I) กับ 63 ×น้ำแช่เลนส์
วางโดยตรงเป็นของเหลวเป็นกลุ่มไบโอฟิล์มดังกล่าวข้างต้นที่ปลูกใน
คูปองแก้วหรือ coverglass ภาพที่ได้มา
ผ่าน Leica Application Suite ขั้นสูงเรืองแสง
แพลตฟอร์มซอฟต์แวร์ ไทปันสามมิติ
ของชิ้นระนาบโฟกัสถูกสร้างและวิเคราะห์
โดยใช้ IMARIS จาก bitplane (ซูริค, สวิตเซอร์;
รูป 1D-H) หรือฟิจิ [106] ดิสก์ปั่น Andor confocal
ระบบด้วยกล้องจุลทรรศน์ Nikon คราส Ti (ข้อมูล
แสดงในรูปที่ 2C, D, E, M) และ Nikon A1R ผี
Confocal กล้องจุลทรรศน์ (แฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S2) ได้รับ
นอกจากนี้ยังใช้ในการไบโอฟิล์มสดภาพสไลด์ภายในห้อง
กล้องจุลทรรศน์สองมิติ
ภาพจะถูกเก็บรวบรวมโดยใช้ตรง Nikon คราส
E800 กล้องจุลทรรศน์ epifluorescent ยังมีการแช่น้ำ
เลนส์วางโดยตรงด้านบนแผ่นชีวะเลี้ยง สำหรับไบโอฟิล์ม
สไลด์ปลูกในห้องที่พวกเขาได้ถูกเก็บรวบรวม
ด้วยฤๅษี Nikon คราส TE300 กับจุด
กล้องไมโครสโคปแบบดิจิตอล (แสดงในรูปที่ 1A, B, 2B,
FH และ 3A-D และแฟ้มเพิ่มเติม 1: ตัวเลข S1, S2 S3
และ แฟ้มเพิ่มเติมที่ 2:. ภาพยนตร์ 1)
การถ่ายภาพด้วยตาเปล่า
อาณานิคมและ SL-ไบโอฟิล์มสไลด์ในห้องถูกถ่ายภาพ
โดยใช้การค้นพบ Zeiss V20 เรืองแสงสเตอริโอผ่า
กล้องจุลทรรศน์ด้วยกล้อง Zeiss AxioCam (ตัวเลข 1C และ
2A, อิลลินอยส์และแฟ้มเพิ่มเติม 1: รูปที่ S1) รูปถ่ายของสด
SL-ไบโอฟิล์มในการศึกษาตามเวลาที่ถูกถ่ายโดยใช้ดิจิตอล
เลนส์เดี่ยวและกล้องสะท้อนเลนส์มาโคร, แหล่งกำเนิดแสง LED
และ intervalometer ติดตั้งภายในศูนย์บ่มเพาะ (รูปที่ 4
และแฟ้มเพิ่มเติม 3, 4, 5, 6 และ 7: . ภาพยนตร์ 2-6)
รายละเอียดการถ่ายภาพเพิ่มเติม
ไม่มีสัญญาณ autofluorescence ถูกตรวจพบจากเอช volcanii
เซลล์หรือโครงสร้างไบโอฟิล์มในทุกช่องทางที่ใช้ในการกระตุ้น
การศึกษานี้ (ความยาวคลื่นกระตุ้นใช้สำหรับย้อมแต่ละดู
แฟ้มเพิ่มเติม 1: ตาราง S1) รูปภาพที่เก็บรวบรวมด้วยสีดำ
กล้องดิจิตอลและสีขาวถูกหลอกสีกับ
แต่ละสังเกตสัญญาณการปล่อยเรืองแสง.
การวัดลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์และโครงสร้างไบโอฟิล์ม
ความยาวของเซลล์และขนาดของโครงสร้างไบโอฟิล์มได้รับการ
วัดโดยใช้ฟิจิเป็นที่พัฒนาโดยสถาบันแห่งชาติ
ของสุขภาพ [106] การวิเคราะห์ความยาวของเซลล์ planktonic
และประชากรเซลล์ไบโอฟิล์มในรูปที่ 3E รวม 2,000
เซลล์แต่ละคนมาจากสามแยกภาพที่เก็บมาจาก
สามซ้ำอิสระภายใต้เงื่อนไขที่เหมือนกัน.
ขั้นตอนกลางชี้แจง (OD 600 นาโนเมตร = 0.4-0.5) ทำซ้ำ
วัฒนธรรม planktonic ความเครียด H1206 ( pJAM1020) ได้รับการ
ถ่ายภาพเจือจาง (เพื่อ OD 600 นาโนเมตร = 0.1) ในสื่อสด
(HV-YPC กลูโคส + 0.5%) และ 500 ไมโครลิตร aliquots ถูกย้าย
ที่จะทำซ้ำบ่อห้องสไลด์ วัดถูก
สร้างขึ้นโดยใช้อนุภาควิเคราะห์การทำงานของฟิจิ [106].
การเตรียมการสำหรับการศึกษาไทม์ด้วยตาเปล่าและ
การชักนำของการเคลื่อนไหวทางสังคม
ขัดข้องและการปฏิรูป
SL-ไบโอฟิล์มที่แสดงในรูปที่ 4 แฟ้มเพิ่มเติมที่ 3: ภาพยนตร์ 2
และแฟ้มเพิ่มเติม 4: ภาพยนตร์ 3 ที่ถูกจัดตั้งขึ้นโดยการโอน
วัฒนธรรมของเหลว (OD 600 นาโนเมตร = 1.0) ลงใน Petri
อาหารและฟักภายใต้เงื่อนไขที่คงที่เป็นเวลา 7 วัน.
เหล่านี้ SL-ไบโอฟิล์มผู้ใหญ่นั้นก็หดหายกลไก
ผ่านปิเปตซ้ำกับทางภูมิคุ้มกัน
ปิเปตจะทำลายชั้นของไบโอฟิล์มที่แนบมา
และ มวลรวมขนาดใหญ่ติดอยู่อย่างอิสระ นี้ตาม
ด้วยการโอนเงินลงในหลอดรูปกรวยและ vortexing อ่อนโยน
หดหายวัฒนธรรม SL-ฟิล์มแล้วโอน
กลับเข้ามาในจานวัฒนธรรมเดิมและที่เหลือในการฟักไข่
ในขณะที่การถ่ายภาพมีความปั่นป่วน collected.Physical
SL-ไบโอฟิล์มในการเติม
การแปล กรุณารอสักครู่..
วิธี
สื่อวัฒนธรรม h volcanii สายพันธุ์และสายพันธุ์ ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S1 )
มีให้โดย Thorsten ออลเลิร์สแห่งมหาวิทยาลัย
น็อตติงแฮม , UK , และเติบโตในสื่อที่ดัดแปลงจากการศึกษาก่อนหน้า
[ 47 ] รวยปานกลาง ( HV ypc ) มีขนาด 144 g
21 กรัม MgSO4 ใ× 7h2o 18 กรัม MgCl2 × 6h2o KCl 4.2 g
12 มม. หรือกรดไฮโดรคลอริก pH 7.5 , 31.25 มิลลิลิตร 1 M ผลิตโซลูชั่น
1.0 มิลลิลิตรสารละลายธาตุ 50 กรัมยีสต์สกัด กรด casamino
1.0 กรัม ตามลำดับ และ 1.0 กรัมต่อลิตร HV ypc
ใช้ GFP ไบโอฟิล์มวัฒนธรรมสำหรับ EPS staining ยังมีกลูโคส 0.5 %
.
HV CA กลางที่มีอยู่ 144 g NaCl , 21 กรัม MgSO4 ใ×
7h2o 18 กรัม MgCl2 × 6h2o KCl 4.2 กรัม 12 มม. หรือ HCl
pH 7.5 , 31.25 มิลลิลิตร 1 M ผลิตโซลูชั่น 1.0 มล. ธาตุ
โซลูชั่น 5.0 กรัมกรด casamino 0.125 มล. 6.4 มก. / มล.
วิตามินบีโซลูชั่นและ 0.125 มล. 08 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรต่อลิตร biotin โซลูชั่น
.
แรกเริ่ม เกลือการอดปานกลาง ( HV อดอาหาร ) ที่มีอยู่
ส่วนประกอบทั้งหมดใน HV ypc นอกจากซับซ้อนรัง
( เช่น สารสกัดจากยีสต์และกรด casamino extract ) สื่อบรรจุ 18 กรัมของแข็ง
วุ้นต่อลิตร เมื่อต้องการ
ยูราซิลให้ที่ 50 μ g / ml ( Δ pyre2 สายพันธุ์ ) , เพียง และไฮโปแซนทีนที่ 40 μ
g / ml ( Δทริป
hdrb สายพันธุ์ )50 μ g / ml ( Δ trpa สายพันธุ์ ) และโนโวไบโอซินที่ 0.30 μ g / ml
เลือกยาปฏิชีวนะ การพัฒนาของ GFP แสดง haloferax volcanii
2 H h1206 เมื่อย volcanii ยูราซิล auxotrophic สายพันธุ์ที่พัฒนาสำหรับการแสดงออกของ GFP
และภาพในเซลล์ โดย clsm
epifluorescence และกล้องจุลทรรศน์ ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1
ตาราง S1 ) สายพันธุ์ h1206 ( pjam1020 ) ขึ้นอยู่กับ
เลือกผ่านโนโวไบโอซินต้านทานการใช้ก่อนหน้านี้
พัฒนาเวกเตอร์ [ 59 ] , และสองสายพันธุ์ h1206
( psc409gfp ) บนพื้นฐานของยีนและ pyre2 ยูราซิล
ออโตทรอพ [ 44,46,47 ] พลาสมิด psc409gfp ถูกสร้างขึ้นโดยขยายพื้นที่จาก pjam1020
ที่มีสีแดงขยับ GFP และผู้ก่อการ P2 สำหรับพฤติกรรมการแสดงออกใน haloarchaeal
[ ]
59 ชนิด และใส่นี้สร้างเป็นรถเวกเตอร์ pta409
[ 101 ] ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S2 และ S3 ) แต่ละสายพันธุ์
กลายเป็นความเครียด h1206 ( Δ pyre2 Δ MRR )
ใช้หมุดตามวิธีที่เคยพัฒนา 49102103
[ ] , และพลาสมิดถูกเลือกใน HV -
CA กลางโดยไม่ Name สำหรับ h1206 ( psc409gfp ) หรือ
ที่มีโนโวไบโอซินสำหรับ h1206 ( pjam1020 ) volcanii
hh1206 เป็นเหมือน h26 นอกเหนือจาก
ลบเพิ่มเติมของเป็นยีนที่เข้ารหัสเป็นดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ
คลีฟส์ต่างประเทศ methylated ให้เปลี่ยนแปลง
โดยไม่ผ่านการเชื้อ Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [ 46 ] จลนศาสตร์การเจริญเติบโตของ GFP ในแต่ละสายพันธุ์ของเหลว
HV ypc กลางวัดความหนาแน่นของแสงและ
อยู่ไม่เปลี่ยนแปลงจากสายพันธุ์พ่อแม่
ระบบการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์ม
สื่อที่อธิบายข้างต้นถูกเตรียมและใช้
ฝึกฝน . volcanii ไบโอฟิล์มใช้วิธีการทดลอง
การเจริญเติบโตที่อธิบายไว้ด้านล่าง ทั้งหมดอยู่ที่ 42 องศาไบโอฟิล์มบ่ม
c เว้นแต่ที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น ไบโอฟิล์ม
อาณานิคมอาณานิคมไบโอฟิล์ม ดังแสดงในรูปที่ 1 บีเตรียมบน
13 มม. โพลีคาร์บอเนตกรอง ( 0.2 - μ M รูขุมขนขนาด , Sigma ,
เซนต์ หลุยส์ โม z365041 ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 7
สื่อวัฒนธรรม h volcanii สายพันธุ์และสายพันธุ์ ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S1 )
มีให้โดย Thorsten ออลเลิร์สแห่งมหาวิทยาลัย
น็อตติงแฮม , UK , และเติบโตในสื่อที่ดัดแปลงจากการศึกษาก่อนหน้า
[ 47 ] รวยปานกลาง ( HV ypc ) มีขนาด 144 g
21 กรัม MgSO4 ใ× 7h2o 18 กรัม MgCl2 × 6h2o KCl 4.2 g
12 มม. หรือกรดไฮโดรคลอริก pH 7.5 , 31.25 มิลลิลิตร 1 M ผลิตโซลูชั่น
1.0 มิลลิลิตรสารละลายธาตุ 50 กรัมยีสต์สกัด กรด casamino
1.0 กรัม ตามลำดับ และ 1.0 กรัมต่อลิตร HV ypc
ใช้ GFP ไบโอฟิล์มวัฒนธรรมสำหรับ EPS staining ยังมีกลูโคส 0.5 %
.
HV CA กลางที่มีอยู่ 144 g NaCl , 21 กรัม MgSO4 ใ×
7h2o 18 กรัม MgCl2 × 6h2o KCl 4.2 กรัม 12 มม. หรือ HCl
pH 7.5 , 31.25 มิลลิลิตร 1 M ผลิตโซลูชั่น 1.0 มล. ธาตุ
โซลูชั่น 5.0 กรัมกรด casamino 0.125 มล. 6.4 มก. / มล.
วิตามินบีโซลูชั่นและ 0.125 มล. 08 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรต่อลิตร biotin โซลูชั่น
.
แรกเริ่ม เกลือการอดปานกลาง ( HV อดอาหาร ) ที่มีอยู่
ส่วนประกอบทั้งหมดใน HV ypc นอกจากซับซ้อนรัง
( เช่น สารสกัดจากยีสต์และกรด casamino extract ) สื่อบรรจุ 18 กรัมของแข็ง
วุ้นต่อลิตร เมื่อต้องการ
ยูราซิลให้ที่ 50 μ g / ml ( Δ pyre2 สายพันธุ์ ) , เพียง และไฮโปแซนทีนที่ 40 μ
g / ml ( Δทริป
hdrb สายพันธุ์ )50 μ g / ml ( Δ trpa สายพันธุ์ ) และโนโวไบโอซินที่ 0.30 μ g / ml
เลือกยาปฏิชีวนะ การพัฒนาของ GFP แสดง haloferax volcanii
2 H h1206 เมื่อย volcanii ยูราซิล auxotrophic สายพันธุ์ที่พัฒนาสำหรับการแสดงออกของ GFP
และภาพในเซลล์ โดย clsm
epifluorescence และกล้องจุลทรรศน์ ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1
ตาราง S1 ) สายพันธุ์ h1206 ( pjam1020 ) ขึ้นอยู่กับ
เลือกผ่านโนโวไบโอซินต้านทานการใช้ก่อนหน้านี้
พัฒนาเวกเตอร์ [ 59 ] , และสองสายพันธุ์ h1206
( psc409gfp ) บนพื้นฐานของยีนและ pyre2 ยูราซิล
ออโตทรอพ [ 44,46,47 ] พลาสมิด psc409gfp ถูกสร้างขึ้นโดยขยายพื้นที่จาก pjam1020
ที่มีสีแดงขยับ GFP และผู้ก่อการ P2 สำหรับพฤติกรรมการแสดงออกใน haloarchaeal
[ ]
59 ชนิด และใส่นี้สร้างเป็นรถเวกเตอร์ pta409
[ 101 ] ( ดูเพิ่มเติมไฟล์ 1 ตาราง S2 และ S3 ) แต่ละสายพันธุ์
กลายเป็นความเครียด h1206 ( Δ pyre2 Δ MRR )
ใช้หมุดตามวิธีที่เคยพัฒนา 49102103
[ ] , และพลาสมิดถูกเลือกใน HV -
CA กลางโดยไม่ Name สำหรับ h1206 ( psc409gfp ) หรือ
ที่มีโนโวไบโอซินสำหรับ h1206 ( pjam1020 ) volcanii
hh1206 เป็นเหมือน h26 นอกเหนือจาก
ลบเพิ่มเติมของเป็นยีนที่เข้ารหัสเป็นดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ
คลีฟส์ต่างประเทศ methylated ให้เปลี่ยนแปลง
โดยไม่ผ่านการเชื้อ Escherichia coli เขื่อน
กลายพันธุ์ [ 46 ] จลนศาสตร์การเจริญเติบโตของ GFP ในแต่ละสายพันธุ์ของเหลว
HV ypc กลางวัดความหนาแน่นของแสงและ
อยู่ไม่เปลี่ยนแปลงจากสายพันธุ์พ่อแม่
ระบบการเจริญเติบโตของไบโอฟิล์ม
สื่อที่อธิบายข้างต้นถูกเตรียมและใช้
ฝึกฝน . volcanii ไบโอฟิล์มใช้วิธีการทดลอง
การเจริญเติบโตที่อธิบายไว้ด้านล่าง ทั้งหมดอยู่ที่ 42 องศาไบโอฟิล์มบ่ม
c เว้นแต่ที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น ไบโอฟิล์ม
อาณานิคมอาณานิคมไบโอฟิล์ม ดังแสดงในรูปที่ 1 บีเตรียมบน
13 มม. โพลีคาร์บอเนตกรอง ( 0.2 - μ M รูขุมขนขนาด , Sigma ,
เซนต์ หลุยส์ โม z365041 ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 7
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Thirty-five years of journal of economet
- Whether you think I know that I love you
- At the end
- recycled paper is mademout of old bottle
- และอีกอย่างฉันคิดว่าเขาคงต้องตรวจสอบอะไร
- These disadvantages are the reason we us
- Write about your decision to come to Aus
- the traditional thai new year
- ได้ประโยชน์อะไรจากข้อมูลนี้
- Radio Description
- ต้นเฟิน
- ทำอะไร
- Where did you spend your vocation
- Toujours en attente pour elle de revenir
- ลองมาประเทศไทย
- ฉันมีความหวัง และอยากเข้าร่วมโครง
- I like
- คุณเคยมาที่ประเทศไทยหรือไม่
- โชคดี
- 台湾相思树
- Then study what?
- ฉันจะทำในสิ่งที่ตนเองชอบ
- มีความประณีต
- ฝ่ายบัญชี
