[0054] In some further embodiments,

[0054] In some further embodiments, a human tear ไลโปคาลิน มิวทีน according to the การเปิดเผย ประกอบรวมด้วย one หรือ more mutated amino acid residues at any one of the amino acid sequence positions 79, 92 and 105 of the linear โพลีเปปไทด์ sequence of mature human tear ไลโปคาลิน. For example, a human tear ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may รวมถึง the following amino acid substitutions:
As defined above, a human tear ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย รวมถึง at least one amino acid substitution, which is located at a sequence position of the positions 26,
27, 28, 30, 31, 33, 34, 57, 61, 80, 83, 104-106 and 108 of the linear โพลีเปปไทด์ sequence of the mature human tear ไลโปคาลิน (SEQ ID NO: 1 ). In some embodiments a มิวทีน of the การเปิดเผย รวมถึง two หรือ more, such as 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 หรือ 16 amino acid substitutions of these sequence positions of the mature human tear ไลโปคาลิน. In one particular embodiment, the มิวทีน has a mutated amino acid เรซิดิว at each of the sequence positions 26, 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 and 108 of the linear โพลีเปปไทด์ sequence of the ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย (see, for example, Figure 10 and Figure14).

[0056] ในบางรุรุ, a ไลโปคาลินนุนุ มิวทีน of the การเปิดเผย may also รวมถึง with respect to the amino acid sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย one หรือ more, ที่รวมถึง at least two, at least three หรือ at least four การแทนที่ อะมิโนแอซิด of native amino acid เรซิดิว by ซิสเทอีน เรซิดิว at any of positions within the loop บริเวณs of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย. ในบางรุรุ, a มิวทีน according to the การเปิดเผย รวมถึง an amino acid substitution of a native amino acid by a ซิสเทอีน เรซิดิว at positions 28 หรือ 105 with respect to the amino acid sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย.

[0057] In the residual บริเวณ, i.e. the บริเวณ differing from sequence positions 26-34,

56-58, 80, 83, 104-106 and 108, a ไลโปคาลินนุนุ มิวทีน of the การเปิดเผย may รวมถึง the wild type (natural) amino acid sequence outside the mutated amino acid sequence positions. ในบางรุรุ, a ไลโปคาลินนุนุ มิวทีน according to the การเปิดเผย may also carry one หรือ more amino acid mutations at a sequence position/ positions as long as such a mutation does, at least essentially not hamper หรือ not interfere with the binding activity and the folding of the มิวทีน. Such mutations can be accomplished very easily on DNA level using established standard methods. Illustrative examples of alterations of the amino acid sequence are insertions หรือ deletions as well as การแทนที่ อะมิโนแอซิด. Such substitutions may be conservative, i.e. an amino acid เรซิดิว is replaced with an amino acid เรซิดิว of chemically similar poperties, in particular with regard to polarity as well as size. Examples of conservative substitutions are the replacements among the members of the following groups:
1) alanine, serine, and threonine; 2) aspartic acid and glutamic acid; 3) asparagine and glutamine; 4) arginine and lysine; 5) isoleucine, leucine, methionine, and valine; and 6) phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. On the other hand, it is also possible to introduce non-conservative alterations in the amino acid sequence. In addition, instead of replacing single amino acid เรซิดิว, it is also possible to either insert หรือ delete one หรือ more continuous amino acids of the primary structure of tear ไลโปคาลิน as long as these deletions หรือ insertion result in a stable folded/functional มิวทีน (see for example, the experimental section in which มิวทีน with truncated N- and C-terminus are generated).
[0058] Such modifications of the amino acid sequence รวมถึง directed mutagenesis of single amino acid positions in order to simplify sub-cloning of the mutated ไลโปคาลิน gene หรือ its parts by incorporating cleavage ตำแหน่ง for certain restriction enzymes. In addition, these mutations can also be incorporated to further improve the แอฟฟินิตี้ of a ไลโปคาลิน มิวทีน for a given target. Furthermore, mutations can be introduced in order to modulate certain characteristics of the มิวทีน such as to improve folding stability, serum stability, protein resistance หรือ water solubility หรือ to reduce aggregation tendency, if necessary. For example, naturally occurring ซิสเทอีน เรซิดิว may be mutated to other amino acids to prevent disulfide bond formation. It is also possible to deliberately mutate other amino acid sequence position to ซิสเทอีน in order to introduce new reactive groups, for example for the conjugation to other compounds, such as polyethylene glycol (PEG), hydroxyethyl starch (HES), biotin, peptides หรือ proteins, หรือ for the formation of non-naturally occurring disulfide linkages. Exemplary possibilities of such a mutation to introduce a ซิสเทอีน เรซิดิว into the amino acid sequence of a ไลโปคาลินนุนุ มิวทีน รวมถึง the substitutions Thr 40--> Cys, Glu 73--> Cys, Arg 90~ Cys, Asp 95--> Cys, and Glu 131--> Cys. The generated thiol moiety at the side of any of the amino acid positions 40, 73, 90, 95 and/or 131 may be used to PEGylate หรือ HESylate the มิวทีน, for example, in order to increase the serum half-life of a respective tear ไลโปคาลิน มิวทีน.

[0059] The present การเปิดเผย also encompasses มิวทีน as defined above, in which the first four N-terminal amino acid เรซิดิว of the sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย (His-His-Leu-Leu; positions 1-4) and/or the last two C-terminal amino acid เรซิดิว (Ser at position 157 and Asp at positions 158) of the sequence of ไลโปคาลิน น้ำตามนุษย์ เต็มวัย have been deleted (see Figure 10 and Figure 14). Another possible mutation of the wild type sequence is to change the amino acid sequence at sequence positions 5 to 7 (Ala Ser Asp) to Gly Gly Asp as described in PCT publication WO 2005/019256.

[0060] The human tear ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may รวมถึง, consist essentially of หรือ consist of any one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3-28,
62-71 and 82 หรือ a :ชิ้นส่วนย่อย หรือ รูปแปรผัน thereof.


[0061] The term "ชิ้นส่วนย่อย" ตามที่ใช้ในที่นี้ in connection with the ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย relates to proteins หรือ peptides derived from full-length mature ไลโปคาลิน that are N-terminally and/or C-terminally shortened, i.e. lacking at least one of the N-terminal and/or C-terminal amino acids. Such :ชิ้นส่วนย่อยs may รวมถึง at least 10, more such as 20 หรือ 30 or
more consecutive amino acids of the primary sequence of the mature ไลโปคาลิน and are usually detectable in an immunoassay of the mature ไลโปคาลิน.

[0062] The term "รูปแปรผัน" as used in the present การเปิดเผย relates to derivatives of a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย that รวมถึง modifications of the amino acid sequence, for example by substitution, deletion, insertion หรือ chemical modification. Such modifications do ในบางรุรุ not reduce the functionality of the มิวทีน. For example, to generate such รูปแปรผัน, one หรือ more amino acids of a มิวทีน of the การเปิดเผย can be replaced by their respective D-stereoisomers หรือ by amino acids other than the naturally occurring 20 amino acids, such as, e.g. ornithine, hydroxyproline, citrulline, homoserine, hydroxylysine, norvaline. However, such substitutions may also be conservative, i.e. an amino acid เรซิดิว is replaced with a chemically similar amino acid เรซิดิว. Examples of conservative substitutions are the replacements among the members of the following groups: 1) alanine, serine, and threonine; 2) aspartic acid and glutamic acid; 3) asparagine and glutamine; 4) arginine and lysine; 5) isoleucine, leucine, methionine, and valine; and 6) phenylalanine, tyrosine, and tryptophan.

[0063] A ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may exist as a monomeric protein. ในบางรุรุ a ไลโปคาลิน มิวทีน according to the การเปิดเผย may be able to spontaneously dimerise หรือ oligomerise. The use of ไลโปคาลิน มิวทีน that form stable monomers may be advantageous in some applications, e.g. because of faster diffusion and better tissue penetration. In other embodiments the use of a ไลโปคาลิน มิวทีน that spontaneously forms stable homodimers หรือ multimers may be advantageous, since such multimers can provide (further) increased แอฟฟินิตี้ and/or avidity to a given target. Furthermore, oligomeric forms of the ไลโปคาลิน มิวทีน may have slower dissociation rates หรือ prolonged serum half-life. If dimerisation หรือ multimerisation of มิวทีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

[0054] ใน embodiments บางเพิ่มเติม การมิวทีนไลโปคาลินน้ำตามนุษย์ตามการเปิดเผยประกอบรวมด้วยหนึ่งหรือมากกลายตกกรดอะมิโนที่มีกรดอะมิโนลำดับตำแหน่ง 79, 92 และ 105 ลำดับเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์ผู้ใหญ่ ตัวอย่าง มิวทีนไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เป็นของการเปิดเผยอาจรวมถึงแทนกรดอะมิโนดังต่อไปนี้: ตามที่กำหนดไว้ข้างต้น มนุษย์ฉีกมิวทีนไลโปคาลินรวมถึงการเปิดเผยอย่างน้อยหนึ่งของอะมิโนทดแทนกรด ซึ่งตั้งอยู่ที่ตำแหน่งลำดับของตำแหน่ง 2627, 28, 30, 31, 33, 34, 57, 61, 80, 83, 104-106 และ 108 ลำดับเชิงเส้นโพลีเปปไทด์มนุษย์ผู้ใหญ่ฉีกไลโปคาลิน (เลขลำดับรหัส: 1) ในบาง embodiments เป็นมิวทีนหรือการเปิดเผยรวมถึงสองที่เพิ่มเติมของ 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 หรือ 16 กรดอะมิโนทดแทนตำแหน่งลำดับเหล่านี้ของมนุษย์ผู้ใหญ่ฉีกไลโปคาลิน ในหนึ่งลื่นเฉพาะ มิวทีนมีเรซิดิวเป็นกรดอะมิโนกลายในแต่ละลำดับตำแหน่ง 26, 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 และ 108 ลำดับเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ของเต็มวัยน้ำตามนุษย์ของไลโปคาลิน (ดู เช่น Figure14 และรูปที่ 10)ในบางรุรุ [0056] มิวทีนไลโปคาลินนุนุของการเปิดเผยอาจยังรวมถึงกับลำดับกรดอะมิโนไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยหนึ่งหรือมากกว่า น้อยสองที่รวมถึง อะมิโนแอซิดการแทนที่น้อยสามหรือสี่น้อยของเรซิดิวเป็นกรดอะมิโนโดยเรซิดิวซิสเทอีนที่มีตำแหน่งภายใน บริเวณs วนของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย ในบางรุรุ มิวทีนตามรวมถึงการเปิดเผยทดแทนกรดอะมิโนเป็นกรดอะมิโนแบบดั้งเดิมโดยเรซิดิวซิสเทอีนในตำแหน่ง 28 หรือ 105 กับลำดับกรดอะมิโนของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย[0057] ในบริเวณส่วนที่เหลือ เช่นบริเวณที่แตกต่างกันจากลำดับตำแหน่ง 26-3456-58, 80, 83, 104-106 และ 108 มิวทีนไลโปคาลินนุนุของการเปิดเผยอาจรวมถึงลำดับกรดอะมิโนชนิดป่า (ธรรมชาติ) นอกตำแหน่งลำดับกรดอะมิโนกลายได้ ในบางรุรุ มิวทีนไลโปคาลินนุนุตามการเปิดเผยอาจยังมีหนึ่งหรือมากกว่ากรดอะมิโน mutations ที่ลำดับตำแหน่ง / ตำแหน่งตราบใดที่ไม่กลายพันธุ์ดังกล่าว ไม่น้อยเป็นตะกร้าหรือไม่รบกวนกิจกรรมผูกและพับมิวทีน กลายพันธุ์ดังกล่าวสามารถมาได้ง่ายมากในระดับดีเอ็นเอโดยใช้วิธีการมาตรฐานที่กำหนดขึ้น แสดงตัวอย่างของการเปลี่ยนแปลงของลำดับกรดอะมิโนจะแทรกหรือลบเช่นเดียวกับการแทนที่อะมิโนแอซิด ทดแทนดังกล่าวอาจจะหัวเก่า เช่นเรซิดิวเป็นกรดอะมิโนถูกแทนที่ ด้วยเรซิดิวเป็นกรดอะมิโนของสารเคมีคล้าย poperties โดยเฉพาะอย่างยิ่งตามขั้วเป็นขนาด ตัวอย่างของหัวเก่าจะแทนสมาชิกของกลุ่มต่อไปนี้:1) อะลานีน แถ และทรีโอ นีน 2 กรด aspartic และกลูตาเมต 3) asparagine และ glutamine 4) อาร์จินีนและแอล-ไลซีน 5) isoleucine, leucine, methionine และวาลี น และ 6) phenylalanine, tyrosine และทริปโตเฟน ในทางกลับกัน มันได้ยังจะแนะนำการเปลี่ยนแปลงทางอนุรักษนิยมไม่ลำดับกรดอะมิโน นอกจากนี้ แทนการแทนกรดอะมิโนเดียวเรซิดิว ก็ยังสามารถแทรกหรือลบหนึ่งหรือเพิ่มเติมอย่างต่อเนื่องกรดอะมิโนของโครงสร้างหลักของไลโปคาลินฉีกขาดยาวเหล่านี้ลบหรือแทรกผลลัพธ์อย่างใดอย่างหนึ่งในมิวทีนพับ/ทำงานมั่นคง (ดูตัวอย่าง ส่วนทดลองในกับตัด N - และ C-นัสมิวทีนที่สร้างขึ้น) [0058] Such modifications of the amino acid sequence รวมถึง directed mutagenesis of single amino acid positions in order to simplify sub-cloning of the mutated ไลโปคาลิน gene หรือ its parts by incorporating cleavage ตำแหน่ง for certain restriction enzymes. In addition, these mutations can also be incorporated to further improve the แอฟฟินิตี้ of a ไลโปคาลิน มิวทีน for a given target. Furthermore, mutations can be introduced in order to modulate certain characteristics of the มิวทีน such as to improve folding stability, serum stability, protein resistance หรือ water solubility หรือ to reduce aggregation tendency, if necessary. For example, naturally occurring ซิสเทอีน เรซิดิว may be mutated to other amino acids to prevent disulfide bond formation. It is also possible to deliberately mutate other amino acid sequence position to ซิสเทอีน in order to introduce new reactive groups, for example for the conjugation to other compounds, such as polyethylene glycol (PEG), hydroxyethyl starch (HES), biotin, peptides หรือ proteins, หรือ for the formation of non-naturally occurring disulfide linkages. Exemplary possibilities of such a mutation to introduce a ซิสเทอีน เรซิดิว into the amino acid sequence of a ไลโปคาลินนุนุ มิวทีน รวมถึง the substitutions Thr 40--> Cys, Glu 73--> Cys, Arg 90~ Cys, Asp 95--> Cys, and Glu 131--> Cys. The generated thiol moiety at the side of any of the amino acid positions 40, 73, 90, 95 and/or 131 may be used to PEGylate หรือ HESylate the มิวทีน, for example, in order to increase the serum half-life of a respective tear ไลโปคาลิน มิวทีน.[0059] การเปิดเผยปัจจุบันยังครอบคลุมมิวทีนตามที่กำหนดไว้ข้างต้น ที่สี่แรกสถานี N กรดอะมิโนเรซิดิวของลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย (พระพระลือลือ ตำแหน่ง 1-4) และ/หรือล่าสุดสองเทอร์มินัล C กรดอะมิโนเรซิดิว (Ser ที่ตำแหน่ง 157) และ Asp ที่ตำแหน่ง 158 ลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยถูกลบ (ดูรูปที่ 10 และรูปที่ 14) การกลายพันธุ์ได้อีกลำดับชนิดป่าได้เปลี่ยนลำดับกรดอะมิโนลำดับตำแหน่ง 5 ถึง 7 (อลา Ser Asp) Gly Gly Asp ใน PCT ประกาศ WO 2005/019256[0060] มิวทีนไลโปคาลินน้ำตามนุษย์ของการเปิดเผยอาจรวมถึง ประกอบเป็นหรือประกอบด้วยหนึ่งลำดับกรดอะมิโนที่กำหนดไว้ในลำดับ ID: 3-2862-71 และ 82 หรือ: ชิ้นส่วนย่อยหรือรูปแปรผันดังกล่าว[0061] คำว่า "ชิ้นส่วนย่อย" ตามที่ใช้ในที่นี้กับมิวทีนไลโปคาลินของการเปิดเผยเกี่ยวข้องกับโปรตีนหรือเปปไทด์มาไลโปคาลินปราศจากผู้ใหญ่ที่มี N พฤติกรรม / C พฤติกรรมลด ลง เช่นขาดน้อยหนึ่งในกรดอะมิโนเทอร์มินัล N / C เทอร์มินัล เช่น: ชิ้นส่วนย่อยs อาจรวมถึงน้อย 10 เพิ่มเติมเช่น 20 หรือ 30 หรือเพิ่มเติมต่อกรดอะมิโนลำดับหลักไลโปคาลินผู้ใหญ่และมักจะตรวจในการ immunoassay มีของไลโปคาลินผู้ใหญ่[0062] The term "รูปแปรผัน" as used in the present การเปิดเผย relates to derivatives of a ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย that รวมถึง modifications of the amino acid sequence, for example by substitution, deletion, insertion หรือ chemical modification. Such modifications do ในบางรุรุ not reduce the functionality of the มิวทีน. For example, to generate such รูปแปรผัน, one หรือ more amino acids of a มิวทีน of the การเปิดเผย can be replaced by their respective D-stereoisomers หรือ by amino acids other than the naturally occurring 20 amino acids, such as, e.g. ornithine, hydroxyproline, citrulline, homoserine, hydroxylysine, norvaline. However, such substitutions may also be conservative, i.e. an amino acid เรซิดิว is replaced with a chemically similar amino acid เรซิดิว. Examples of conservative substitutions are the replacements among the members of the following groups: 1) alanine, serine, and threonine; 2) aspartic acid and glutamic acid; 3) asparagine and glutamine; 4) arginine and lysine; 5) isoleucine, leucine, methionine, and valine; and 6) phenylalanine, tyrosine, and tryptophan.[0063] A ไลโปคาลิน มิวทีน of the การเปิดเผย may exist as a monomeric protein. ในบางรุรุ a ไลโปคาลิน มิวทีน according to the การเปิดเผย may be able to spontaneously dimerise หรือ oligomerise. The use of ไลโปคาลิน มิวทีน that form stable monomers may be advantageous in some applications, e.g. because of faster diffusion and better tissue penetration. In other embodiments the use of a ไลโปคาลิน มิวทีน that spontaneously forms stable homodimers หรือ multimers may be advantageous, since such multimers can provide (further) increased แอฟฟินิตี้ and/or avidity to a given target. Furthermore, oligomeric forms of the ไลโปคาลิน มิวทีน may have slower dissociation rates หรือ prolonged serum half-life. If dimerisation หรือ multimerisation of มิวทีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

[0054] ใน embodiments เพิ่มเติมบางน้ำตามนุษย์ไลโปคาลินมิวทีนไปตามการเปิดเผยประกอบรวมด้วยหนึ่งหรือกรดอะมิโนกลายพันธุ์เพิ่มเติมได้ที่คนใดคนหนึ่งของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่ง 79, 92 และ 105 เชิงเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของการฉีกขาดของมนุษย์ที่เป็นผู้ใหญ่ไลโปคาลิน ยกตัวอย่างเช่นการฉีกขาดของมนุษย์ไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยอาจรวมถึงต่อไปนี้แทนกรดอะมิโน:
ตามที่กำหนดไว้ข้างต้นการฉีกขาดของมนุษย์ไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยรวมถึง อย่างน้อยหนึ่งทดแทนกรดอะมิโนซึ่งตั้งอยู่ในตำแหน่งที่ลำดับของตำแหน่งที่ 26
วันที่ 27, 28, 30, 31, 33, 34, 57, 61, 80, 83, 104-106 และ 108 ของเชิงเส้นโพลีเป ปไทด์ลำดับของการฉีกขาดของมนุษย์ที่เป็นผู้ใหญ่ไลโปคาลิน (SEQ ID NO: 1) ในบาง embodiments มิวทีนของการเปิดเผยรวมถึงสองหรือมากขึ้นเช่น 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 หรือ 16 แทนกรดอะมิโน เหล่านี้ในตำแหน่งลำดับของการฉีกขาดของมนุษย์ที่เป็นผู้ใหญ่ไลโปคาลิน ในศูนย์รวมหนึ่งโดยเฉพาะอย่างยิ่งมิวทีนมีกรดกลายพันธุ์อะมิโนเรซิดิวในแต่ละลำดับตำแหน่ง 26, 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83 , 104-106 และ 108 ของเชิงเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย (ดูตัวอย่างเช่นรูปที่ 10 และ Figure14). [0056] ในบางรุรุเป็นไลโปคา ลินนุนุมิวทีนของการเปิดเผยอาจรวมถึงส่วนที่เกี่ยวกับลำดับกรดอะมิโนไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยหนึ่งหรือเพิ่มเติมที่รวมถึงอย่างน้อยสองอย่างน้อยสามหรืออย่างน้อย สี่การแทนที่อะมิโนแอซิดของกรดอะมิโนพื้นเมืองเรซิดิวโดยซิสเทอีนเรซิดิวที่ตำแหน่งใด ๆ ภายในวงบริเวณ s ของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย ในบางรุรุเป็นมิวทีนไปตามการเปิดเผยรวมถึงทดแทนกรดอะมิโนของกรดอะมิโนพื้นเมืองโดยซิสเทอีนเรซิดิวที่ตำแหน่ง 28 หรือ 105 ที่เกี่ยวกับลำดับกรดอะมิโนไล โปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย. [0057] ในบริเวณที่เหลือ ได้แก่ บริเวณที่แตกต่างกันจากตำแหน่งลำดับ 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 และ 108 ซึ่งเป็นไลโปคาลินนุนุ มิวทีนของการเปิดเผยอาจรวมถึงประเภทของป่า (ธรรมชาติ) ลำดับกรดอะมิโนนอกกลายพันธุ์อะมิโนตำแหน่งลำดับกรด ในบางรุรุเป็นไลโปคาลินนุนุมิวทีนไปตามการเปิดเผยอาจดำเนินการอย่างใดอย่างหนึ่งหรือการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนมากขึ้นในตำแหน่งลำดับ / ตำแหน่งเป็นเวลานานเช่นการกลายพันธุ์ไม่อย่างน้อยเป็นหลักไม่ขัดขวางหรือ ไม่ยุ่งเกี่ยวกับกิจกรรมที่มีผลผูกพันและพับของมิวทีน การกลายพันธุ์ดังกล่าวสามารถทำได้อย่างง่ายดายมากในระดับดีเอ็นเอโดยใช้วิธีการมาตรฐานที่จัดตั้งขึ้น ตัวอย่างที่เป็นตัวอย่างของการเปลี่ยนแปลงของลำดับกรดอะมิโนที่มีการแทรกหรือลบเช่นเดียวกับการแทนที่อะมิโนแอซิด แทนดังกล่าวอาจจะอนุรักษ์นิยมคือกรดอะมิโนเรซิดิวจะถูกแทนที่ด้วยกรดอะมิโนเรซิดิวของคุณสมบัติทางเคมีคล้ายกันโดยเฉพาะอย่างยิ่งในเรื่องเกี่ยวกับขั้วเช่นเดียวกับขนาด ตัวอย่างของการแทนอนุรักษ์นิยมจะเปลี่ยนในหมู่สมาชิกของกลุ่มต่อไปนี้: 1) อะลานีน, ซีรีนและ ธ รีโอนี; 2) กรด aspartic และกรดกลูตามิ; 3) และ asparagine glutamine; 4) และไลซีนอาร์จินี; 5) ไอโซลิวซีน, leucine, methionine และ valine; และ 6) phenylalanine, tyrosine และโพรไบโอ ในทางกลับกันก็ยังเป็นไปได้ที่จะแนะนำการปรับเปลี่ยนที่ไม่อนุรักษ์นิยมในลำดับกรดอะมิโน นอกจากนี้แทนการแทนที่กรดอะมิโนเดี่ยวเรซิดิวก็ยังเป็นไปได้ที่จะได้ทั้งแทรกหรือลบหรือกรดอะมิโนอย่างต่อเนื่องมากขึ้นของโครงสร้างหลักของการฉีกขาดไลโปคาลินตราบใดที่ผลการแทรกการลบเหล่านี้หรือใน เสถียรภาพพับ / ทำงานมิวทีน (ดูตัวอย่างส่วนการทดลองที่มิวทีนที่มีการตัดทอน N-C-ปลายทางจะมีการสร้าง). [0058] การปรับเปลี่ยนดังกล่าวของกรดอะมิโนลำดับรวมถึงกำกับฉับเดียว ตำแหน่งกรดอะมิโนในการสั่งซื้อเพื่อให้ง่ายต่อการโคลนย่อยของการกลายพันธุ์ไลโปคาลินของยีนหรือชิ้นส่วนของมันโดยผสมผสานความแตกแยกตำแหน่งเอนไซม์ข้อ จำกัด บางอย่าง นอกจากนี้ยังมีการกลายพันธุ์เหล่านี้ยังสามารถรวมเพื่อปรับปรุงแอฟฟินิตี้ของไลโปคาลินมิวทีนสำหรับเป้าหมายที่กำหนด นอกจากนี้การกลายพันธุ์ที่สามารถนำมาใช้ในการสั่งซื้อเพื่อปรับลักษณะบางอย่างของมิวทีนเช่นเพื่อปรับปรุงเสถียรภาพพับเสถียรภาพซีรั่มละลายน้ำต้านทานโปรตีนหรือหรือเพื่อลดแนวโน้มการรวมตัวในกรณีที่จำเป็น ยกตัวอย่างเช่นธรรมชาติที่เกิดขึ้นซิสเทอีนเรซิดิวอาจจะกลายพันธุ์ไปกรดอะมิโนอื่น ๆ เพื่อป้องกันการก่อตัวของพันธบัตรซัลไฟด์ นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะจงใจเปลี่ยนแปลงตำแหน่งลำดับกรดอะมิโนอื่น ๆ ที่จะซิสเทอีนในการสั่งซื้อที่จะแนะนำกลุ่มปฏิกิริยาใหม่ตัวอย่างสำหรับการเชื่อมต่อกันเพื่อสารประกอบอื่น ๆ เช่นพลาสติกคอล (PEG) จาก hydroxyethyl starch (HES), ไบโอติน เปปไทด์โปรตีนหรือ, หรือการก่อตัวของการไม่เกิดขึ้นตามธรรมชาติเชื่อมโยงซัลไฟด์ ความเป็นไปได้ที่เป็นแบบอย่างของการกลายพันธุ์ดังกล่าวจะแนะนำซิสเทอีนเรซิดิวเข้ามาในลำดับกรดอะมิโนของไลโปคาลินนุนุมิวทีนรวมถึงการแทนที่นั่น 40 -> Cys, Glu 73- -> Cys, Arg 90 ~ Cys, งูเห่า 95 -> Cys และ Glu 131 -> Cys ที่สร้างครึ่งหนึ่ง thiol ด้านข้างของใด ๆ ของกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 40, 73, 90, 95 และ / หรือ 131 อาจถูกใช้เพื่อ PEGylate หรือ HESylate มิวทีน, ตัวอย่างเช่นเพื่อเพิ่มเซรั่มครึ่งชีวิต ของการฉีกขาดที่เกี่ยวข้องไลโปคาลินมิวทีน. [0059] ที่การปัจจุบันเปิดเผยไซเบอร์ยังมิวทีนตามที่ระบุไว้ข้างต้นซึ่งในครั้งแรกที่สี่กรดอะมิโน n- ขั้วเรซิดิวของลำดับของไล โปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย (ของพระองค์พระองค์-Leu-Leu; ตำแหน่ง 1-4) และ / หรือช่วงสองกรดอะมิโน c- ขั้วเรซิดิว (Ser ที่ตำแหน่ง 157 และงูเห่าที่ตำแหน่ง 158) ของ ลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยได้ถูกลบไปแล้ว (ดูรูปที่ 10 และรูปที่ 14) อีกประการหนึ่งที่เป็นไปได้ของการกลายพันธุ์ลำดับป่าประเภทคือการเปลี่ยนลำดับกรดอะมิโนที่ตำแหน่งลำดับ 5-7 (Ala Ser งูเห่า) เพื่อ Gly Gly งูเห่าตามที่อธิบายไว้ในสิ่งพิมพ์ PCT WO 2005/019256. [0060] ที่ฉีกขาดของมนุษย์ไลโปคาลิ นมิวทีนของการเปิดเผยอาจรวมถึงประกอบด้วยหลักของหรือประกอบด้วยคนใดคนหนึ่งของลำดับกรดอะมิโนที่กำหนดไว้ใน SEQ ID NO: 3-28, 62-71 และ 82 หรือคือชิ้นส่วนย่อยหรือรูป แปรผันดังกล่าว. [0061] คำว่า "ชิ้นส่วนย่อย" ตามที่ใช้ในที่นี้ในการเชื่อมต่อกับไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยเกี่ยวข้องกับโปรตีนหรือเปปไทด์ที่ได้มาจากไลยาวเต็มรูปแบบผู้ใหญ่โปคา ลินที่มี N-หนักและ / หรือ C-หนักสั้นลงเช่นขาดอย่างน้อยหนึ่งของ N-terminal และ / หรือ C ขั้วกรดอะมิโน ดังกล่าว: ชิ้นส่วนย่อย s อาจรวมถึงอย่างน้อย 10 มากขึ้นเช่น 20 หรือ 30 หรืออื่นๆ กรดอะมิโนที่ต่อเนื่องกันของลำดับหลักของผู้ใหญ่ไลโปคาลินและมักจะตรวจพบใน immunoassay ของผู้ใหญ่ไลโปคาลิ น. [0062] คำว่า "รูปแปรผัน" ที่ใช้ในปัจจุบันการเปิดเผยที่เกี่ยวข้องกับการซื้อขายสัญญาซื้อขายล่วงหน้าของไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยว่ารวมถึงการปรับเปลี่ยนลำดับกรดอะมิโนเช่นโดยการแทน การลบแทรกหรือการเปลี่ยนแปลงทางเคมี การปรับเปลี่ยนดังกล่าวจะทำในบางรุรุไม่ลดการทำงานของมิวทีน ยกตัวอย่างเช่นการสร้างเช่นรูปแปรผันหนึ่งหรืออื่น ๆ กรดอะมิโนของมิวทีนของการเปิดเผยจะถูกแทนที่ด้วยของตน D-stereoisomers หรือจากกรดอะมิโนอื่น ๆ นอกเหนือจากธรรมชาติที่เกิดขึ้น 20 กรดอะมิโนเช่นเช่น ornithine, hydroxyproline, citrulline, homoserine, hydroxylysine, Norvaline แต่แทนดังกล่าวก็อาจจะเป็นแบบอนุรักษ์นิยมคือกรดอะมิโนเรซิดิวจะถูกแทนที่ด้วยกรดอะมิโนที่คล้ายกันสารเคมีเรซิดิว ตัวอย่างของการแทนอนุรักษ์นิยมจะเปลี่ยนในหมู่สมาชิกของกลุ่มต่อไปนี้: 1) อะลานีน, ซีรีนและ ธ รีโอนี; 2) กรด aspartic และกรดกลูตามิ; 3) และ asparagine glutamine; 4) และไลซีนอาร์จินี; 5) ไอโซลิวซีน, leucine, methionine และ valine; และ 6) phenylalanine, tyrosine และโพรไบโอ. [0063] เป็นไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยอาจมีอยู่เป็นโปรตีน monomeric ในบางรุรุไลโปคาลินมิวทีนไปตามการเปิดเผยอาจจะเป็นธรรมชาติหรือ oligomerise dimerise การใช้งานของไลโปคาลินมิวทีนโมโนเมอร์ที่ฟอร์มที่มีเสถียรภาพอาจเป็นประโยชน์ในการใช้งานบางอย่างเช่นเพราะการแพร่กระจายได้เร็วขึ้นและการเจาะเนื้อเยื่อที่ดีกว่า ใน embodiments อื่น ๆ การใช้งานของไลโปคาลินมิวทีนที่เป็นธรรมชาติในรูปแบบที่มีความเสถียรหรือ homodimers multimers อาจจะได้เปรียบเนื่องจาก multimers ดังกล่าวสามารถให้บริการ (เพิ่มเติม) เพิ่มแอฟฟินิตี้และ / หรือความโลภไปยังเป้าหมายที่กำหนด นอกจากนี้รูปแบบ oligomeric ของไลโปคาลินมิวทีนอาจมีอัตราการแยกตัวออกช้าหรือซีรั่มเป็นเวลานานครึ่งชีวิต หาก dimerisation หรือ multimerisation ของมิวทีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

[ ที่ ] ใน embodiments บางเพิ่มเติม เป็นคนฉีกไลโปคาลินมิวทีนตามการการเปิดเผยประกอบรวมด้วยหนึ่งค็อคเพิ่มเติมกลายพันธุ์กรดอะมิโนตกค้างใด ๆหนึ่งของลำดับกรดอะมิโนตำแหน่ง 79 , 92 และ 105 ของเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของผู้ใหญ่ไลโปคาลินน้ำตาของมนุษย์ ตัวอย่างเช่นมนุษย์ฉีกไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยอาจรวมถึงกรดอะมิโนเปลี่ยนต่อไปนี้ :
ตามที่กำหนดข้างต้น มนุษย์ฉีกไลโปคาลินมิวทีนของรวมถึงการเปิดเผยอย่างน้อยหนึ่งกรดอะมิโนทดแทน , ซึ่งตั้งอยู่ที่ลำดับตำแหน่งของตำแหน่ง
26 , 27 , 28 , 30 , 32 , 33 , 34 , 57 , 61 , 80 , 83 ,104-106 และ 108 ของเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับของผู้ใหญ่มนุษย์ฉีกไลโปคาลิน ( seq id : 1 ) ใน embodiments เป็นมิวทีนของการเปิดเผยรวมถึงสองค็อค เช่น 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 และ 16 แทนค็อคกรดอะมิโนเหล่านี้ลำดับตำแหน่งของผู้ใหญ่มนุษย์ฉีกไลโปคาลิน .ในหนึ่งโดยเฉพาะศูนย์รวม , มิวทีนมีกลายพันธุ์กรดอะมิโนเรซิดิวในแต่ละลำดับตำแหน่ง 26 , 27 , 28 , 30 , 31 , 33 , 52 , 57 , 61 , 64 , 66 , 80 , 83 , 104-106 และ 108 ของเส้นโพลีเปปไทด์ลำดับไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย ( ดู ตัวอย่าง รูปที่ 10 และ figure14 )

[ ] ในบางรุรุ 0056 ,เป็นไลโปคาลินนุนุมิวทีนของการเปิดเผยอาจรวมถึงเทียบกับลำดับกรดอะมิโนของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยหนึ่งค็อคเพิ่มเติม ที่รวมถึงอย่างน้อยสองอย่างน้อยสามค็อคอย่างน้อยสี่การแทนที่อะมิโนแอซิดพื้นเมืองของกรดอะมิโนเรซิดิวโดยซิสเทอีนเรซิดิวในทุกๆตำแหน่งภายในวงบริเวณของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย . ในบางรุรุ ,เป็นมิวทีนตามการการเปิดเผยรวมถึงการทดแทนกรดอะมิโนของกรดอะมิโนที่ตำแหน่งเรซิดิวพื้นเมืองโดยซิสเทอีน 28 ค็อค 105 เทียบกับลำดับกรดอะมิโนของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย

[ 0057 ] ในบริเวณตกค้าง เช่นบริเวณแตกต่างจากลำดับตำแหน่ง 26-34

56-58 , 80 ,83 , 104-106 และ 108 , ไลโปคาลินนุนุมิวทีนของการเปิดเผยอาจรวมถึงประเภทป่า ( ธรรมชาติ ) ลำดับกรดอะมิโนนอกกลายพันธุ์เป็นลำดับกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง ในบางรุรุ ,เป็นไลโปคาลินนุนุมิวทีนตามการการเปิดเผยอาจพกค็อคอะมิโนกรดมากขึ้นการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง / ลำดับตำแหน่งตราบใดที่เช่นการกลายพันธุ์แล้ว อย่างน้อยก็เป็นหลักไม่ขัดขวางค็อคไม่รบกวนกิจกรรมการพับของมิวทีน .การกลายพันธุ์ดังกล่าวสามารถประสบความสำเร็จได้อย่างง่ายดายมากในระดับดีเอ็นเอโดยใช้สร้างวิธีการมาตรฐาน ตัวอย่างกรณีการเปลี่ยนแปลงของลำดับกรดอะมิโนจะแทรกค็อคลบเช่นเดียวกับการแทนที่อะมิโนแอซิด . เช่นเปลี่ยนอาจจะอนุรักษ์ ได้แก่การเรซิดิวกรดอะมิโนจะถูกแทนที่ ด้วยเรซิดิวคุณสมบัติทางเคมีของกรดอะมิโนคล้ายคลึงกัน โดยเฉพาะเรื่องขั้ว รวมทั้งขนาด ตัวอย่างของอนุลักษณ์แทนจะเปลี่ยนระหว่างสมาชิกของกลุ่มต่อไปนี้ :
1 ) อะลานีนเซอรีน และทรีโอนีน ; 2 ) และกรด aspartic กรดกลูตามิค และกรดแอสพาราจีน ; 3 ) 4 ) อาร์จินีนและไลซีน ;5 ) isoleucine , ลูซีน , methionine , และ วาลีน และ 6 ) ฟีนีซีน และทริป . บนมืออื่น ๆนอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะแนะนำการเปลี่ยนแปลงองค์กรอนุรักษ์ในลำดับกรดอะมิโน นอกจากนี้แทนการเปลี่ยนกรดอะมิโนเรซิดิวเดียว ,นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะแทรกค็อคลบกรดมากขึ้นอย่างต่อเนื่องหนึ่งค็อคอะมิโนของโครงสร้างหลักของฉีกไลโปคาลินตราบเท่าที่เหล่านี้ลบแทรกค็อคผลที่มั่นคงพับ / มิวทีนการทำงาน ( เห็นตัวอย่าง ส่วนการทดลองที่มิวทีนกับตัด - และ c-terminus
ถูกสร้างขึ้น )[ 0058 ] เช่นการปรับเปลี่ยนของลำดับกรดอะมิโนรวมถึงการกลายพันธุ์ของกรดอะมิโนที่ตำแหน่งเดียว เพื่อลดความซับซ้อนในการโคลนย่อยยีนกลายพันธุ์ไลโปคาลินค็อคชิ้นส่วนของมันโดยผสมผสานกับการตำแหน่งสำหรับเอนไซม์ข้อ จำกัด บางอย่าง นอกจากนี้การกลายพันธุ์เหล่านี้ยังสามารถรวมเพื่อปรับปรุงการแอฟฟินิตี้ของมิวทีนไลโปคาลินให้เป้าหมาย นอกจากนี้ การกลายพันธุ์ สามารถแนะนำเพื่อปรับลักษณะบางอย่างของมิวทีนเช่นการปรับปรุงเสถียรภาพความมั่นคง พับ เซรั่มโปรตีนต้านทานค็อคการละลายน้ํา ค็อค ลดการเกาะกลุ่มแนวโน้มถ้าจำเป็น ตัวอย่างเช่น เกิดขึ้นตามธรรมชาติซิสเทอีนเรซิดิวอาจจะกลายพันธุ์กับกรดอะมิโนอื่น ๆเพื่อป้องกันการเกิดพันธะไดซัลไฟด์ . นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่จะจงใจเปลี่ยนแปลงอื่น ๆ ลำดับกรดอะมิโนตำแหน่งซิสเทอีนเพื่อแนะนำใหม่ 3 กลุ่ม ตัวอย่างในการสารประกอบอื่น ๆเช่น polyethylene glycol ( PEG )hydroxyethyl แป้ง ( เขา ) , ไบโอติน ค็อค เปปไทด์ โปรตีน ค็อคสำหรับการก่อตัวของธรรมชาติที่เกิดขึ้นเชื่อมโยงที่ไม่ได . ความเป็นไปได้ของการเป็นแบบอย่าง เช่น การแนะนำเรซิดิวซิสเทอีนเป็นลำดับกรดอะมิโนของไลโปคาลินนุนุมิวทีนรวมถึงการเปลี่ยนสา 40 -- > ภาวะซึ่ง 73 , -- > ภาวะ , arg 90 ~ 95 -- > ภาวะภาวะ , ASP ,กับ GLU 131 -- > ภาวะ . สร้างขนาดแน่นอนที่ด้านข้างของใด ๆของกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 40 , 80 , 90 , 95 และ / หรือ 131 อาจใช้ pegylate ค็อค hesylate ที่มิวทีน , ตัวอย่างเช่น , เพื่อเพิ่มเซรั่มครึ่งชีวิตของตนฉีกไลโปคาลินมิวทีน

[ 0059 ] ปัจจุบันการเปิดเผยยังครอบคลุมมิวทีนเป็น ที่กำหนดไว้ข้างต้นที่แรกสี่กรดอะมิโนกรดอะมิโนเรซิดิวของลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัย ( ของเขาลูลิว ; ตำแหน่งที่ 1-4 ) และ / หรือ สองคนสุดท้ายซึ่งกรดอะมิโนเรซิดิว ( เซอร์ที่ตำแหน่งและ ASP ที่ตำแหน่ง 158 ) ของลำดับของไลโปคาลินน้ำตามนุษย์เต็มวัยถูกลบ ( ดูรูปที่ 10 รูปที่ 14 ) .อีกการกลายพันธุ์ที่เป็นไปได้ของลำดับประเภทป่าเพื่อเปลี่ยนลำดับกรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 5 ลำดับ 7 ( อ้าวเซอร์ ASP ) GLY GLY ASP ตามที่อธิบายไว้ในสิ่งพิมพ์ PCT wo 2005 / 019256

[ 0060 ] มนุษย์ฉีกไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยอาจรวมถึงประกอบด้วยหลักของค็อคประกอบด้วยใด ๆ ของกรดอะมิโนที่กำหนดไว้ใน seq id ไม่ :3-28
62-71 , และ 82 ค็อค : ชิ้นส่วนย่อยค็อครูปแปรผันนั้น


[ 0061 ] คำว่า " ชิ้นส่วนย่อย " ตามที่ใช้ในที่นี้ในการเชื่อมต่อกับไลโปคาลินมิวทีนของการเปิดเผยเกี่ยวข้องกับโปรตีนเปปไทด์ที่ได้มาจากผู้ใหญ่ไลโปคาลินค็อคเต็มตัวที่ n-terminally และ / หรือ c-terminally สั้นลงเช่น ขาดอย่างน้อยหนึ่งของกรดอะมิโน และ / หรือ ซึ่งกรดอะมิโน เรื่อง : ชิ้นส่วนย่อย S อาจรวมถึงอย่างน้อย 10 20 30 หรือมากขึ้นเช่นค็อค
ติดต่อกันมากขึ้นกรดอะมิโนของลำดับปฐมภูมิของผู้ใหญ่ไลโปคาลินและมักจะพบในผู้ป่วยที่เป็นผู้ใหญ่ไลโปคาลิน .

[ 0062 ] คำว่า " รูปแปรผัน " ที่ใช้ในการเปิดเผยปัจจุบันที่เกี่ยวข้องกับอนุพันธ์ของมิวทีนไลโปคาลินของการเปิดเผยที่รวมถึงการแก้ไขของลำดับกรดอะมิโน เช่น การแทนที่การลบแทรกค็อคการดัดแปลงทางเคมี .การปรับเปลี่ยนดังกล่าวจะในบางรุรุไม่ลดการทำงานของมิวทีน . ตัวอย่างเช่น ในการสร้าง เช่น กรดอะมิโน ค็อครูปแปรผันหนึ่งเพิ่มเติมของมิวทีนของการเปิดเผยสามารถถูกแทนที่ด้วยตน d-stereoisomers ค็อคด้วยกรดอะมิโนกว่า 20 กรดอะมิโนธรรมชาติที่เกิดขึ้น เช่น เช่น ซิทรูลีนออร์นิทีนไฮดรอกซิโพรลีน , , ,