5.3. Preparation of microsomal frac

5.3. Preparation of microsomal fraction
Yeast expression vectors for CYP735A1 (At5g38450) and CYP735A2 (At1g67110) were constructed as previously described (Takei et al., 2004). Briefly, cDNA for NADPH-reductase (ATR1) (Urban et al., 1997) was cloned into the NotI/SpeI site of the pESC-LEU vector (Stratagene, La Jolla, CA, USA) yielding pESC-ATR1. CYP735As were ligated into the pYES2.1/V5-His-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) yielding pYES-CYP735A1 and pYES-CYP735A2, respectively. pESC-ATR1 and each pYES-CYP735A were co-transformed into Saccharomyces cerevisiae strain YPH499 (Stratagene).

The microsomal protein fraction was prepared using a modification of the method of Venkateswarlu et al. (1998), as described in a previous study (Takei et al., 2004). In this method, buffer A did not contain reduced glutathione (100 mM potassium phosphate containing 20% glycerol and 0.5 mM EDTA). First, cells harvested from the culture by centrifugation (10,000g) were resuspended in buffer A and homogenized with glass beads (425–600 μm, Sigma–Aldrich Japan). After ultracentrifugation (100,000g), the pellet was washed again with buffer A. The final preparation of microsomes as a pellet was resuspended in buffer A. The concentrations of the protein solutions were determined using the Bradford Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) using bovine serum albumin as the standard.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

5.3 การเตรียมความพร้อมของไมโครพาหะเศษ
แสดงออกยีสต์เพื่อ cyp735a1 (at5g38450) และ cyp735a2 (at1g67110) ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (takei และคณะ. 2004) สั้น ๆ , cDNA เพื่อ NADPH-reductase (atr1) (ในเมืองและคณะ. 1997) ได้รับการโคลนเข้าไปในเว็บไซต์ Noti / Spei ของเวกเตอร์ pesc-Leu (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ยอม pesc-atr1 cyp735as ถูก ligated เป็น pyes21/v5-his-topo เวกเตอร์ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ยอม Pyes-cyp735a1 และ Pyes-cyp735a2 ตามลำดับ pesc-atr1 และแต่ละ Pyes-cyp735a ได้ร่วมกลายเป็น Saccharomyces cerevisiae yph499 ความเครียด (Stratagene).

เศษโปรตีนไมโครได้รับการจัดทำขึ้นโดยใช้การปรับเปลี่ยนวิธีการในการ Venkateswarlu ตอัล (1998) ตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ (takei และคณะ. 2004)ในวิธีนี้ buffer ไม่ได้มีกลูตาไธโอนที่ลดลง (100 มิลลิเมตรโพแทสเซียมฟอสเฟตที่มีกลีเซอรอล 20% และ 0.5 มม. EDTA) แรกเซลล์จากการเก็บเกี่ยววัฒนธรรมโดยการหมุนเหวี่ยง (10,000 กรัม) มี resuspended ในบัฟเฟอร์และหดหายด้วยลูกปัดแก้ว (425-600 ไมโครเมตร Sigma-Aldrich ญี่ปุ่น) หลังจาก ultracentrifugation (100,000 g) เม็ดถูกล้างอีกครั้งด้วยบัฟเฟอร์การเตรียมความพร้อมครั้งสุดท้ายของ microsomes เป็นเม็ดถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ ความเข้มข้นของการแก้ปัญหาโปรตีนได้รับการพิจารณาโดยใช้การทดสอบโปรตีน Bradford (ไบโอล้อ, hercules แคลิฟอร์เนีย, usa) โดยใช้ซีรั่มอัลบูมิวัวเป็นมาตรฐาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5.3 การเตรียมเศษ microsomal
Yeast เวกเตอร์นิพจน์สำหรับ CYP735A1 (At5g38450) และ CYP735A2 (At1g67110) ถูกสร้างเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Takei et al., 2004) สั้น ๆ cDNA สำหรับ NADPH-reductase (ATR1) (เมืองร้อยเอ็ด al., 1997) ถูก cloned เป็นไซต์ NotI/SpeI ของ pESC ลือเวกเตอร์ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) บริษัท pESC-ATR1 CYP735As ได้ ligated ไป pYES2เวกเตอร์ 1/V5-พระเดิน (Invitrogen คาร์ลส CA, USA) บริษัท pYES-CYP735A1 และ pYES-CYP735A2 ตามลำดับ pESC ATR1 และ pYES แต่ละ CYP735A ได้ร่วมกันแปรรูปเป็น Saccharomyces cerevisiae ต้องใช้ YPH499 (Stratagene)

เศษโปรตีน microsomal ที่เตรียมโดยใช้วิธีของ Venkateswarlu et al. (1998), การปรับเปลี่ยนตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้า (Takei et al., 2004) ในวิธีนี้ บัฟเฟอร์ที่ไม่ประกอบด้วย A ลดลง (100 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟตประกอบด้วย 20% กลีเซอรและ 0.5 mM EDTA) กลูตาไธโอน ครั้งแรก เซลล์ที่เก็บเกี่ยวจากวัฒนธรรม โดย centrifugation (10, 000g) ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ A และ homogenized กับลูกปัดแก้ว (425–600 μm, Sigma–Aldrich ญี่ปุ่น) หลังจาก ultracentrifugation (100, 1000 กรัม), เม็ดถูกล้างอีกครั้ง ด้วยบัฟเฟอร์อ. เตรียมความพร้อมขั้นสุดท้ายของ microsomes เป็นเม็ดถูก resuspended ในบัฟเฟอร์อ. ความเข้มข้นของโซลูชั่นโปรตีนถูกกำหนดใช้ทดสอบโปรตีนแบรดฟอร์ด (Bio Rad เฮอร์คิวลิส CA, USA) ใช้วัว serum albumin เป็นมาตรฐาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

5.3 . การเตรียมการของ microsomal เศษ
ยีสต์การแสดงองค์ประกอบสำหรับ CYP 735 ที่ 1 (ที่ 5 G 38450 )และ CYP 735 A 2 (ที่ 1 G 67110 )ถูกสร้างขึ้นที่ระบุไว้( takei et al ., 2004 ) สำหรับช่วงระยะเวลาสั้นๆ cdna nadph - reductase (อาร์ 1 )(ในเมือง et al . 1997 )ได้จำลองไว้ลงในเว็บไซต์ spei noti / pesc - ,ลิว Initialization Vector ( stratagene , La Jolla , CA , USA )ที่ออกผล pesc - อาร์ 1 CYP 735 เป็น ligated เข้าสู่ pyes 21 / v 5 - ของเขา - TOPO Initialization Vector ( invitrogen , Carlsbad , CA , USA )ผล pyes - CYP 735 ที่ 1 และ pyes - CYP 735 2 ,ตามลำดับ. pesc - อาร์ 1 และแต่ละ pyes - CYP 735 ที่ร่วมมือกับ - ปรับเปลี่ยนรูปแบบไปสู่ความเมื่อยล้า saccharomyces cerevisiae yph 499 ( stratagene ).

ที่ microsomal โปรตีนเศษเตรียมใช้การปรับเปลี่ยนวิธีการของ venkateswarlu et al . ( 1998 )ตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้า( takei et al . 2004 )ในวิธีนี้ที่ไม่มีบัฟเฟอร์ glutathione ลดลง( 100 ฟอสเฟตกลีซ - เออะริน,โปแตสเซียมมม.ที่มี 20% และ 0.5 มม. edta ) ครั้งแรกเซลล์เก็บเกี่ยวจากวัฒนธรรมโดยผลิต( 10 , 000 กรัม)เป็น resuspended ในบัฟเฟอร์และสดพร่องมันเนยเป็นพร้อมด้วยลูกปัดแก้ว(ญี่ปุ่น 425-600 sigma-aldrich μ m ) หลังจาก ultracentrifugation ( 100 , 000 กรัม)เม็ดที่ขึ้นมาอีกครั้งด้วย A บัฟเฟอร์การเตรียมการขั้นสุดท้ายของ microsomes เป็นเม็ดเป็น resuspended ใน A .บัฟเฟอร์ความเข้มข้นของโซลูชันโปรตีนที่มีกำหนดการใช้ Bradford โปรตีนสอบ( bio-rad ยักษ์ไม่สหรัฐอเมริกา)โดยใช้ไข่ขาวซีรัมวัวอีกในฐานะที่เป็นมาตรฐาน