2.2. Collection and maintenance of

2.2. Collection and maintenance of experimental animals
Fingerlings of tilapia, O. mossambicus, were collected from the farm.
Healthy fingerlings were identified by comparing them with the
infected fishes showing the clinical symptoms of infection. Healthy
fish did not show any clinical sings. They were isolated and transported
in live condition in 20 l containers containing freshwater with continuous
battery powered aeration. They were maintained under laboratory
condition in 1000 l fiberglass tanks with continuous aeration in fresh
water. The water temperature was maintained between 28 and 30 °C.
2.3. Collection of medicinal plants
The plants used in the study A. indica, C. dactylon, O. tenuiflorum, and
P. niruriwere collected fromtheir natural environment in the neighboring
Thiruvannamalai District, Tamilnadu, India. They were identified by
referring to IndianMedicinal Plants (Warrier 1996). They were washed
with water to remove dust particles and then shade dried. The leaf
extracts of these plants were used for the study.
2.4. Preparation of plant extracts
Aqueous extracts of the leaveswere prepared separately by crushing
and soaking the leaves (5 g) in distilled water (100 ml) for 48 h. They
were then filtered and the filtrate was used for in vitro and in vivo
studies (Logambal et al., 2000).
2.5. Phytochemical assays
Phytochemical analysis of plant extract was done by following
standard procedures (Khan et al., 2010; Trease and Evans, 2002;
Sofowora, 1993; Harborne, 1973; Olabinri et al 2014). The prepared
plant extractswere subjected to the following phytochemical screening
tests. Tests were conducted to detect the presence of alkaloid according
to the method of Subathraa and Poonguzhali (2013) and flavonoid,
saponin, tannin, and cardiac glycoside (Premalatha et al. 2011;
Sadasivam and Manickam, 1996 and Subathraa and Poonguzhali,
2013). In addition, test was also carried out to detect the presence of
carbohydrates, quinines, glycosides, triterpenoids, phenols, coumarins,
proteins, steroids and phytosteroids, phlobatannins, and anthroquinone
following standard procedures.
2.6. Bacteriological analysis of fish pathogen
The organs (gills, liver, and skin) were dissected out from the
naturally infected fishes. Ten-fold serial dilutions of each organ were
made to avoid overgrowth of bacteria as described by (Bullock,
1971).The diluted samples (101 to 107) were inoculated onto nutrient
agar, Aeromonas agar, Pseudomonas agar, trypticase soy agar, and
thiosulfate citrate bile salt (TCBS agar) by the spread plate technique
(Collins and Lyne 1976). The plates were then incubated at 37 °C for
24–48 h. Bacterial colonies were examined carefully and counted.
Morphologically similar and dominant bacterial colonies were
selected and streaked onto nutrient agar plates in order to obtain pure
cultures. These pure cultures were maintained in nutrient agar for further
study. The suspected pure colonies were picked up and streaked
over their specific media for further purification. Pure colonies were
transferred into nutrient agar slant and stored at 4 °C for further
identification.
2.7. Identification of bacterial pathogen by rRNA sequencing:
Morphological, biological, physiological and biochemical characters
of the bacterial isolates isolated from the infected fishes were studied.
The bacterial isolates were biochemically characterized and identified
using Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Liquid cultures
used as inoculum for various tests were grown in peptone water. The
16S rRNA sequencing of the isolated organism was carried out for
further confirmation of the pathogen.
2.8. Preparation of bacterial inoculum
The bacterial culture was grown on Pseudomonas agar and Nutrient
agar for use in pathogenecity experiments. The plates were incubated
at 37 °C for 24 h. The pathogenicity of the bacterial isolate was tested
by bath exposure and intramuscular injection. The bacterial count was
determined by standard dilution and plating methods as described by
(Ducklow et al., 1980).
2.9. Experimental pathogenecity
Experimental pathogenecity of C. freundii in healthy fish was studied
by intramuscular and immersion methods according to the standard
method of (Thanigaivel et al. 2014 and Thomas et al., 2013a). Control
fish received only sterile PBS buffer. The experiment was conducted in
triplicates. Animalswere checked twice a day for symptoms andmortality.
Dead animals were removed and stored for further studies.
3. Toxicity profile and optimum exposure of the plant extracts
Toxicity study was done according to method of Thanigaivel et al.
2014. The infected fishes with clinical signs were collected and reared
separately in sterile freshwater treated with a concentration of
250 mg/l of each plant extract separately. In the case of intramuscular
injection, 25 μl of extract was injected intramuscularly, and the fishes
challenged with bacteria after third dose (Thomas et al., 2013b).
3.1. Antibacterial activity
3.1.1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. รวบรวมและบำรุงรักษาของสัตว์ทดลองชนิดของปลานิล ปลาหมอเทศโอ ถูกเก็บรวบรวมจากฟาร์มระบุชนิดเพื่อสุขภาพ โดยการเปรียบเทียบกับการปลาติดเชื้อที่แสดงอาการทางคลินิกของการติดเชื้อ มีสุขภาพดีปลาไม่ได้แสดงการร้องเพลงทางคลินิก พวกเขาแยก และขนส่งในสภาพที่สดใน 20 l ภาชนะที่ประกอบด้วยน้ำจืดที่ มีอย่างต่อเนื่องแบตเตอรี่ขับเคลื่อนอากาศ พวกเขายังคงไว้ภายใต้ห้องปฏิบัติการเงื่อนไขในถังไฟเบอร์กลาส 1000 l กับอากาศอย่างต่อเนื่องในสดน้ำ อุณหภูมิของน้ำถูกรักษาไว้ระหว่าง 28 ถึง 30 องศาเซลเซียส2.3 การเก็บพืชสมุนไพรพืชที่ใช้ในการศึกษา A. indica, C. แพรก โอ tenuiflorum และP. niruriwere fromtheir รวบรวมธรรมชาติสิ่งแวดล้อมในการThiruvannamalai ริค Tamilnadu อินเดีย พวกเขาระบุไว้โดยหมายถึงพืช IndianMedicinal (Warrier 1996) พวกเขาถูกล้างน้ำกำจัดฝุ่น อนุภาค และโป๊ะแห้ง ใบสารสกัดจากพืชเหล่านี้ถูกใช้สำหรับการศึกษา2.4 การเตรียมสารสกัดจากพืชสารสกัดน้ำของ leaveswere ที่เตรียม โดยการบดแยกแช่ใบ (5 กรัม) กลั่นน้ำ (100 มล.) สำหรับ 48 พวกเขาได้รับการกรองแล้ว และการกรองถูกใช้ในหลอดทดลอง และในสัตว์ทดลองศึกษา (Logambal et al. 2000)2.5 assays สารพฤกษเคมีทำการวิเคราะห์สารพฤกษเคมีของสารสกัดจากพืชตามตามขั้นตอนมาตรฐาน (Khan et al. 2010 Trease และอีแวนส์ 2002Sofowora, 1993 ฮาร์เบอร์เนฮอลล์ 1973 Olabinri et al 2014) การเตรียมตรวจพืช extractswere การต่อสารพฤกษเคมีทดสอบ ทำการตรวจสอบของอัลคาลอยตามวิธีการ Subathraa และ Poonguzhali (2013) และ flavonoidซาโปนิ คะแนน และแอก (Premalatha et al. 2011Sadasivam และ Manickam, 1996 และ Subathraa และ Poonguzhali2013) ., ทดสอบยังดำเนินการตรวจสอบของคาร์โบไฮเดรต quinines, glycosides, triterpenoids วิทยาศาสตร์ coumarinsโปรตีน เตียรอยด์ และ phytosteroids, phlobatannins และ anthroquinoneวิธีการมาตรฐานต่อไปนี้2.6 วิเคราะห์แบคทีเรียเชื้อโรคปลาอวัยวะ (เหงือก ตับ และผิว) ถูก dissected ออกจากการปลาที่ติดเชื้อตามธรรมชาติ Ten-fold อนุกรม dilutions ของแต่ละอวัยวะได้ทำเพื่อหลีกเลี่ยงการ overgrowth ของแบคทีเรียดังที่แสดง โดย (บูลล็อคปี 1971) ตัวอย่างที่เจือจาง (101 ถึง 107) ที่ inoculated ลงในสารอาหารอาหาร อาหาร Aeromonas, Pseudomonas อาหาร trypticase ถั่วเหลือง อาหาร และthiosulfate ซิเตรตเกลือน้ำดี (TCBS agar) โดยแผ่นเทคนิคแพร่(คอลลินส์และ Lyne 1976) แผ่นได้แล้วได้รับการกกที่ 37 ° C สำหรับอาณานิคมแบคทีเรีย h. 24 – 48 ถูกตรวจสอบอย่างระมัดระวัง และนับมีอาณานิคมแบคทีเรียคล้าย morphologically และโดดเด่นแผ่นเป็นริ้วบน และเลือกอาหารที่สารอาหารเพื่อให้ได้ความบริสุทธิ์วัฒนธรรม วัฒนธรรมเหล่านี้บริสุทธิ์ยังคงไว้ในอาหารสารอาหารสำหรับเพิ่มเติมการศึกษา อาณานิคมบริสุทธิ์สงสัยรับ และลายผ่านการสื่อเฉพาะทางเพิ่มเติม อาณานิคมที่บริสุทธิ์ได้โอนไปเอียงอาหารสารอาหาร และเก็บไว้ที่ 4 ° C สำหรับเพิ่มเติมรหัส2.7. รหัสของเชื้อแบคทีเรียโดยลำดับ rRNA:อักขระสัณฐาน ชีวภาพ สรีรวิทยา และชีวเคมีของการแยกออกแบคทีเรียที่แยกได้จากปลาติดเชื้อได้ศึกษาแยกเชื้อแบคทีเรียลักษณะ biochemically และระบุใช้ของ Bergey คู่มือของ Determinative Bacteriology วัฒนธรรมของเหลวใช้เป็น inoculum สำหรับการทดสอบต่าง ๆ ที่ปลูกในน้ำ peptone การ16S rRNA ลำดับของสิ่งมีชีวิตหนึ่ง ๆ ถูกดำเนินการสำหรับยืนยันเพิ่มเติมของเชื้อ2.8 การเตรียม inoculum แบคทีเรียถูกปลูกวัฒนธรรมเชื้อแบคทีเรีย Pseudomonas อาหารและสารอาหารอาหารสำหรับใช้ในการทดลองของ pathogenecity แผ่นได้รับการกกที่ 37 ° C ใน 24 h ทดสอบโปรตีนแบคทีเรีย pathogenicity อยู่สัมผัสการอาบน้ำและฉีดเข้ากล้ามเนื้อ การนับจำนวนแบคทีเรียได้ถูกกำหนด โดยมาตรฐานเจือจางและวิธีชุบโดย(Ducklow et al. 1980)2.9 การทดลอง pathogenecityเป็นศึกษาทดลอง pathogenecity ของ freundii C. ในปลาที่มีสุขภาพดีโดยเข้ากล้ามเนื้อ และวิธีแช่ตามมาตรฐานวิธีการ (Thanigaivel et al. 2014 และ Thomas et al. 2013a) ควบคุมปลาได้รับบัฟเฟอร์ PBS เป็นหมันเท่านั้น ดำเนินการทดลองtriplicates Animalswere การตรวจสอบสองครั้งต่อวันสำหรับอาการ andmortalityสัตว์ที่ตายถูกลบออก และเก็บไว้ศึกษาต่อไป3. แสงโปรไฟล์และที่เหมาะสมความเป็นพิษของสารสกัดจากพืชทำการศึกษาความเป็นพิษตามวิธีของ Thanigaivel et al2014. ปลาติดเชื้อ มีอาการทางคลินิกได้รวบรวม และผลิตภัณฑ์แยกเป็นหมันปลารับการปฏิบัติ ด้วยความเข้มข้นของ250 mg/l แต่ละโรงงานแยกต่างหาก ในกรณีเข้ากล้ามเนื้อฉีด μl 25 ของสารสกัดคือฉีดเข้ากล้ามเนื้อ และปลาท้าทายกับแบคทีเรียหลังจากยาสาม (Thomas et al. 2013b)3.1. แบคทีเรีย3.1.1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 การเก็บและการบำรุงรักษาสัตว์ทดลอง
ลูกปลาของปลานิลทุม mossambicus ถูกเก็บรวบรวมจากฟาร์ม.
ปลาเพื่อสุขภาพที่ถูกระบุโดยเปรียบเทียบกับ
ปลาติดเชื้อที่แสดงอาการของการติดเชื้อ เพื่อสุขภาพ
ปลาไม่ได้แสดงทางคลินิกใด ๆ ร้องเพลง พวกเขาถูกแยกและการขนส่ง
ในสภาพที่อาศัยอยู่ในภาชนะบรรจุ 20 ลิตรที่มีน้ำจืดที่มีอย่างต่อเนื่อง
แบตเตอรี่เติมอากาศ พวกเขาได้รับการดูแลภายใต้การตรวจทางห้องปฏิบัติการ
สภาพ 1000 ถังไฟเบอร์กลาส L กับอากาศอย่างต่อเนื่องในผลไม้สด
น้ำ อุณหภูมิของน้ำที่ถูกเก็บรักษาไว้ระหว่างวันที่ 28 และ 30 ° C.
2.3 คอลเลกชันของพืชสมุนไพร
พืชที่ใช้ในการศึกษา A. indica ซี dactylon ทุม tenuiflorum และ
พี niruriwere รวบรวม fromtheir สภาพแวดล้อมทางธรรมชาติในประเทศเพื่อนบ้าน
Thiruvannamalai อำเภอทมิฬนาฑูอินเดีย พวกเขาถูกระบุ
หมายถึงพืช IndianMedicinal (Warrier 1996) พวกเขาถูกล้าง
ด้วยน้ำเพื่อเอาฝุ่นละอองแล้วที่ร่มแห้ง ใบ
สารสกัดจากพืชเหล่านี้ถูกนำมาใช้สำหรับการศึกษา.
2.4 การเตรียมสารสกัดจากพืช
สารสกัดด้วยน้ำของ leaveswere เตรียมแยกกันโดยเด็ดขาด
และแช่ใบ (5 กรัม) ในน้ำกลั่น (100 มล.) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง พวกเขา
ถูกกรองแล้วกรองที่ใช้สำหรับในหลอดทดลองและในร่างกาย
การศึกษา (Logambal et al., 2000).
2.5 ชุดตรวจสารพฤกษเคมี
วิเคราะห์พฤกษเคมีของสารสกัดจากพืชที่ได้กระทำโดยทำตาม
ขั้นตอนมาตรฐาน (ข่าน et al, 2010;. Trease อีแวนส์และ 2002;
Sofowora 1993; ฮาร์ 1973; Olabinri et al, 2014) เตรียม
พืช extractswere ภายใต้การตรวจคัดกรองสารพฤกษเคมีต่อไปนี้
การทดสอบ การทดสอบได้รับการดำเนินการเพื่อตรวจสอบสถานะของอัลคาลอยตาม
วิธีการของ Subathraa และ Poonguzhali (2013) และ flavonoid ที่
ซาโปนินแทนนินและการเต้นของหัวใจ glycoside (Premalatha et al, 2011.
Sadasivam และ Manickam, ปี 1996 และ Subathraa และ Poonguzhali,
2013) นอกจากนี้การทดสอบยังได้ดำเนินการตรวจสอบสถานะของ
คาร์โบไฮเดรต quinines ไซด์ triterpenoids ฟีนอล coumarins,
โปรตีน, เตียรอยด์และ phytosteroids, phlobatannins และ anthroquinone
ตามขั้นตอนมาตรฐาน.
2.6 การวิเคราะห์ทางแบคทีเรียของเชื้อโรคปลา
อวัยวะ (เหงือกตับและผิวหนัง) ถูกผ่าออกจาก
ปลาที่ติดเชื้อตามธรรมชาติ สิบเท่าเจือจางอนุกรมของแต่ละอวัยวะที่ถูก
สร้างขึ้นมาเพื่อหลีกเลี่ยงการ overgrowth ของเชื้อแบคทีเรียตามที่อธิบาย (วัว
1971) ได้โดยง่ายตัวอย่างเจือจาง (101-107) ถูกเชื้อเข้าสู่สารอาหาร
วุ้น Aeromonas วุ้น Pseudomonas วุ้นวุ้นถั่วเหลือง trypticase และ
ไทโอซัลเฟต เกลือน้ำดีซิเตรต (TCBS agar) โดยใช้เทคนิคการแพร่กระจายแผ่น
(คอลลินน์และ 1976) แผ่นถูกบ่มแล้วที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
24-48 ชั่วโมง แบคทีเรียที่มีการตรวจสอบอย่างรอบคอบและนับ.
สัณฐานคล้ายกันและที่โดดเด่นแบคทีเรียที่ถูก
เลือกและลายลงบนแผ่นวุ้นสารอาหารเพื่อให้ได้บริสุทธิ์
วัฒนธรรม เชื้อบริสุทธิ์เหล่านี้ถูกเก็บรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อต่อการ
ศึกษา สงสัยอาณานิคมบริสุทธิ์ถูกหยิบขึ้นมาและลาย
ผ่านสื่อเฉพาะของพวกเขาสำหรับการทำให้บริสุทธิ์ต่อไป อาณานิคมบริสุทธิ์ถูก
โอนเข้าสารอาหารวุ้นเอียงและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลาต่อ
บัตรประจำตัว.
2.7 บัตรประจำตัวของเชื้อแบคทีเรียโดย rRNA ลำดับ:
ทางสัณฐานวิทยาชีวภาพทางสรีรวิทยาและชีวเคมีตัวละคร
ของแบคทีเรียที่แยกได้จากปลาที่ติดเชื้อได้ศึกษา.
แบคทีเรียมีลักษณะทางชีวเคมีและระบุ
วิธีใช้คู่มือ Bergey ของแบคทีเรียที่กำหนด วัฒนธรรมของเหลว
ใช้เป็นหัวเชื้อสำหรับการทดสอบต่าง ๆ ที่ปลูกในน้ำเปปโตน
ลำดับ 16S rRNA ของสิ่งมีชีวิตบางแห่งได้ดำเนินการสำหรับ
การยืนยันต่อไปของเชื้อโรค.
2.8 เตรียมความพร้อมของเชื้อแบคทีเรีย
วัฒนธรรมแบคทีเรียที่ถูกปลูกใน Pseudomonas agar และธาตุอาหาร
วุ้นสำหรับการใช้งานในการทดลองก่อให้เกิดโรค แผ่นถูกบ่ม
ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ทำให้เกิดโรคของเชื้อแบคทีเรียได้รับการทดสอบ
จากการสัมผัสอาบน้ำและฉีดเข้ากล้ามเนื้อ นับแบคทีเรียถูก
กำหนดโดยมาตรฐานการเจือจางและชุบวิธีการตามที่อธิบาย
(Ducklow et al., 1980).
2.9 ก่อให้เกิดโรคทดลอง
ก่อให้เกิดโรคจากการทดลองของซี freundii ในปลาที่มีสุขภาพดีได้ศึกษา
โดยการฉีดเข้ากล้ามเนื้อและแช่วิธีการตามมาตรฐาน
วิธีการ (Thanigaivel et al. ปี 2014 และโทมัส et al., 2013a) ควบคุม
ปลาได้รับเพียงบัฟเฟอร์พีบีเอสผ่านการฆ่าเชื้อ การทดลองที่ได้ดำเนินการใน
triplicates Animalswere ตรวจสอบวันละสองครั้งสำหรับอาการ andmortality.
สัตว์ที่ตายแล้วถูกถอดออกและเก็บไว้สำหรับการศึกษาต่อไป.
3 ประวัติความเป็นพิษและความเสี่ยงที่เหมาะสมของสารสกัดจากพืช
ศึกษาพิษได้ทำตามวิธีการของ Thanigaivel et al.
2014 ปลาติดเชื้อที่มีอาการทางคลินิกที่ถูกเก็บรวบรวมและการเลี้ยงดู
แยกต่างหากในน้ำจืดที่ผ่านการฆ่าเชื้อได้รับการรักษาที่มีความเข้มข้นของ
250 mg / l ของแต่ละสารสกัดจากพืชที่แยกจากกัน ในกรณีของกล้าม
ฉีด 25 ไมโครลิตรของสารสกัดถูกฉีดเข้ากล้ามเนื้อและปลา
ท้าทายกับแบคทีเรียหลังจากทานยาที่สาม (โทมัส et al., 2013b).
3.1 ฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย
3.1.1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การเก็บและรักษาสัตว์ทดลองลูกปลาของปลานิล . mossambicus ถูกรวบรวมจากฟาร์มลูกปลาแข็งแรงถูกระบุโดยการเปรียบเทียบกับปลาติดเชื้อที่แสดงอาการของการติดเชื้อ สุขภาพปลาไม่แสดงอาการร้อง พวกเขาแยกและขนส่งสภาพอยู่ในภาชนะบรรจุ 20 ลิตรหินอย่างต่อเนื่องเติมพลังแบตเตอรี่ พวกเขาถูกเก็บรักษาไว้ใน ห้องปฏิบัติการเงื่อนไขใน 1000 ลิตร ถังไฟเบอร์กลาส อากาศสดอย่างต่อเนื่องน้ำ น้ำยังคงระหว่าง 28 และ 30 องศา2.3 คอลเลกชันของพืชสมุนไพรพืชที่ใช้ในการศึกษา dactylon A . indica , C , O . tenuiflorum , และหน้า niruriwere เก็บสิ่งแวดล้อมธรรมชาติทางเพื่อนบ้านthiruvannamalai District , Tamilnadu , อินเดีย พวกเขาถูกพบโดยหมายถึงพืช indianmedicinal ( warrier 1996 ) พวกเขาถูกล้างกับน้ำเพื่อเอาอนุภาคฝุ่นและสีแห้ง ใบไม้สารสกัดจากพืชเหล่านี้ถูกนำมาใช้ในการศึกษา2.4 . การเตรียมสารสกัดจากพืชน้ำสกัดจาก leaveswere เตรียมโดยบดแยกและเปียกใบ ( 5 กรัม ) ในน้ำ ( 100 มล. ) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง พวกเขาแล้วกรองและการกรองใช้ในหลอดทดลองและในสัตว์ทดลองการศึกษา ( logambal et al . , 2000 )2.5 พฤกษเคมี )การวิเคราะห์ทางพฤกษเคมีสารสกัดจากพืช ทำได้โดยต่อไปนี้ขั้นตอนมาตรฐาน ( ข่าน et al . , 2010 ; trease และอีแวนส์ , 2002 ;sofowora , 1993 ; harborne 1973 ; olabinri et al 2014 ) ที่เตรียมไว้พืช extractswere ภายใต้การคัดกรองทางพฤกษเคมีดังต่อไปนี้แบบทดสอบ การทดสอบได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบสถานะของอัลคาลอยด์ตามวิธีการ subathraa ( 2013 ) และฟลาโวนอยด์ และ poonguzhali ,saponin , แทนนิน , และการแยกแบบโซเลสกี้ ( premalatha et al . 2011 ;และ sadasivam manickam , 1996 และ subathraa poonguzhali และ ,2013 ) นอกจากนี้ การทดสอบดำเนินการตรวจสอบการแสดงตนของคาร์โบไฮเดรต quinines glycosides ฟีนอล , ไตรเทอร์คูมาริน , , ,โปรตีน , เตียรอยด์และ phytosteroids phlobatannins , และ , รแ โทรควิโนนตามขั้นตอนมาตรฐาน2.6 การวิเคราะห์แบคทีเรียเชื้อโรคของปลาอวัยวะ ( เหงือก ตับ ไต และผิวหนัง ) ถูกตัดออกจากไวรัสตามธรรมชาติของมันแล้ว วิธีการพับ 10 ของแต่ละอวัยวะเป็นอนุกรมทำเพื่อหลีกเลี่ยงการ overgrowth แบคทีเรียตามที่อธิบายไว้โดย ( วัว1971 ) เจือจางตัวอย่าง ( 101 ถึง 107 ) ปลูกเชื้อบนอาหารวุ้น เชื้อ Pseudomonas วุ้น , วุ้น , TrueCrypt , และไธโอซัลเฟตซิเตรตเกลือน้ำดี ( มาตรฐาน Agar ) โดยกระจายแผ่นเทคนิค( คอลลินและไลน์ 1976 ) จาน แล้วบ่มที่ 37 ° C สำหรับ24 - 48 ชั่วโมง แบคทีเรียโคโลนีถูกตรวจสอบอย่างรอบคอบและนับจากที่คล้ายกันและเด่นจากอาณานิคมคือเลือก และลายบนแผ่นวุ้นสารอาหารเพื่อให้ได้เพียววัฒนธรรม เชื้อบริสุทธิ์เหล่านี้ถูกเก็บรักษาไว้ใน NUMB3RS เพิ่มเติมการศึกษา สงสัยบริสุทธิ์อาณานิคมได้ถูกหยิบขึ้นมาและลายผ่านสื่อเฉพาะของตนให้บริสุทธิ์ต่อไป บริสุทธิ์เป็นอาณานิคมย้ายลงในอาหารเลี้ยงเชื้อสารอาหารเอียงและเก็บไว้ที่ 4 ° C ต่อไปรหัส2.7 . การจำแนกชนิดของแบคทีเรียเชื้อโรคโดย rRNA ลำดับ :ลักษณะทางสัณฐานวิทยา ชีววิทยา สรีรวิทยา และชีวเคมี อักขระของแบคทีเรียสายพันธุ์ที่แยกได้จากปลาที่ติดเชื้อได้จากแบคทีเรียไอโซเลทและระบุ biochemically ลักษณะใช้วิธีตามคู่มือของตัวกำหนดแบคทีเรีย . วัฒนธรรมของของเหลวใช้เป็นกล้าเชื้อสำหรับการทดสอบต่างๆที่ปลูกในเปปโตนน้ำ ที่ลำดับเบส 16S rRNA ของสิ่งมีชีวิตพบว่าแยกได้การยืนยันต่อไปของเชื้อโรค2.8 . การเตรียมเชื้อแบคทีเรียแบคทีเรีย Pseudomonas และสารอาหารที่ปลูกบนวุ้นpathogenecity วุ้นเพื่อใช้ในการทดลอง จานถูกบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง โดยการแยกเชื้อได้ถูกทดสอบโดยการอาบ และฉีด . นับแบคทีเรียคือโดยการกำหนดมาตรฐานและวิธีการตามที่อธิบายไว้โดยการชุบ( ducklow et al . , 1980 )2.9 . ทดลอง pathogenecitypathogenecity ทดลองของ freundii ในปลาเพื่อสุขภาพ )โดยการฉีดแช่วิธีการตามมาตรฐานวิธีการ ( thanigaivel et al . 2014 และโทมัส et al . , ที่มีมากกว่า ) การควบคุมปลาได้รับเป็นหมัน pbs buffer โดยทำการทดลองในล้อม . animalswere ตรวจสอบสองวันสำหรับ andmortality อาการสัตว์ที่ตายแล้วถูกถอดออกและเก็บไว้เพื่อการศึกษาต่อไป3 . ประวัติและความเป็นพิษของสารสกัดพืชแสงที่เหมาะสมการศึกษาความเป็นพิษได้ตามวิธีของ thanigaivel et al .2014 . ปลาที่มีอาการติดเชื้อในการเก็บรวบรวมและเลี้ยงแยกปลอดเชื้อน้ำจืดปฏิบัติกับความเข้มข้นของ250 มิลลิกรัมต่อลิตรของแต่ละโรงงานที่แยกต่างหาก ในกรณีของการฉีดฉีด , 25 μลิตรฉีดสกัดไฟ และปลาท้าทายกับแบคทีเรีย หลังจากปริมาณที่สาม ( Thomas et al . , 2013b )3.1 . ฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย3 .