20ug/mL), so I add 0.5mL of the CAS

20ug/mL), so I add 0.5mL of the CASTA stock to 9.5mL of RPMI-10% (400ug/mL x 0.5mL = 200ug in 10mL, or 20ug/mL).
5.18. The CMV antigen is a liquid that comes in a 5mL vial. I need 10mL of a 1:5 dilution, so I add 2mL of the CMV stock to 8mL of RPMI -10%.
5.19. The remaining CASTA and CMV antigen from the stock vials can be transferred aseptically to small cryovials and stored at –70°C.
5.20. Preparation of plates:
5.20.1. Tissue culture plates should be prepared in advance and stored in sealable plastic bags at –70°C. The preparation of a large number of plates in advance increases the uniformity of antigen addition and facilitates the rapid processing of a large number of blood specimens.
5.20.2. Obtain plate diagram (i.e. “worksheet”, “template”) for the LPA from the PIIS. The PIIS should also specify whether assays will be run in triplicate or quadruplicate. It is essential that all sites performing a given study place antigens in the same positions on the plate.
5.20.3. Dispense 100μL/well of each 2X concentration antigen/mitogen in strict accordance with the plate diagram provided. For control wells, dispense 100μL of RPMI -10% (see note in Section 5, Detailed Protocol, if RPMI -20% is preferred).
5.21. Preparation of [3H]TdR:
5.21.1. The final concentration of [3H]TdR should be 1μCi/well. Calculate the volume of diluted [3H]TdR needed to dispense 25μL/well, equaling 1μCi/well (number of assay wells x 25μL/well = minimum volume to prepare). For example, the [3H]TdR stock is at 1mCi/mL. A working solution of 40μCi/mL in RPMI-0 (or D-PBS) should be prepared. Dilute the [3H]TdR stock 1:25 with RPMI-0 (0.5mL of stock + 12mL media). This is enough to pulse 500 wells. Add 25μL/well to give a final concentration of 1.0μCi/well. The diluted [3H]TdR can be stored at 4°C for a month.
5.22. Preparation of PBMCs
5.22.1. Check the consensus protocol for preparation of PBMCs found in the Virology Manual for HIV Laboratories, “Preparation of PHA-stimulated uninfected donor peripheral blood mononuclear cells” on the web at: http://www.niaid.nih.gov/daids/vir_manual/.
5.22.2. If the blood collection tube has been spun to obtain the plasma fraction, D-PBS or RPMI-0 equal to the original volume of the plasma must be added to the tube. Now add sterile D-PBS or RPMI -0 equal to the volume of blood so that the volume is 2X the original volume.
5.22.3. Overlay diluted blood on Ficoll-hypaque.
5.22.4. Centrifuge at 300-400 x g for 30 minutes in a room temperature centrifuge (20° to 25°C). Make sure the centrifuge brake is turned off.
5.22.5. Harvest the PBMC from the interface and immediately wash two or three times in D-PBS or RPMI -0, centrifuging at 200 x g for 12 minutes at room temperature. Minimize delay time between washes. After washing,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

20ug/ml) ดังนั้นฉันเพิ่ม 0.5ml ของหุ้น Casta ไป 9.5ml ของ RPMI-10% (400ug/ml x 0.5ml = 200ug ใน 10ml หรือ 20ug/ml).
5.18 แอนติเจน CMV เป็นของเหลวที่มาในขวด 5 ml ฉันต้องการ 10ml จากการเจือจาง 1:05 ดังนั้นฉันเพิ่ม 2ml ของหุ้น CMV ไป 8ml ของ RPMI -10%.
5.19 Casta ที่เหลือและแอนติเจน CMV จากขวดหุ้นสามารถโอนปลอดเชื้อเพื่อ cryovials ขนาดเล็กและเก็บไว้ที่ -70 ° C.
5.20การเตรียมความพร้อมของแผ่น:
5.20.1 จานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อควรเตรียมล่วงหน้าและเก็บไว้ในถุงพลาสติก sealable ที่ -70 ° C การเตรียมความพร้อมของจำนวนมากของแผ่นล่​​วงหน้าเพิ่มขึ้นนอกเหนือจากความสม่ำเสมอของแอนติเจนและอำนวยความสะดวกในการประมวลผลอย่างรวดเร็วของจำนวนมากของตัวอย่างเลือด.
5.20.2 ได้รับแผนภาพแผ่น (คือ "แผ่น", "แม่") เพื่อ LPA จาก piispiis ก็ควรที่จะระบุว่าการตรวจจะถูกเรียกใช้ในเพิ่มขึ้นสามเท่าหรือ quadruplicate มันเป็นสิ่งจำเป็นที่ทุกเว็บไซต์การแสดงแอนติเจนที่ได้รับการศึกษาที่อยู่ในตำแหน่งเดียวกันบนแผ่น.
5.20.3 แจกจ่าย100μl/wellความเข้มข้นของแอนติเจนแต่ละ 2x / mitogen อย่างเคร่งครัดตามแผนภาพแผ่นที่ให้มา สำหรับการควบคุมบ่อยา100μlของ RPMI -10% (ดูหมายเหตุในมาตรา 5,โปรโตคอลรายละเอียดถ้า RPMI% -20 เป็นที่ต้องการ).
5.21 การเตรียมการของ [3h] TDR:
5.21.1 ความเข้มข้นสุดท้ายของ [3h] TDR ควรจะ1μ​​ci/well คำนวณปริมาณการเจือจาง [3h] TDR ที่จำเป็นในการจ่ายยา25μl/wellเท่ากับ1μci/well (จำนวนทดสอบหลุม25μl/well x = ปริมาณขั้นต่ำในการเตรียมความพร้อม) ตัวอย่างเช่น [3h] หุ้น TDR ที่ 1mci/mlวิธีการทำงานของ40μci/mlใน RPMI-0 (หรือ D-PBS) ควรจะเตรียมพร้อม เจือจาง [3h] TDR 01:25 หุ้นด้วย RPMI-0 (0.5ml ของสื่อหุ้น 12ml) นี้ก็เพียงพอที่จะชีพจร 500 หลุม เพิ่ม25μl/wellที่จะให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ1.0μci/well ปรับลด [3h] TDR สามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลาหนึ่งเดือน.
5.22 การเตรียมการของ PBMCs
5.22.1ตรวจสอบโปรโตคอลฉันทามติในการจัดทำ PBMCs ที่พบในไวรัสวิทยาคู่มือสำหรับห้องปฏิบัติการเอชไอวี "เตรียมผากระตุ้นผู้บริจาคอุปกรณ์ต่อพ่วงที่ไม่ติดเชื้อเซลล์โมโนนิวเคลียร์เลือด" บนเว็บได้ที่: http://www.niaid.nih.gov/daids/vir_manual /.
5.22.2 ถ้าหลอดเก็บเลือดที่ได้รับการหมุนเพื่อให้ได้เศษพลาสม่า,d-พีบีเอสหรือ RPMI-0 เท่ากับปริมาณเดิมของพลาสม่าต้องเพิ่มหลอด ตอนนี้เพิ่มเป็นหมัน d-พีบีเอสหรือ RPMI -0 เท่ากับปริมาณของเลือดเพื่อให้ปริมาณการซื้อขาย 2x ปริมาณเดิม.
5.22.3 ซ้อนทับเจือจางเลือดบน Ficoll-hypaque.
5.22.4 centrifuge ที่ 300-400 XG เป็นเวลา 30 นาทีในการหมุนเหวี่ยงที่อุณหภูมิห้อง (20 °ถึง 25 ° C) ให้แน่ใจว่าเบรค centrifuge ถูกปิด.
5.22.5เก็บเกี่ยว PBMC จากอินเตอร์เฟซและทันทีที่ล้างสองหรือสามครั้งใน d-พีบีเอสหรือ RPMI -0 การเหวี่ยงที่ 200 XG สำหรับ 12 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ลดความล่าช้าเวลาระหว่างการล้าง หลังการทำความสะอาด,

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

20ug/mL), ดังนั้นฉันเพิ่ม 0.5 mL ของหุ้น CASTA 9.5 mL ของ RPMI - 10% (400ug/mL x 0.5 mL = 200ug 10 mL หรือ 20ug/mL).
5.18 ตรวจหา CMV เป็นของเหลวที่คอนแทค 5mL ต้อง 10mL ของการเจือจาง 1:5 เพื่อไม่เพิ่มมล 2 หุ้น CMV 8mL ของ RPMI -10%
5.19 เหลือ CASTA และ CMV จาก vials หุ้นสามารถจะโอน aseptically ให้ cryovials เล็ก และเก็บไว้ที่ –70 ° C.
5.20 เตรียมแผ่น:
5.20.1 แผ่นเยื่อควรเตรียมไว้ล่วงหน้า และเก็บไว้ในถุงพลาสติก sealable ที่ –70 องศาเซลเซียส การเตรียมแผ่นจำนวนมากเพิ่มความรื่นรมย์นี้ตรวจหา และอำนวยความสะดวกในการประมวลผลอย่างรวดเร็วของจำนวนเลือดไว้เป็นตัวอย่างล่วงหน้า
5.20.2 ขอรับแผ่นไดอะแกรม (เช่น "แผ่นงาน" "แม่") สำหรับ LPA จะจาก PIIS PIIS ควรยังระบุว่า assays จะรันใน triplicate หรือ quadruplicate มันเป็นสิ่งสำคัญว่า ไซต์ทั้งหมดที่ทำการศึกษากำหนดวาง antigens ในตำแหน่งเดียวกันบนแผ่น
5.20.3 ป้ายสินค้า 100μL/ดี ของแต่ละ 2 X เข้มข้นตรวจ หา/mitogen ในเข้มงวดกับไดอะแกรมจานให้ สำหรับควบคุมบ่อ ป้ายสินค้า 100μL RPMI -10% (ดูหมายเหตุในส่วน 5 โพรโทคอลรายละเอียด ถ้า RPMI -20% เป็นที่ต้องการ) .
รถด่วน การเตรียมการของ TdR [3H]:
5.21.1 ความเข้มข้นสุดท้ายของ [3H] TdR ควรจะ 1μCi/ดี คำนวณปริมาตรของแตกออก [3H] TdR ต้องป้ายสินค้า 25μL/ดี, 1μCi equaling ดี (จำนวนทดสอบ wells x 25μL/ดี =ปริมาณต่ำสุดเพื่อเตรียมความพร้อม) ตัวอย่าง หุ้น TdR [3H] อยู่ที่ 1mCi/mL ควรจะเตรียมการแก้ปัญหาการทำงานของ 40μCi/mL ใน RPMI 0 (หรือ D-PBS) Dilute 1:25 กับ RPMI-0 (0.5 มล.สื่อ 12 mL หุ้น) หุ้น TdR [3H] นี่คือบ่อชีพจร 500 พอ เพิ่ม 25μL/ดี เพื่อให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 1.0μCi / ดี การแตกออก [3H] TdR สามารถจัดเก็บที่ 4° C ในเดือนมี.
5.22 การเตรียมการของ PBMCs
5.22.1 ตรวจสอบโพรโทคอลช่วยในการเตรียมการของ PBMCs ที่พบในคู่มือชเป็นสำหรับห้องปฏิบัติการเชื้อเอชไอวี "เตรียมความพร้อมของอุปกรณ์ต่อพ่วงผาถูกกระตุ้นบริจาคเชื้อเลือดเซลล์ mononuclear" บนเว็บที่: http://www.niaid.nih.gov/daids/vir_manual/.
5.22.2 ถ้ามีการปั่นหลอดเก็บเลือดรับเศษพลา D-PBS หรือ RPMI 0 มีค่าเท่ากับไดรฟ์ข้อมูลต้นฉบับของพลาสมาต้องเพิ่มท่อ เพิ่มใส่ D-PBS หรือ RPMI-0 เท่ากับปริมาตรของเลือดที่ปริมาตร 2 X เดิมเสียง.
5.22.3 วางทับเลือดแตกออกใน Ficoll-hypaque.
5.22.4 Centrifuge ที่ 300-400 g x 30 นาทีในเครื่องหมุนเหวี่ยงอุณหภูมิห้อง (25° c 20°) แน่ใจเบรคเครื่องหมุนเหวี่ยง ความเกลียด off.
5.22.5 เก็บเกี่ยว PBMC จากอินเตอร์เฟซ และทันทีล้างครั้งที่สอง หรือสามใน D-PBS หรือ RPMI-0, centrifuging ที่ 200 กรัม x 12 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ลดเวลาหน่วงเวลาระหว่าง washes หลังจากซักผ้า

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

20 UG /มล.),ผมเพิ่ม 0.5 มล.ของ casta หุ้นถึง 9.5 มล. rpmi 10% ( 400 UG /มล. x 0.5 = 200 มล. UG ใน 10 มล.,หรือ 20 UG /มิลลิลิตร). N 5.18 . Antigen cmv ที่มีขวดน้ำยาที่มาพร้อมกับ 5 มล.ที่ ฉันจำเป็นต้อง 10 มล.ของ 1 : 5 เจือจางลงผมดังนั้นผมเพิ่ม 2 มล.ของตลาดหลักทรัพย์ฯ cmv ที่ 8 มล.ของ rpmi 10% .
5.19 casta cmv Antigen และส่วนที่เหลือจาก vials หุ้นที่สามารถโอนไปยัง cryovials aseptically ขนาดเล็กและจัดเก็บไว้ที่ 70 ° C
5.20การเตรียมการของแผ่นทำความร้อน:
5.20.1 . แผ่นทำความร้อนวัฒนธรรมเนื้อเยื่อควรจะต้องเตรียมการล่วงหน้าและจัดเก็บไว้ในถุงพลาสติก sealable .ที่ 70 ° การเตรียมการของขนาดใหญ่จำนวนมากที่ของแผ่นทำความร้อนเป็นการล่วงหน้าเพิ่มขึ้นความสม่ำเสมอของนอกจากนี้ยัง, Antigen for และจะช่วยเพิ่มความสะดวกในการประมวลผลอย่างรวดเร็วของหมายเลขขนาดใหญ่ของตัวอย่างเลือด.
5.20.2 ขอรับแผ่น ภาพ (เช่น "เวิร์กชีท","เทมเพลต")สำหรับ lpa จาก piis .piis ควรจะระบุว่า assays จะเรียกใช้งานในสี่หรือเป็นสามยัง เป็นสิ่งจำเป็นอย่างยิ่งที่ทุกไซต์การศึกษาให้เป็นสถานที่ antigens ในตำแหน่งเดียวกันนี้ในแผ่นที่.
5.20.3 ทำน้ำบริสุทธิ์ 100 μl /ดีของ 2 x ความเข้มข้น, Antigen for / mitogen แต่ละอย่างเคร่งครัดพร้อมด้วยแผนผังแผ่นที่จัดให้บริการ สำหรับน้ำบ่อการควบคุมทำน้ำบริสุทธิ์ 100 μl ของ rpmi 10% (ดูที่หมายเหตุในหัวข้อที่ 5โปรโตคอลโดยละเอียดหาก rpmi 20% เป็นที่ต้องการ)..
5.21 . การเตรียมการของ[ 3 H ] tdr :
5.21.1 . การทำสมาธิขั้นสุดท้ายของ[ 3 H ] tdr ควรเป็น 1 μci /รวมถึง คำนวณปริมาณการเจือจาง[ 3 H ] tdr จำเป็นต้องทำน้ำบริสุทธิ์ 25 μl / Frozen เป็นอย่างดี 1 μci /ได้ดี(หมายเลขของระดับเสียงสอบบ่อ x 25 μl /ดี=ต่ำสุดในการเตรียม) ตัวอย่างเช่น[ 3 ] h tdr หุ้นอยู่ที่ 1 MCI / ml .โซลูชันการทำงานที่เป็นหนึ่งใน 40 มล. μci /ใน rpmi - 0 (หรือ D - PBS )ควรจะมีการเตรียมตัว เจือจาง[ 3 H ]หุ้น tdr ที่ 1 : 25 ด้วย rpmi - 0 ( 0.5 มล.ของมีเดียหุ้น 12 มล.) โรงแรมแห่งนี้คือพอไปที่ PULSE 500 บ่อ เพิ่ม 25 μl /เป็นอย่างดีในการทำให้การทำสมาธิขั้นสุดท้ายของ 1.0 μci /รวมถึง เจือจาง[ 3 ชั่วโมง] tdr ที่สามารถจัดเก็บที่ C 4 ° C สำหรับเดือน.
5.22 A การเตรียมการของ pbmcs
5.22.1 .โปรโตคอลการตรวจสอบความสอดคล้องต้องกันได้สำหรับการเตรียมการของ pbmcs พบได้ในวิชาว่าด้วยไวรัสคู่มือสำหรับผู้ติดเชื้อเอชไอวี Laboratories "การเตรียมการของเซลล์ mononuclear เลือดบริจาคอุปกรณ์ต่อพ่วง uninfected ผา - กระตุ้น"บนเว็บที่ http://www.niaid.nih.gov/daids/vir_manual/.
5.22.2. หากท่อดูดฝุ่นคอลเลคชั่นเลือดที่ได้รับการปั่นในการขอรับส่วนที่พลาสมา-0 ระดับเสียงเท่ากับต้นฉบับที่ D - PBS rpmi ของพลาสมาหรือจะต้องมีการเพิ่มเข้ากับท่อดูด ฆ่าเชื้อขวดนมและเพิ่ม D - PBS หรือ rpmi -0 เท่ากับระดับเสียงของเลือดทำให้ระดับเสียงที่เป็น 2 X ระดับเดิม.
5.22.3 โอเวอร์เลย์เจือจางเลือดบน ficoll - hypaque .
5.22.4 centrifuge ที่ 300-400 300-400 300-400 X กรัมสำหรับ 30 นาทีใน centrifuge อุณหภูมิ ห้อง( 20 °ถึง 25 ° C ) ตรวจดูให้แน่ใจว่าเบรก centrifuge ปิดอยู่.
5.22.5การเก็บเกี่ยว pbmc จากอินเตอร์เฟซและล้างทำความสะอาดสองหรือสามครั้งใน D - PBS หรือ rpmi -0 centrifuging ที่ 200 x g สำหรับ 12 นาทีที่ อุณหภูมิ ห้อง ช่วยลดเวลาการหน่วงเวลาระหว่างชะล้างเศษขน หลังจากล้างทำความสะอาด